KR20070076532A - 각막이영양증 진단용 dna 칩 - Google Patents

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KR20070076532A
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Abstract

본 발명은 각막이영양증 진단용 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 안과의 시력교정 수술 전에 정확하게 진단되어야 할 아벨리노증을 포함하는 각막이영양증을 진단하기 위한 BIGH3 유전자 돌연변이 검출용 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 각막이영양증 진단용 DNA 칩에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 기존의 현미경으로만 진단되었던 각막이영양증을 유전적으로 정확하게 진단할 수 있어, 각막이영양증 환자가 오진에 의하여 시력교정수술을 시술받아 실명하는 것을 방지할 수 있다.
각막이영양증, 아벨리노, BIGH3, 올리고뉴클레오티드

Description

각막이영양증 진단용 DNA 칩{DNA Chip for Diagnosis of Corneal Dystrophy}
도 1은 스폿팅 용액에 따른 DNA 칩의 검출효율을 측정하기 위한 DNA 칩의 스폿을 나타낸 것이다.
도 2는 정상인의 경우, 도 1의 DNA 칩에 액손 4 영역의 증폭 산물을 적용한 혼성화 반응결과를 나타낸 것이다.
도 3은 헤테로 아벨리노증의 경우, 도 1의 DNA 칩에 액손 4 영역의 증폭 산물을 적용한 혼성화 반응결과를 나타낸 것이다.
도 4는 호모 아벨리노증의 경우, 도 1의 DNA 칩에 액손 4 영역의 증폭 산물을 적용한 혼성화 반응결과를 나타낸 것이다.
도 5는 헤테로 레이스-버클러 CD1의 경우, 도 1의 DNA 칩에 액손 4 영역의 증폭 산물을 적용한 혼성화 반응결과를 나타낸 것이다.
도 6은 프로브 농도별로 디자인된 DNA 칩의 스폿 배열을 나타낸 것이다.
도 7은 도 6의 DNA 칩을 사용하였을 때, 환자에 따라 예상되는 혼성화 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 도 6의 DNA칩을 사용하였을 때의, 프라이머 세트의 혼성화 시간에 따 른 혼성화 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 프로브의 길이에 따른 DNA칩의 혼성화 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 프로브 길이에 따른 DNA 칩의 혼성화 효율을 알아보기 위한 DNA칩의 스폿배열을 나타낸 것이다.
도 11은 프로브의 길이에 따른 DNA칩의 혼성화 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 각각 15mer의 프로브를 50 μM의 농도로 3xSSC 스폿팅 용액을 사용하여 제조한 DNA칩의 스폿배열을 나타낸 것이다.
도 13은 도 12의 DNA칩을 사용한 혼성화 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 각막이영양증 진단용 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 안과의 시력교정 수술 전에 정확하게 진단되어야 할 아벨리노증을 포함하는 각막이영양증을 진단하기 위한 BIGH3 유전자 돌연변이 검출용 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 각막이영양증 진단용 DNA 칩에 관한 것이다.
각막이영양증(corneal dystrophy)은 각막 중심에 혼탁이 발생하여 나이가 듦에 따라 점차 혼탁이 많아져서 시력이 감소하는 상염색체 우성 유전질환으로, 아벨 리노각막이영양증(Avellino corneal dystrophy), 과립형각막이영양증(Granular corneal dystrophy), 라티스 타입 I 각막이영양증(lattice type I corneal dystrophy) 및 레이스버클러스 I 각막이영양증(Reis-bucklers corneal dystrophy) 등이 있으며, βIG-H3 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이에 의하여 발생한다.
이 중 아벨리노각막이영양증 환자는 연령이 증가함에 따라 이형접합체(heterozygote)는 시력의 상당한 손실을 보이고, 동형접합체(homozygote)의 경우에는 6세부터 실명한다.  아벨리노각막이영양증은 기존에 과립형 각막이영양증으로 통칭되었던 질환이나 유전자 차이가 발견되어 1988년 분리되어 새로이 명명된 질환으로, 전세계적으로 가장 흔한 각막 이영양증으로 알려져 있으며 유전자 검사결과 국내에 1/340~1/1,000 사이의 유병율(heterozygote의 경우)로 상당히 흔한 질환이다 (Holland, E.J. et al., Ophthalmology , 99:1564, 1992; Kennedy, S.M. et al., Br . J. Ophthalmol ., 80:489, 1996; Dolmetsch, A.M. et al., Can . J. Ophthalmol ., 31:29, 1996; Afshari, N.A. et al., Arch . Ophthalmol., 119:16, 2001; Stewart, H.S. Hum . Mutat ., 14:126, 1999).
본 발명자들은 이형접합체의 아벨리노각막이영양증 환자가 라식수술을 받으면 약 2년 후부터 각막 혼탁이 급격히 증가하여 실명한다는 것을 발견하였다 (Jun, RM et al., Ophthalmolgy , 111:463, 2004). 이 전에는 라식 또는 엑시머 레이저 수술이 각막이영양증 환자의 혼탁을 없앨 것이라는 예측 하에 많은 시술이 이루어 졌으며, 국내 그간 시술된 라식수술은 약 30만건으로 추정되는 바, 국내의 아벨리노각막이영양증의 이형접합자의 빈도를 최소한 계산치인 1/1,000로 보더라도 300명이 시력을 상실하고 있다는 추측을 할 수 있다.  라식수술을 받은 환자는 주로 20-30대의 생산적인 활동을 하는 인구로서 이들의 실명은 사회적, 경제적으로 심각한 문제로 판단된다.
또한, 2000년 이후 라식수술의 시술허가가 공표된 미국의 경우 흑인들에서도 아벨리노각막이영양증 환자의 라식수술에 의한 실명이 발견되기 시작하였으며, 전세계적으로 많은 환자가 시술 받은 후 병이 진행되고 있음을 추측할 수 있다.
따라서, 라식수술의 시술 전에 아벨리노각막이영양증 환자에 대한 정확한 진단을 수행하여, 라식수술에 의한 증상 진행을 방지하여야 하나, 기존의 안과에서는 안과의사가 현미경으로 안구 혼탁을 검사하는 것만으로 아벨리노각막이영양증을 진단하고 있어, 증상이 진행되지 않은 환자의 경우는 발견하지 못하고, 라식수술을 시행하여 실명으로 발전하는 경우도 종종 발생하고 있으며, 정확하고 신속한 각막이영양증의 진단방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 각막이영양증의 원인이 되는 BIGH3 유전자의 돌연변이를 정확하고 신속하게 진단할 수 있는 DNA 칩을 개발하고자 예의 노력한 결과, BIGH3 유전자의 특정 돌연변이 부위를 함유하는 프로브를 제작하고, 이를 고정한 DNA 칩을 이용하여 각막이영양증을 효율적으로 진단할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국 본 발명의 목적은 각막이영양증의 원인이 되는 BIGH3 유전자의 특정 돌연변이 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 각막이영양증 진단용 DNA 칩을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 50, 서열번호 53 및 서열번호 59로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 필수적으로 함유하는 각막이영양증 진단용 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 50의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 서열번호 53의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 59의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 서열번호 35의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 65의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이는 13~17bp인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 각막이영양증 진단용 DNA 칩을 제공한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47 및 서열번호 56으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드가 추가로 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 47의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 서열번호 56의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 서열번호 34의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 62의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 16 내지 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 56 및 서열번호 59로 구성된 그룹의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드들이 모두 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 11 내지 서열번호 15, 서열번호 62 및 서열번호 65로 구성된 그룹의 올리고뉴클레오티드들이 모두 고정되어 있는 각막이영양증 진단 용 DNA칩을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 군에서 선택되는 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
본 발명에서는 안과 질환 중 각막혼탁을 일으키는 각막이영양증이 BIGH3 유전자의 돌연변이에 의한 것임에 착안하여, 아벨리노 각막이영양증, 라티스 각막이영양증, 과립형 각막이영양증, 레이스버클러스 각막이영양증 등의 여러 각막이영양증 환자에 나타나는 BIGH3 유전자의 점돌연변이 부위를 중심으로 하여 각각의 각막이영양증을 진단할 수 있는 프로브를 제작하였다.
본 발명에서 제작된 프로브는 서열번호 11 내지 서열번호 67의 염기서열을 갖는 프로브이다.
상기 프로브를 이용하여 각막이영양증을 효과적으로 선별할 수 있는 DNA 칩을 제작하기 위하여, 최적 스폿팅 용액, 최적 고정화 시간, 최적 프로브 길이 등을 검색하였다. 그 결과, 스폿팅 용액으로는 3xSSC용액이 가장 적합하였으며, 고정화 시간은 6시간에서 가장 좋은 결과를 얻을 수 있었으며, 엑손 4 변이에 의한 각막이영양증의 경우는 15mer 길이의 프로브를 사용하였을 때 가장 좋은 결과를 얻을 수 있었으며, 엑손 12 변이에 의한 각막이영양증의 경우는 17mer 길이의 프로브를 사용 하였을 때 가장 좋은 결과를 얻을 수 있었다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어 및 표현을 설명한다.
"분리된" 핵산 분자는 핵산의 천연원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 예를 들면, 게놈 DNA와 관련하여, 용어 "분리된"은 게놈 DNA가 천연적으로 결합하고 있는 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다.
"프로브" 또는 "핵산 프로브"은 검출하고자 하는 표적 염기 서열과 충분히 상보적이어서 혼성화하는 염기 서열을 갖는 단일 가닥에 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 가리킨다.
"조성물"은 원핵 혹은 진핵생물유래의 유전자 정보에 상보적인 프로브가 순수한 상태이거나 다른 프로브와 배합되어 있을 수 있음을 의미한다. 또한, 프로브는 염 또는 완충제와 배합되어 건조된 상태, 침전물로서 알코올 용액 또는 수용액의 상태로 있을 수 있다.
"표적"은 본 발명에 따른 프로브 중 어느 것과도 상보적인 서열을 갖는 생물학적 시료 유래의 핵산 분자를 의미한다. 표적 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA (임의로 증폭 후 수득함)이거나 RNA일 수 있으며 적어도 한 개의 프로브 올리고뉴클레오타이드와 적어도 부분적인 상보성을 갖는 서열을 함유한다.
"생물학적 시료"는 목적하는 표적 서열을 검출하고자 하는 임상 시료 (예, 농즙, 타액, 혈액, 뇨 등), 환경 시료, 세균 콜로니, 오염된 또는 순수한 배양물, 정제된 핵산 등의 검체 (specimen)를 가리킨다.
"올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 고분자를 의미한다. 그러나, 뉴클레오타이드의 길이는 100개 이상이거나 10개 이하일 수 있다.
"뉴클레오타이드"는 포스페이트 그룹, 5-탄당 및 질소 염기로 구성된 핵산의 기본 단위이다. RNA에서 5-탄당은 리보스이다. DNA에서 5-탄당은 2-데옥시리보스이다. 5-뉴클레오타이드의 경우, 당은 5-탄당-2에서 하이드록실그룹(-OH)을 함유한다. 이 용어는 또한 리보스의 2 위치에 메톡시 그룹과 같이 상기 기본 단위의 유사체를 포함한다.
"상동성"은 동일성과 동의어로서, 예를 들면 90% 상동성이라고 하는 폴리핵산은 서열의 배열시 동일한 위치에서 90%의 동일한 염기쌍을 나타내는 것을 의미한다.
"혼성화"는 표적 핵산(검출하고자 하는 서열)에 상보 서열의 교잡(annealing)을 의미한다. 상보 서열을 포함한 두 핵산 고분자가 서로를 발견하고 염기 쌍 상호작용을 통해 교잡하는 능력은 잘 알려진 현상이다.
"프라이머"는 복제하고자 하는 핵산 가닥에 상보적인 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드 서열을 가리킨다. 프라이머의 길이 및 서열은 이들이 연장 산물의 합성을 개시할 수 있을 정도이면 되는데 바람직하게는 약 5 내지 50개의 뉴클레오타이드로 구성된다. 특정한 길이 및 서열은 목적하는 DNA 또는 RNA 표적의 복잡성뿐만 아니라 온도 및 이온강도와 같은 프라이머 사용의 조건에 의해 결정될 것이다.
"표지"는 검출가능한 (바람직하게는 정량가능한) 시그날을 제공하고 핵산에 결합될 수 있는 모든 원자 또는 분자를 가리킨다. 표지는 형광, 방사성, 색도, X-선 회절 또는 흡수, 마그네티즘 등에 의해 검출가능한 시그날을 제공할 수 있다.
"하이브리드"는 상보적인 염기사이의 왓슨-크릭 염기 쌍 또는 비표준 염기 쌍에 의해 두개의 단일가닥 핵산 서열사이에 형성된 복합체이다.
"프로브 특이성"은 표적과 비표적 서열을 구분하는 능력을 기술하기 위한 프로브의 특징을 가리킨다. 이와 관련하여, 프로브가 특이적라는 것은 뉴클레오타이드 서열이 정해진 표적 서열과 혼성화하고 비표적 서열과는 실질적으로 하이브리드하지 않거나 비표적 서열과의 혼성화가 최소로 이루어진다는 것을 의미한다. 프로브 특이성은 서열 및 검정 조건에 의해 좌우된다.
"표준균주"는 시판중에 있거나 용이하게 입수가능한 균주를 가리킨다.
프로브의 동정
각종 원핵 혹은 진핵 혹은 그 유래의 유전자 정보의 검출용 핵산 프로브를 제작하기 위해서는 각 검출하고자 하는 표적자에만 특이성을 가져야 하는데 이를 위하여 먼저 각 표적 유전자 혹은 생물체에 대한 특이 프로브 후보군을 선정한다.
프로브 후보군은 표적자가 위치하고 있는 유전자의 부위 내에서 결정한다. 프로브 후보군의 특이성 여부는 먼저 BLAST 검색을 통해 각 염기서열 간 유사성을 비교하여 확인하고 실제로 혼성화 반응에 균주들을 적용하여 각 표적 유전자에서만 반응하는 프로브를 후보군 내에서 동정용으로 선별한다.
추가로, 상기와 같이 선별된 동정용 핵산 프로브는 여러 생물학적 시료를 대상으로 하는 임상 시험에 적응하여 민감성을 확인한다.
본 발명에 따라 선별된 핵산 프로브는 11~17mer의 올리고뉴클레오타이드이며, 바람직하게는 검출하고자 하는 표적의 완전한 상보서열과 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는다. 본 발명에 따른 각 균의 검출 및 동정용 핵산 프로브의 올리고뉴클레오타이드의 길이는 50개 또는 그 이상도 가능하다. 본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 및 이노신 또는 변형 그룹을 함유한 뉴클레오타이드와 같은 변형된 뉴클레오타이드도 가능하나, 이들은 혼성화 특징에 반드시 영향을 미치지 않아야 한다.
프로브 이용
본 발명의 핵산 프로브는 진단 목적상 생물학적 시료중에서 표적 핵산의 유무를 시험하는데 있어서 공지된 모든 혼성화 기술, 예를 들면 도트-블롯이라고 하는 필터상에의 포인트 침착 기술(Manitais et al., Molecular Cloning , Cold Spring Harbor, 1982), 써던블롯 또는 노썬 블롯에 따라 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 프로브는 핵산 프로브-기본 검정의 특이성을 높여주는 샌드위치 혼성화 시스템에 사용할 수 있다. 핵산 프로브-기본 검정에서 샌드위치 혼성화의 원리 및 사용은 공지되어 있다 (Dunn and Hassel, Cell, 12:23, 1977; 및 Rnaki et al., Gene, 21:77, 1983). 샌드위치 혼성화 기술은 포획 프로브 및/또는 검출 프로브가 사용되며 이들 프로브는 표적 핵산의 상이한 두 영역과 혼성화할 수 있고 그들 중 적어도 하나 (일반적으로 검출 프로브)가 목적하는 균에 대해 특이적인 표적의 영역과 혼성화할 수 있다. 포획 프로브와 검출 프로브는 적어도 부분적으로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가져야 한다.
직접적인 혼성화 검정이 유리한 역학을 제시하지만, 샌드위치 혼성화는 시그날-대-노이즈 비율이 높다는 점에서 유리하다. 또한, 샌드위치 혼성화는 핵산 프로브-기본 검정의 특이성을 높일 수 있다. 샌드위치 혼성화 과정의 주요 단계를 구성하는 배양 및 후속 세척 단계는 각각 항온, 약 20 내지 65℃에서 실시한다. 핵산 하이브리드는 혼성화된 염기의 수에 의해 좌우되고 (온도는 하이브리드의 크기에 비례하여 증가한다) 또한 혼성화된 염기의 성질 및 각각의 혼성화된 염기의 경우 인접한 염기의 성질에 의해 좌우되는 해리 온도를 갖는 것으로 알려져 있다. 샌드위치 혼성화 기술에서 사용되는 혼성화 온도는 주어진 프로브와 상보적인 서열의 표적사이에 형성된 하이브리드의 반-해리 온도 이하에서 선택되어야 한다. 이러한 반-해리 온도는 간단한 통상의 실험에 의해 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 프로브는 경쟁 혼성화 프로토콜에 사용할 수 있다. 경쟁 혼성화에서, 표적 분자는 특정 프로브와 이의 상보체 사이에서의 하이브리드 형성과 경쟁한다. 표적이 더 많이 존재할수록 프로브와 이의 상보체사이에 형성된 하이브리드의 양은 줄어든다. 특정 표적이 존재함을 지시하는 양성 시그날은 표적이 첨가되지 않은 시스템과 비교하여 혼성화 반응이 감소하는 것으로 나타난다. 특정 양태로서, 편리하게는 표지되는 특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브를 표적 분자와 혼성화한다. 이어서, 혼합물을 특이적 프로브와 상보적인 올리고뉴클레오타이드 가 고정된 미세역가 디쉬 웰에 넣고 계속 혼성화 반응이 일어나도록 한다. 세척 후 상보적인 올리고뉴클레오타이드와 프로브사이의 하이브리드를 바람직하게는 사용된 표지에 따라 정량한다.
또한, 본 발명의 핵산 프로브는 역혼성화(reversed hybridization) (Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 86:6230, 1989)에 사용할 수 있다. 이 경우는 우선 표적 서열을 5 바이오티닐화 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 효소적으로 증폭할 수 있다. 두 번째 단계로 증폭된 산물은 고체 지지체상에 고정된 특정 올리고뉴클레오타이드와의 혼성시켜 검출한다. 역혼성화는 증폭하지 않고서 실시할 수 있다. 이러한 경우는 생물학적 시료에 존재하는 핵산은 혼성화이전에 화학적으로나 특정 염료을 첨가하여 특이적으로 또는 비특이적으로 표지 또는 변형시켜야 한다.
본 발명의 핵산 프로브는 상기 본 발명에서 목적하는 표적유전자의 존재 여부를 신속히 결정하는데 사용할 수 있는 키트에 포함될 수 있다. 키트는 표적유전자의 존재를 검정하는데 필요한 모든 구성요소를 포함한다. 통상의 개념으로, 키트는 표지된 프로브의 안정한 제제, 표적과 프로브 핵산의 혼성화를 유도하기 위한 무수 또는 액체 형태의 혼성화액, 원치않거나 혼성화되지 않은 핵산을 세척하여 제거하기 위한 용액, 표지된 하이브리드를 검출하기 위한 기질 및 임의로 표지를 검출하기 위한 기기를 포함한다.
본 발명의 한 가지 특정 양태는 샌드위치 검정의 개념을 이용하는 키트를 포함한다. 이 키트는 환자의 특정 부위에서 검체를 수집하기 위한 제1 요소, 예를들면 검체의 스크랩핑 도구 또는 페이터 포인트, 수용 바이알, 분산 및 용해 완충액 이 포함된다. 제2 요소는 표적과 프로브 핵산사이의 혼성화를 위한 무수 또는 액체 상태의 매질 및 혼성화되지 않고 원하지 않는 형태를 세척하여 제거하기 위한 매질을 포함한다. 제3 요소는 표적 핵산의 일부에 상보적인 비표지된 핵산 프로브가 고정되어 있거나 결합되어 있는 고체 지지체를 포함한다. 다수의 표적을 분석하는 경우는 개개 자신의 rRNA에 대해 특이적인 한종 이상의 포획 프로브가 딥스틱의 다른 개별 영역에 적용된다.
제4 요소는 제3 요소의 고정되고 비표지된 핵산 프로브가 혼성화되는 동일한 rRNA 본쇄의 제2의 다른 영역에 상보적인 표지된 프로브를 함유한다. 여기서, 핵산 프로브는 동결건조된 핵산과 같은 무수 형태 또는 알코올 침전된 핵산과 같은 침전형태 또는 완충액으로서 프로브의 배합물을 포함한다. 표지된 알려진 어떠한 표지도 가능할 수 있다.
예를 들면, 프로브는 통상적인 수단에 의해 바이오티닐화할 수 있으며 바이오티닐화된 프로브의 존재는 고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소에 결합된 아비딘을 첨가한 다음, 퍼옥시다제와 반응했을 때 시각적으로 모니터링하거나 색도계 또는 분광계를 이용한 장비로 모니터링할 수 있는 기질과 접촉시켜 검출할 수 있다. 이러한 표지 방법 및 기타 효소 형태의 표지는 방사능 표지방법과 비교하여 경제적이고, 고도로 민감하며, 비교적 안전하다는 이점을 갖는다. 검정 키트의 완성품에는 표지된 프로브의 검출을 위한 여러 시약 및 기타 키트에 포함되는 것들, 예를 들면 지침서, 양성 및 음성 대조군 및 여러 성분을 혼합 반응시키기 위한 용기 등이 포함된다.
DNA
또한, 본 발명의 핵산 프로브는 유전자 칩으로 사용된다. 본 발명의 바람직한 양태는 본 발명의 핵산 프로브가 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다. DNA 칩은 작은 기판상에 여러 염기서열의 단편이 고밀도로 집적된 것으로 기판에 고정된 DNA와 이에 상보적인 미지의 DNA 시료사이의 혼성화에 의해 미지 시료의 DNA를 검출하는데 사용한다. 프로브를 고정시킬 기판은 유리, 실리콘 등과 같은 무기질이나 또는 아크릴계, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephtalate, PET), 폴리스틸렌(polystylene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리프로필렌 (polypropylene) 등과 같은 고분자 물질로 이루어지고, 기판의 표면은 편평하거나 다수개의 구멍(hole)이 있는 것을 사용할 수 있다.
프로브의 고정은 5' 또는 3' 중 어느 한 위치가 기판에 공유결합으로 고정된다. 고정화 방법은 통상의 기술로서 예를 들면 정전기적 힘을 이용하거나, 합성된 올리고상에 아민기를 붙여 알데하이드 코팅된 슬라이드에 붙여 이 둘간의 결합을 유도하거나, 아민기 코팅된 슬라이드상에 혹은 L-라이신이 코팅된 슬라이드상에 혹은 니트로셀룰로즈 막이 코팅된 슬라이드 상에 집적함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명의 한 양태로서, 프로브를 합성할 때 3' 위치에 아민기를 가진 염기를 삽입하여 알데하이드 잔기로 코팅된 유리판에 공유결합 되도록 한다.
기판 표면에 각기 다른 프로브들을 고정, 배열하는 것은 핀 마이크로어레이, 잉크젯, 포토리소그래피, 전기적 어레이 등의 방법을 사용한다. 본 발명의 한 양태 로는 프로브를 완충용액에 용해시킨 상태로 공지방법에 따라 제작된 마이크로어레이어(microarrayer)를 이용하여(Yoon et al, J. Microbiol . Biotechnol., 10:21, 2000) 집적한다.
마이크로어레이어의 원리는 미세하게 제작된 핀이 DNA를 플레이트로부터 담아서 기판으로 컴퓨터가 지정한 똑같은 장소에 옮기는 것이다. 마이크로어레이어에 의해 옮겨진 프로브의 고정을 위해 45% 내지 65% 정도, 바람직하게는 50% 내지 55% 정도의 습도가 유지되는 조건에서 프로브의 3' 위치의 아민기와 유리판에 코팅되어 있는 알데히드기 사이의 반응이 원활이 이루어지도록 하기 위해 1시간 이상 반응을 유도하고, 6시간 이상 방치하여 DNA 프로브를 고정시킨다.
생존 유기체로부터 유래된 세포 또는 유기체 자체를 검출하기 위해 필요한 경우 이들 세포를 화학적 및/또는 물리적 방법으로 부분적으로 또는 완전히 용해시켜 그들 세포의 RNA 및/또는 DNA에 접근이 용이하게 만들고 본 발명의 프로브와 접촉시킨다. 접촉은 액체 매질 또는 용액중에서 니트로셀룰로즈, 셀룰로즈 또는 나일론 필터와 같은 적절한 지지체상에서 수행할 수 있다. 이러한 접촉은 최적 조건, 하위 최적 조건 또는 제한 조건하에서 일으킬 수 있다, 이러한 조건은 온도, 반응물 농도, 핵산의 염기쌍 최적 온도를 낮추는 물질 (예, 포름아미드, 디메틸설폭사이드 및 우레아)의 존재 및 반응 부피를 저감시키고/시키거나 하이브리드 형성을 가속하는 물질 (예, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌글리콜 또는 페놀)의 존재를 포함한다.
프로브 제작
핵산 프로브는 통상의 클로닝 방법(Maniatis, T., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982)을 이용하여 목적하는 서열을 클로닝하거나 시판되는 DNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성하여 다량으로 얻을 수 있다.
본 발명의 프로브는 통상적인 방법에 따라 일본쇄 또는 이본쇄로 제작할 수 있다. 일본쇄의 프로브를 얻는 방법으로서 가장 대표적인 예는 자동화학합성기에서 DMT(dimethoxytrityl) 오프 (off) 방식에 의해 합성하여 탈보호 반응을 시행한 후, 원하는 수의 염기로 이루어진 프로브를 합성하는 것이다.
이렇게 제작된 프로브는 합성시 한 쪽 가닥 말단에 FITC(fluorescein isothiocyanate)와 같은 형광물질을 부착하여 특정 핵산의 존재유무를 확인할 수 있다. 다른 방식으로는 일본쇄의 DNA를 주형으로 하여 그와 상보적인 염기서열을 가지는 프로브를 만드는 방법으로, 주형의 DNA에 프라이머를 교잡시키고, 그 프라이머로부터 클레노우(Klenow) 효소와 형광물질이 부착된 염기(dNTP)를 사용하여 프로브를 합성하게 된다. 이는 DNA 내부에 형광물질이 부착하게 되므로, 높은 민감도 및 특이성을 갖는 프로브를 합성할 수 있다.
이중가닥의 프로브를 얻는 방법으로서, 게놈 DNA 혹은 플라스미드 DNA를 특정 제한효소로 절단하여 원하는 부분의 유전자 혹은 염기부분을 포함한 프로브를 얻을 수 있다. 랜덤 프라이밍(random priming) 방법은 6개의 랜덤 핵사머(random hexamer)와 주형 DNA를 혼성화시킨 후, 형광물질이 부착되어 있는 다양한 길이의 프로브를 합성하는 방법이고, 또 다른 방식으로는 DNA의 5'말단에 32P를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(polynucleotide kinase)를 이용하여 옮겨서 형광물질이 부착된 프로브를 합성할 수도 있으며, DNA 분해효소(DNase) I을 이용하여 이본쇄의 DNA에 절단부분을 만든 후, 이 DNA를 주형으로 하여 DNA 중합효소 I과 형광물질이 부착된 염기(dNTP)를 사용하여 프로브를 합성할 수 있다. 이렇게 이중가닥으로 합성된 프로브는 변성(denaturation)과정을 거쳐 일본쇄로 만든 후 혼성화 반응에 사용된다.
본 발명의 프로브는 유리하게는 표지될 수 있다. 어떠한 통상의 표지도 사용할 수 있다. 프로브는 32P, 35S, 125I, 3H 및 14C와 같은 방사성 동위원소를 사용하여 표지할 수 있다. 방사성 표지는 3 또는 5 위치를 방사성 표지된 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 키나제, 말단 트랜스퍼라제 또는 리가제를 사용하여 말단 표지하는 것과 같은 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다.
방사성 표지의 다른 방법은 본 발명의 프로브를 화학적으로 요도드화하는 것이며 이러한 요오드화에 의해 프로브상에 수개의 125I 원자가 결합하게 된다. 이와 같이 본 발명의 프로브중 하나가 방사성으로 표지되면 일반적으로 자가방사기록, 액체 신틸레이션, 감마 계수 또는 다른 통상의 방법을 사용하여 방사선을 검출한다.
또한, 본 발명의 프로브는 면역 특성을 갖는 잔기(예, 항원 또는 합텐), 일부 시약에 대해 특이적 친화성을 갖는 잔기(예, 리간드), 검출가능한 효소 반응을 제공한 잔기(예, 효소, 보조효소, 효소 기질 또는 효소 반응에 참여하는 기질) 또는 어떤 파장에서 형광, 발광 또는 흡광의 물리적 특성을 제공하는 잔기과 결합하여 비방사성 표지될 수 있다. 또한, 프로브와 표적에 의해 형성된 하이브리드를 특이적으로 검출하는 항체를 사용할 수 있다. 비방사성 표지는 본 발명의 프로브를 화학적으로 합성할 때 제공할 수 있다. 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘 및 우라실 잔기는 다른 화학 잔기와 쉽게 결합하며 이에 프로브 또는 프로브와 상보적인 DNA 또는 RNA 단편사이에 형성된 하이브리드의 검출을 가능케 한다.
표적
생물학적 시료에서 질병을 진단하는데 사용하기 위한 핵산 기질을 제공하기 위해 시료로부터 핵산을 추출한다. 핵산은 표준 기술 또는 시판되고 있는 키트를 사용하여 다양한 시료로부터 추출할 수 있다. 예를 들면, 조직 시료로부터 RNA 또는 DNA를 분리하는데 사용하는 키트는 Qiagen, Inc.(미국) 및 Stratagene (미국)에서 구입할 수 있다. QIAAMP 블러드 키트는 혈액뿐만 아니라 골수, 체액 또는 세포 현탁액으로부터 DNA의 분리를 가능케 한다. QIAAMP 조직 키트는 근육 및 기관으로부터 DNA의 분리를 가능케 한다.
표적 핵산이 이본쇄인 경우에는 검출 과정을 이행하기 이전에 변성을 실시하는 것이 바람직하다. 이본쇄 핵산의 변성은 화학적, 물리적 또는 효소적 변성의 공지 방법, 특히 적절한 온도, 80℃ 이상의 온도로 가열함으로써 수행할 수 있다.
또한, 프로브와 혼성화 반응을 하는 표적 DNA는 보통 두 종류의 방법으로 준비될 수 있다. 첫째는, 서던 블럿 또는 노던 블럿시 사용되는 방법으로, 게놈 DNA 혹은 플라스미드 DNA를 적당한 제한효소로 자른 후 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동을 하여 크기별로 DNA 조각을 분리하여 사용한다. 둘째는, PCR 방법을 이용하여 원하는 부분의 DNA를 증폭시켜 사용하는 방법이다.
이때, 사용하는 PCR 방법을 살펴보면, 전방향과 역방향의 프라이머 쌍을 동일한 양을 사용해서 증폭시키는 가장 보편화되어 있는 PCR과 전방향과 역방향의 프라이머 쌍을 비대칭적으로 첨가시켜서 2중 가닥과 단일 가닥의 밴드를 동시에 얻을 수 있는 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR), 여러 가지의 프라이머 쌍을 넣어서 한꺼번에 증폭시킬 수 있는 다중 증폭 방법(Multiplex PCR), 특이적인 4개의 프라이머와 리가아제(Ligase)를 이용해 증폭한 후 효소면역법으로 형광량을 판정하는 리가아제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction; LCR)방법, 이 밖에도 핫스타트 PCR, 네스트 PCR, 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머 PCR, 역전사 효소 PCR, 반-정량적(Semi-quantitative) 역전사 효소 PCR, 실시간 PCR(Real time PCR), SACE(Rapid Amplification of cDNA Ends), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 연쇄반복(short tandem repeats; STR), 단일가닥입체다형화(Single Strand Conformation Polymorphism; SSCP), 동소 PCR, DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcriptase PCR) 등의 방법 등이 있다.
본 발명의 바람직한 양태는 분리된 검체의 DNA를 주형으로 하고 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)을 수행하여 단편 유전자를 제작한다. 단편 유전자는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 첨가비율을 1:5로 차별화함으로써 한번의 중합효소연쇄반응으로 획득한다.
본 발명의 바람직한 양태로서 PCR 반응은 10x PCR 완충액(100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2) 5ul, dNTP 혼합물(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 각각 2.5mM) 4ul, 10pmole 전방향 프라이머 0.5ul, 10pmole 역방항 프라이머 2.5ul, 1/10로 희석한 주형DNA(100ng) 1ul, Taq 폴리머라제(5unit/ul, Takara Shuzo Co., Shiga, Japan) 0.5ul를 첨가후 총 부피가 50ul가 되도록 물을 첨가한다. 첫 번째 변성은 94℃에서 7분간, 두 번째 변성은 94℃에서 1분간 수행한다. 교잡(annealing)은 52℃에서 1분, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하며, 이를 10회 반복한다. 그 후, 다시 세 번째 변성은 94℃에서 1분, 교잡은 54℃에서 1분, 연장은 72℃에서 1분간 수행하며, 이를 30회 반복한다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행한다. PCR 반응결과로 생성된 산물은 아가로스 겔 전기영동법(agarose gel electrophoresis)으로 확인한다.
혼성화 및 세척
혼성화 기술은 본 발명에서 특정적인 것이 아니다. 이 기술은 일반적으로 문헌(Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Ed. Hames, B. D. and Higgins, S.J., IRL Press, 1987; Gall and Pardue, Proc . Natl . Acad . Sci ., U.S.A., 63:378, 1969, John, Burnsteil and Jones, Nature, 223:582, 1969)에 기술되어 있다.
혼성화 조건은 긴축(stringency), 즉 작용 조건의 엄격함에 의해 결정된다. 혼성화가 이루어지는 긴축이 고도하면 할수록 혼성화는 더욱 특이적이 된다. 긴축 은 특히 프로브/표적 결합체의 염기 조성뿐만 아니라 두 핵산사이의 부정합 정도의 함수이다. 긴축은 또한 혼성화 용액에 존재하는 이온의 농도 및 종류, 변성제의 성질 및 농도 및/또는 혼성화 온도와 같은 혼성화 반응 변수의 함수일 수 있다. 혼성화 반응이 수행되어야 하는 조건의 기축은 특히 사용된 프로브에 의존한다. 모든 이들 데이터는 잘 알려져 있으며 적절한 조건은 개개의 경우에 통상의 실험에 의해 결정할 수 있다. 일반적으로, 사용된 프로브의 길이에 따라 혼성화 반응의 온도는 약 0.8 내지 1 M 농도의 염수 용액중에서 약 20℃ 내지 65℃, 특히 35℃ 내지 65℃이다.
표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브와 표적 핵산사이의 혼성화는 Hogan 등의 미국특허 제5,030,557호에 기술된 절차에 따라 비표지된 헬퍼올리고뉴클레오타이드를 사용하여 증가시킬 수 있다. 헬퍼올리고뉴클레오타이드는 프로브에 의해 결합되는 영역외의 다른 표적 핵산의 영역과 결합한다. 이 결합은 일본쇄 핵산의 표적 영역에 새로운 이차 및 삼차 구조를 취해서 프로브의 결합 속도를 가속화한다.
당업자는 프로브와 표적사이에 형성된 하이브리드의 열 안정성에 영향을 미치는 인자들 또한 프로브 특이성에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 프로브와 표적의 하이브리드의 융점 온도를 포함하여 융점 프로필이 각각의 프로브와 표적의 하이브리드에 대해 경험적으로 결정되어야 한다. 이러한 결정은 Arnold 등의 미국특허 제5,283,174호에 기술된 방법에 따라 수행할 수 있다.
프로브와 표적의 하이브리드의 융점 온도를 결정하는 한 가지 방법은 혼성화 보호 검정을 수행하는 것으로 포함한다. 이 검정 방법에 따르면 리튬 라우릴설페이 트를 함유한 리튬 석시네이트 완충 용액중의 과량의 표적의 조건하에서 프로브와 표적의 하이브리드를 형성한다. 미리 형성된 하이브리드의 일부를 혼성화 완충액에 희석하고 예상되는 융점 온도 (전형적으로 55℃) 이하에서 시작하여 2 내지 5℃를 증가시킨 여러 온도에서 5분 동안 배양한다. 그런 후 이 용액을 약알카리성 보레이트 완충액으로 희석하고 보다 낮은 온도 (예, 50℃)에서 10분동안 배양한다. 일본쇄 프로브에 연결된 아크리디늄 에스테르는 이들 조건하에서 가수분해되는 한편 혼성화된 프로브에 연결된 아크리디늄 에스테르는 상대적으로 보호된다. 이 절차를 혼성화 보호 검정이라고 한다. 남아 있는 화학발광의 양은 하이브리드의 양과 비례하며 과산화수소에 이어 알카리를 차례로 첨가하여 발광계측기로 측정한다. 이 데이터를 온도에 대한 최대 시그날 (보통 최저 온도)의 퍼센트로 점적한다.
융점 온도는 최대 시그날의 50%가 남아 있는 포인트로서 정의된다. 다른 방도로서, 프로브와 표적의 하이브리드에 대한 융점 온도는 방사성 동위원소로 표지된 프로브를 이용하여 결정할 수 있다. 모든 경우에 있어서, 주어진 하이브리드에 대한 융점 온도는 혼성화 용액에 함유된 염, 세정제 및 기타 용질의 농도에 의해 다양할 수 있다. 이들 모든 인자는 열변성 동안에 상대적인 하이브리드 안정성에 영향을 미친다(Molecular Cloning: A Laboratory Manual Sambrook et al., eds. Cold Spring Harbor Lab Publ., 9.51, 1989).
혼성화 조건은 몇 가지의 변수, 예를 들면 혼성화 온도, 매질 성분의 성질 및 농도, 형성된 하이브리드와 세척시 온도 등을 고려하여 모니터링할 수 있다. 혼성화 및 세척 온도는 프로브의 염기 서열, 종류 및 길이에 따라 상위 값으로 한정하 며 최대 혼성화 또는 세척 온도는 약 30℃ 내지 60℃ 이다. 보다 높은 온도에서 혼성화와 프로브와 표적사이에 형성된 하이브리드의 해리 또는 변성과 경쟁한다.
혼성화 매질은 예를 들면 약 3xSSC (1xSSC=0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0), 약 25 mM 인산염 완충액 PH 7.1 및 20% 탈이온 포름아미드, 0.02% 피콜, 0.02% 소혈청 알부민, 0.02% 폴리비닐피롤리돈 및 약 0.1 mg/ml 절삭되고 변성된 연어 정자 DNA를 함유한다. 세척 매질은 예를 들면 약 3xSSC, 25 mM 인산염 완충액 pH 7.1 및 20% 탈이온 포름아미드를 함유한다. 프로브 및 매질의 변형에 따라, 목적하는 특이성을 얻기 위해 혼성화 또는 세척 온도는 알려진 연관성에 따라 바꾸어 주어야 한다(B. D. HAMES and S. J. HIGGINS, (eds.). Nucleic acid hybridzation. A practical approach, IRL Press, Oxford, U.K., 1985).
이러한 관점에서, 일반적으로 DNA:DNA 하이브리드는 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드보다 덜 안정하기 때문에, 검출될 하이브리드의 성질에 따라 혼성화 조건은 특이적 검출을 달성하기 위해 적절히 조정되어야 한다.
본 발명의 바람직한 특정 양태로서, 혼성화 완충용액(6 x SPE (0.15M NaCl, 5mM C6H5Na3O7, pH 7.0), 20% (v/v) 포름아미드)을 PCR 증폭 유전자와 혼합하고 프로브가 고정된 유리판 위에 분주한 후 30℃에서 6시간 동안 반응시켜 상보적인 결합을 유도한다. 시간이 경과한 후 3 x SPE, 2 x SSPE, 1 x SSPE 순으로 각각 5분씩 세척한다.
하이브리드의 정량은 통상적인 방법에 따라 표적을 상기된 프로브에서와 같이 형광 혹은 방사성 동위원소로 표지하여 이루어 질 수 있다. 표지는 프라이머 자체 에 할 수도 있고 증폭 및 전사시에 형광 및 방사성 동위원소가 표지된 염기 잔기를 사용함으로써 이루어질 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.  이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예의 모든 실험은 세브란스 병원 IRB 위원회의 승인하에, 헬싱키 협정에 의하여 모든 참가자에게 실험전에 동의를 받아 수행하였다.
실시예 1: BIGH3 단백질 돌연변이 타입의 결정
아벨리노증을 포함한 안과질환의 원인이 되는 단백질인 BIGH3의 유전자 돌연변이 진단용 프로브를 제작하기 위하여, 프로브 제작에 사용될 BIGH3단백질의 유전자 돌연변이 부위를 결정하였다.
BIGH3단백질의 유전자 돌연변이 부위는 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 유전자 관련 데이터베이스인 GenBank와 OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)을 통하여 DNA 염기서열과 아미노산 서열을 분석 및 확보하였고, 각 질환 대립형질 (allele)에 대한 정보도 확보하였다. 진단칩의 유효성을 테스트하기 위하여 검색할 돌연변이 타입을 먼저 결정하였다. BIGH3단백질의 유전자 돌연변이 다발 영역 중에서 특히 아벨리노증, 라티스 타입 I 질환 및 레이스버클러스 I 질환을 일으키는 돌연변이 영역을 선택하였다 (표 1).
BIGH3 유전자 부위의 돌연변이에 대한 안과 질환
표현형 아미노산 변이 변이서열 변이액손영역
아벨리노 이영양증 (Avellino dystrophy) R124H CGC → CAC 4
과립형 이영양증 (Granular dystrophy) R555W CGG → TGG 12
격자형 이영양증 (Lattice dystrophy) R124C CGC → TGC 4
격자형 이영양증 L518P CTG → CCG 12
격자형 이영양증 L527R CTG → CGG 12
격자형 이영양증 H626R CAT → CGT 14
격자형 이영양증 N622H AAC → CAC 14
격자형 이영양증 N544S AAT → AGT 12
격자형 타입 IIIA P501T CCA → ACA 11
격자형 타입IIIA A546T GCC → ACC 12
레이스버클러스 I (Reis-bucklers(CDB1)) R124L CGC → CTC 4
레이스버클러스 F540 deletion TTT → --- 12
레이스버클러스(CDB2) R555Q CGG → CAG 12
레이스버클러스 G623D GGC → GAT 14
실시예 2: 중합효소연쇄반응 ( PCR )을 통한 검색 영역의 획득
표 1에 나타난 돌연변이를 모두 검색하기 위하여 액손 4, 액손 11, 액손 12 그리고 액손 14 영역을 포함하는, 5쌍의 PCR 프라이머를 제작하였다. 이중에서 액손 4 영역의 돌연변이 영역을 증폭하기 위하여는 두 쌍의 프라이머를 사용하였다. 이 중 한 쌍 (프라이머 1 및 프라이머 2)은 진단용 DNA chip 실험에 적절하다고 판단되는 프라이머쌍이고, 다른 한 쌍 (프라이머 3 과 프라이머 4) 은 진단용으로 직접 염기서열 분석용으로 제작한 것이다. 이 때, 검색할 DNA 프로브와 상보적인 가닥의 프라이머(역방향 프라이머)의 5' 끝 부분 하이드록실기(Hydroxyl residue)에는 형광물질을 결합시켰다. 칩 상에서 효과적인 프라이머쌍을 구분하여 알기 위하여 프라이머 2에는 Cy5를 결합시켰으며, 프라이머 4에서 Cy3를 결합시켰다.
돌연변이를 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머
프라이머 # 서열번호 염기서열 (5' -> 3')
1 1 agc cct acc act ctc aa
2 2 cag gcc tcg ttg cta ggg
3 3 ccc cag agg cca tcc ctc ct
4 4 ccg ggc aga cgg agg tca tc
5 5 ctc gtg gga gta taa cca gt
6 6 tgg gca gaa gct cca ccc gg
7 7 cat tcc agt ggc ctg gac tct act atc
8 8 ggg gcc ctg agg gat cac tac tt
9 9 ctg ttc agt aaa cac ttg ct
10 10 ctc tcc acc aac tgc cac at
PCR은 50μl 전체 반응부피를 기준으로 했을 때 혈액에서 채취한 10-100ng정도의 DNA를 주형으로 하여 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)을 수행하여 단편 유전자를 제작하였다. 단편 유전자는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 첨가비율을 1:5 에서 1:10으로 차별화함으로써 한번의 중합효소연쇄반응으로 획득하였다. 첫 번째 변성은 98℃에서 5분간 1회 수행하고 이후, 두 번째 변성은 94℃에서 1분간, 교잡은 55℃에서 1분간, 연장은 72℃에서 1분간 수행하며 이를 35회 반복하고 이후 72℃ 에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다.
실시예 3: BIGH3 유전자 돌연변이 진단을 위한 프로브의 제조
표 1에 나타낸 각막이영양증의 돌연변이를 검색하기 위하여 돌연변이가 일어난 염기서열을 중심으로 하여 양쪽으로 5-8개, 가장 바람직하게는 양쪽으로 7개의 염기서열이 나열되도록 하여 프로브를 제작하였다. 정상인에 대한 프로브는 제작된 염기서열에 대하여 돌연변이가 되지 않은 정상 염기서열이 중심에 오도록 하였다.
안과질환 돌연변이 진단을 위해 제작된 프로브
서열번호 유전자 타입 정상 또는 변이 프로브 서열 액손영역
11 정상 R124 acg gac cgc acg gag 4
12 Avellino dystrophy R124H acg gac cac acg gag 4
13 Reis-bucklers(CDB1) R124L acg gac ctc acg gag 4
14 정상 R124 cac gga ccg cac gga 4
15 Lattice type I R124C cac gga ctg cac gga 4
16 정상 P501 gac ccc ccc aat ggg 11
17 Lattice typelllA P501T gac ccc cac aat ggg 11
18 정상 L518 agc atg ctg gta gct 12
19 Lattice dystrophy Pro L518P agc atg ccg gta gct 12
20 정상 L527 gca gga ctg acg gag 12
21 Lattice dystrophy Arg L527R gca gga cgg acg gag 12
22 정상 F540 aca gtc ttt gct ccc 12
23 Reis-bucklers F540 deletion ac aca gtc gct ccc ac 12
24 정상 N544 ccc aca aat gaa gcc 12
25 Lattice dystrophy ser1 N544S ccc aca agt gaa gcc 12
26 정상 N544 ccc aca aac gaa gcc 12
27 Lattice dystrophy ser2 N544S ccc aca agc gaa gcc 12
28 Lattice dystrophy ser3 N544S ccc aca tct gaa gcc 12
29 Lattice dystrophy ser4 N544S ccc aca tcc gaa gcc 12
30 Lattice dystrophy ser5 N544S ccc aca tca gaa gcc 12
31 Lattice dystrophy ser6 N544S ccc aca tcg gaa gcc 12
32 정상 A546 aaa tga agc cttc cga 12
33 Lattice typelllA thr A546T aaa tga aac cttc cga 12
34 정상 R555 aag aga acg gag cag 12
35 Granular dystrophy R555W aag aga atg gag cag 12
36 정상 R555 aga gaa cgg agc aga 12
37 Reis-bucklers(CDB2) R555Q aga gaa cag agc aga 12
38 정상 N622 ggc cac aaa tgg cgt 14
39 정상 N622 ggc cac aaa cgg cgt 14
40 Lattice dystrophy his N622H ggc cac aca cgg cgt 14
41 정상 G623 aca aat ggc gtg gtc 14
42 Reis-bucklers-1 G623D aca aat gat gtg gtc 14
43 정상 G623 caa acg gcg tgg tcc 14
44 Reis-bucklers-2 G623D caa acg atg tgg tcc 14
45 정상 H626 gtg gtc cat gtc atc 14
46 14Lattice dystrophy H626R gtg gtc cgt gtc atc 14
실시예 4: 각막이영양증 진단용 DNA 칩의 제작
실시예 3에서 선별된 각 프로브를 DNA 칩에 적용하기 위하여 합성하였다. 모노뉴클레오타이드(Proligo Biochemie GmbH Hamburg Co.)를 자동화 합성기(ExpediteTM 8900, PE Biosystems Co.)에 투입하고 목적하는 프로브의 염기서열과 스케일을 입력하여 각각 0.05 μmole의 순수한 핵산 프로브를 수득하였다. 수득된 프로브는 전기영동을 하여 합성 여부를 확인하였다.
제조된 프로브를 유리판 위에 고정시키기 위하여 알데히드기-아민기 사이의 결합을 이용하였다. DNA 프로브를 고정화하기 위해 모든 DNA 단편 프로브를 합성할 때, 3-첫번째 위치에 아미노링커컬럼 (Aminolinker column, Cruachem, Glasgrow, Scotland) 을 이용하여 아민기(amino residue)를 가진 염기를 삽입하였고, 스폿팅 완충용액 (3x SSC; 0.45 M NaCl, 15 mM C6H5Na3O7, pH 7.0) 조건하에, 전기 프로브를 알데하이드기 (aldehyde residue)로 입혀진 유리판(CEL Associates, Inc. Huston, Texas, USA)에 마이크로어레이어(microarrayer)를 이용하여 스폿팅한 후, 55%이상의 습도가 유지되는 조건에서 1시간 이상 아민-알데히드를 결합시킨 다음, 6시간 이상 방치하여 프로브를 고정화하였다. 이 때, 기준프로브(POSITION MARKER)의 농도는 2-5μM의 농도로 고정화하고, 각 프로브는 10-100μM의 농도로 고정화하였다. 프로브의 아민기와 유리판 위의 알데히드 사이의 반응이 원활히 이루어져 고정화가 잘 이루어졌는지 확인하기 위해 사이브로 그린 II (SYBRO green II, Molecular Probe, Inc., Leiden, Netherlands)로 염색하여 확인하였다.
실시예 5: 각막이영양증 진단용 DNA 칩을 이용한 각막이영양증의 진단
프로브의 특이성과 민감도를 확인하기 위하여 실시예 2의 방법으로 증폭된 상기 PCR 생성물을 실시예 4에서 제작된 핵산 프로브가 고정된 DNA 칩에 적용하여 혼성화 반응을 실시하였다. 핵산 프로브를 환자 혹은 정상인의 피로부터 분리한 게놈 유전자 PCR생성물과 혼성화 반응 후 시그널이 나타나는 경우와 나머지 프로브에 대해서의 교차반응(특이성) 여부를 시험하였다.
유리판에 핵산 프로브가 고정된 DNA 칩에 수증기를 씌워 가수화를 시킨후, 차가운 70% 에탄올에 담금질함으로써 유리판에 고정되지 않은 프로브를 제거시켰다. 이후에, 혼성화 과정중에 형광물질이 유리판 표면에 남아있는 알데하이드 잔기에 부착되어 전체적인 시그널을 높여 특이적인 프로브의 시그널을 효과를 저해시키는 것을 방지하기 위해서 유리판을 차단용액(blocking solution)(1.3g NaBH4, 375ml PBS, 125ml 100% 에탄올)에 담근 후 진탕기(shaker)에서 5분간 반응시켰다. 멸균수로 세척 후, 0.1% SDS로 5분간 세척하고 멸균수로 다시 1분간 2-3번 세척해준 후, 원심분리기를 이용하여 유리판에 있는 물기를 제거하였다(1,000rpm, 2분간).
혼성화시킬 용액은 혼성화 완충용액[hybridization buffer: 6xSSPE(0.9M NaCl, 10mM NaH2PO4?H2O, 1mM EDTA, pH 7.4) 또는 20x SSPE(3M NaCl, 0.2M NaH2PO4?H2O, 0.02M EDTA, pH 7.4), 20% (v/v) 포름아미드(Sigma Co., St. Louis)]에 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)으로 증폭시킨 유전자를 각 10-20㎕ 넣어서 총 부피가 200㎕가 되도록 제조하였다. 제조된 용액을 프로브가 고정화되어 있는 유리판 위에 분주한 후 프로브-클립 프레스-씰 배양실(probe-clip press-seal incubation chamber, Sigma Co., St. Louis, MO.)로 덮었다.
혼성화되는 동안 유리판 주변이 건조되는 것을 방지하기 위해서 혼성화 챔버에 물기가 있는 휴지를 넣은 후, 30℃ 항온진탕배양기(shaking incubator)에서 4-6시간 동안 반응시켜 상보적인 결합을 유도하였다. 시간이 경과한 후 3xSPE (0.45M NaCl, 15mM C6H5Na3O7, pH 7.0), 2xSSPE (0.3M NaCl, 10mM C6H5Na3O7, pH 7.0), 1xSSPE (0.15M NaCl, 5mM C6H5Na3O7, pH 7.0) 순으로 각각 5분씩 세척한 후, 원심분리기를 이용하여 유리판에 있는 물기를 제거하였다(1,000rpm, 2분간).
혼성화 반응 후 시그널은 DNA 칩 스캐너(CCD camera based scanner, ArrayWoRx, Applied Precision LLC, USA)를 이용하여 검출하였으며, 노출 시간은 0.2~0.5초로 하였다. 검출된 시그널은 ImaGene 6.0 소프트웨어(Biodiscovery Inc., USA)를 이용하여 분석하였으며, 시그널의 강도는 Cy3 형광의 경우 595nm, Cy5 형광의 경우 685nm, FITC 형광의 경우 530nm에서 측정하였다.
실시예 6: 스폿팅 완충 용액에 따른 DNA 칩의 기능성
하나 또는 두개 염기의 점돌연변이를 선별적으로 검출할 수 있는 효율적인 각막이영양증 진단용 DNA칩을 제조하기 위하여 스폿팅 완충 용액에 따른 DNA 칩의 검출 효율을 측정하였다.
실시예 4에서 제작한 프로브를 0.1M의 농도로 포함하되 스폿팅 용액을 다르게 하여 DNA칩을 제조하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 4개의 블록 중 좌측 2개의 블럭은 텔레켐(Telechem)사에서 판매하는 스폿팅 용액상에 프로브를 고정하였고 우측 상단의 블럭은 3x SSC용액에, 우측 하단의 블럭은 50% DMSO용액 상에 프로브를 고정하였다. 노란색부위는 정상인에 대한 프로브를 나타내고 분홍색 및 청록색 부위는 각각 아벨리노증 및 레이스 버클러 CD1 에 대한 프로브를 나타낸 것이다.
도 2~도 5는 상기와 같이 디자인된 DNA 칩에 액손 4 영역의 증폭 산물을 적용한 혼성화 반응 결과이다. Cy5 (붉은색) 의 결과는 프라이머 1 및 프라이머 2를 사용하여 증폭한 산물을 적용한 결과이며, Cy3 (녹색)의 결과는 프라이머 3 및 프라이머 4로 증폭한 산물을 적용한 결과이다. 우측 박스에 대조할 수 있는 디자인상의 결과를 나타내었다. 도 2는 정상인의 경우, 도 3은 헤테로 아벨리노증의 경우, 도 4는 호모 아벨리노증의 경우, 도 5는 헤테로 레이스-버클러 CD1의 경우에 대한 결과이다.
FIGs. 2~5에 나타난 바와 같이, 3 x SSC의 경우가 가장 시그날이 정확하고 깨끗하게 나타나는 것을 확인하고, 이후 실시예에서는 3x SSC를 사용하여 혼성화반응을 수행하였다.
실시예 7: 프로브의 농도와 혼성화 시간에 따른 DNA 칩의 기능성
하나 또는 두개 염기의 점돌연변이를 선별적으로 검출할 수 있는 효율적인 각막이영양증 진단용 DNA칩을 제조하기 위하여, 프로브의 농도와 혼성화 시간에 따른 DNA 칩의 검출 효율을 측정하였다.
실시예 4에서 제작한 프로브를 10-100μM의 농도로 포함하는 3x SSC 스폿팅 용액을 사용하여 DNA칩을 제조하였다. 도 6과 같은 DNA 칩을 하나의 칩에 두블록씩 제작하였다. 도 7은 환자에 따라 예상되는 혼성화 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 상기 DNA칩을 이용한 프라이머 세트의 혼성화 시간에 따른 혼성화 결과를 나타낸 것이다. 붉은색의 결과는 Cy5로 표지되어 증폭된 프라이머 1 및 프라이머 2에 대한 증폭 생산물에 대한 혼성화 결과이다. 혼성화 시간 및 적용된 환자는 각각의 도면에 나타내었다.
그 결과, 액손 4영역에 대해서는 프라이머 1 및 2에 대한 증폭 생산물이, 프로브의 농도는 30-50μM이, 혼성화 시간은 2-6시간이 바람직하며 더욱 바람직하게는 4-6시간이 바람직하며, 가장 바람직하게는 6시간임을 알 수 있었다.
실시예 8: 프로브의 길이에 따른 DNA 칩의 기능성 검사
하나 또는 두개 염기의 점돌연변이를 선별적으로 검출할 수 있는 효율적인 각막이영양증 진단용 DNA칩을 제조하기 위하여, 아벨리노 각막이영양증, 레이스버클러스 I 각막이영양증(Reis-bucklers corneal dystrophy) 라티스 타입 I 각막이영양증(lattice type I corneal dystrophy) 및 과립형각막이영양증(Granular corneal dystrophy)진단용 프로브의 길이에 따른 DNA 칩의 검출 효율을 측정하였다.
프로브 길이는 11mer, 12mer, 15mer 및 17mer를 사용하였으며, 표 3에 기재된 변이부분을 중심으로, 서열번호 11 내지 서열번호 15, 서열번호 34 및 서열번호 35의 프로브 서열을 바탕으로 제작하였다 (표 4).
최적 프로브 길이 확인을 위한 프로브 서열
프로브 이름 길이 서열 서열번호  
not ACD 11 13 15 17 ggaccgcacgg cggaccgcacgga acggaccgcacggag cacggaccgcacggaga 47 48 11 49 정상/헤테로
ACD 11 13 15 17 ggaccacacgg cggaccacacgga acggaccacacggag cacggaccacacggaga 50 51 12 52 아벨리노
RBCD 11 13 15 17 ggacctcacgg cggacctcacgga acggacctcacggag cacggacctcacggaga 53 54 13 55 레이스버클러스 I
not LCD I 11 13 15 17 cggaccgcacg acggaccgcacgg cacggaccgcacgga acacggaccgcacggag 56 57 14 58 정상/헤테로
LCD I 11 13 15 17 cggactgcacg acggactgcacgg cacggactgcacgga acacggactgcacggag 59 60 15 61 라티스 타입 I
not GCD 15 17 16 16 aagagaacggagcag caagagaacggagcaga caagagaacggagcag aagagaacggagcaga 34 62 63 64 정상/헤테로
GCD 17 16 16 caagagaatggagcaga caagagaatggagcag aagagaatggagcaga 65 66 67 과립형
상기 제작된 프로브는 실시예 4와 동일한 방법으로, 프로브 농도를 50μM의 농도로 포함하는 3x SSC 스폿팅 용액을 사용하여 DNA칩을 제작하였다.
정상시그널(W)에 대한 변이시그널(M)의 비율 (W/M)을 정상서열에 대한 프로브의 스팟 시그널(W)과 변이 서열을 가지는 이영양증 프로브의 스팟 시그널(M)의 비율로 정의하고, 이를 프로브 최적하여 적용하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 아벨리노 각막이영양증의 경우는 13 mer 길이의 프로브를 사용하였을 때에 가장 성공적으로 검출되었으며, 15mer 길이의 프로브를 사용하였을 때에도 높은 효율을 나타내었다. 라티스 타입 I 각막이영양증 및 레이스버클러스 I 각막이영양증은 15mer 길이의 프로브를 사용하였을 때 가장 높은 효율을 나타내었다.  그러므로, 아벨리노 각막이영양증, 라티스 타입 I 각막이영양증 및 레이스버클러스 I 각막이영양증을 판단하는 엑손 4의 변이 영역을 검출하는 데는 15mer 길이의 프로브를 사용하였다. 표 4에는 각막이영양증 진단용 칩에 최적인 프로브 길이를 볼드체로 표시하였다.
엑손 12의 점돌연변이에 의하여 발생하는 과립형 각막이영양증 (Granular corneal dystrophy)의 진단 프로브의 경우, 도 10에 나타낸 DNA 칩을 사용하여 실험한 결과, 17 mer 길이의 프라이머가 가장 효과적인 것으로 나타났다 (도 11).
실시예 9: 환자 진단에의 적용을 위한 DNA 칩의 혼성화 결과
하나 또는 두개 염기의 점돌연변이를 선별적으로 검출할 수 있는 효율적인 각막이영양증 진단용 DNA칩을 제조하기 위하여, 실시예 6, 실시예 7 및 실시예 8의 결과를 이용하여, 최적 프로브의 농도와 최적 혼성화 시간 및 최적 프로브 길이에 따른 DNA 칩의 검출 효율을 측정하였다.
최종적으로 15mer의 각각의 프로브를 50μM의 농도로 3x SSC 스폿팅 용액을 사용하여 DNA칩을 제조하였다 (도 12). 환자에 따라 예상되는 혼성화 결과는 도 13에 나타낸 바와 같다.
도 13은 상기의 DNA칩을 사용하여 환자로부터 증폭된 프라이머 1 및 2에 대한 증폭 생산물에 대한 혼성화 결과를 나타낸 것이다. 적용된 환자는 각각의 도면에 나타내었다. 본 발명에 따른 각막이영양증 진단용 DNA 칩을 환자 진단에 적용한 결과, 적용한 모든 환자의 경우 정확한 진단이 가능함을 알 수 있었고 민감도뿐만 아니라 특이도도 우수함을 확인하였다.
상기와 같은 혼성화 결과를 통해서 안과 질환에 매우 바람직하게 적용할 수 있는 진단용 DNA칩을 제작하였으며, 아벨리노 각막이영양증, 라티스 타입 I 각막이영양증 및 레이스버클러스 I 각막이영양증 진단용 프로브는 15mer길이의 프로브를 사용하였고, 과립형각막이영양증(Granular corneal dystrophy) 진단용 프로브는 17mer 길이의 프로브를 사용하였으며, 프로브 농도는 30-50μM로 3x SSC에 스폿팅하여 30℃에서 6시간의 혼성화를 통해 최적의 진단효과를 가질 수 있음을 발견하였다. 이로부터 프로브의 길이에 따른 Tm보다 15-20℃ 높은 온도에서의 혼성화 또한 가능함을 할 수 있다. 따라서 본 발명의 DNA 칩은 고정되는 프로브의 길이에 따라 혼성화 온도를 조절하는 것도 가능하며, 아벨리노증을 포함한 BIGH3상의 돌연변이에 기인하는 각막이영양증을 효과적으로 정확히 진단할 수 있음을 확인하였다.
상기 제작된 각막이영양증 진단을 위해 최적화된 DNA칩을 이용하여, 98명의 환자의 혈액샘플을 이용하여 각막이영양증을 진단하였다. 그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 27명이 정상이었어며, 10명이 동형 아벨리노 각막이영양증으로 진단되었고, 57명이 이형 아벨리노 각막이영양증으로 진단확인되었고, 1명이 이형 라티스 타입 I 각막이영양증 환자로 진단되었으며, 1명이 이형 레이스버클러스 I 각막이영양증으로 진단되었고, 2명이 과립형각막이영양증으로 진단되었다.
임상샘플의 진단결과
병명 변이 변이서열 변이형태 변이 엑손 환자수
아벨리노 R124H CGC→CAC heterozygous 엑손 4 57
아벨리노 R124H CGC→CAC homozygous 엑손 4 10
라티스 타입 I R124C CGC→TGC heterozygous 엑손 4 1
레이스버클러스 I R124L CGC→CTC heterozygous 엑손 4 1
과립형 R555W CGG→TGG   엑손 12 2
정상 변이없음   정상   27
 계         98
상기 진단결과는 임상샘플의 DNA 염기서열 분석을 통하여, 100% 정확성을 가진다는 것이 확인되었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 각막이영양증의 원인이 되는 BIGH3 유전자의 돌연변이 부위를 포함하는 서열인 각막이영양증의 원인이 되는 BIGH3 유전자의 돌연변이 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 각막이영양증 진단용 DNA 칩을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 기존의 현미경으로만 진단되었던 각막이영양증을 유전적으로 정확하게 진단할 수 있어, 각막이영양증 환자가 오진에 의하여 시력교정수술을 시술받아 실명하는 것을 방지할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정 의된다고 할 것이다.
<110> MEDIGENES Co. 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8 ggggccctga gggatcacta ctt 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctgttcagta aacacttgct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ctctccacca actgccacat 20 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 11 acggaccgca cggag 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 acggaccaca cggag 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 13 acggacctca cggag 15 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 14 cacggaccgc acgga 15 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 cacggactgc acgga 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 16 gaccccccca atggg 15 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 17 gacccccaca atggg 15 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 18 agcatgctgg tagct 15 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 19 agcatgccgg tagct 15 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 20 gcaggactga cggag 15 <210> 21 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 21 gcaggacgga cggag 15 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 22 acagtctttg ctccc 15 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 23 acacagtcgc tcccac 16 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 24 cccacaaatg aagcc 15 <210> 25 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 25 cccacaagtg aagcc 15 <210> 26 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 26 cccacaaacg aagcc 15 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 27 cccacaagcg aagcc 15 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 28 cccacatctg aagcc 15 <210> 29 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 29 cccacatccg aagcc 15 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 30 cccacatcag aagcc 15 <210> 31 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 31 cccacatcgg aagcc 15 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 32 aaatgaagcc ttccga 16 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 33 aaatgaaacc ttccga 16 <210> 34 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 34 aagagaacgg agcag 15 <210> 35 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 35 aagagaatgg agcag 15 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 36 agagaacgga gcaga 15 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 37 agagaacaga gcaga 15 <210> 38 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 38 ggccacaaat ggcgt 15 <210> 39 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 39 ggccacaaac ggcgt 15 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 40 ggccacacac ggcgt 15 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 41 acaaatggcg tggtc 15 <210> 42 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 42 acaaatgatg tggtc 15 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 43 caaacggcgt ggtcc 15 <210> 44 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 44 caaacgatgt ggtcc 15 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 45 gtggtccatg tcatc 15 <210> 46 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 46 gtggtccgtg tcatc 15 <210> 47 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 47 ggaccgcacg g 11 <210> 48 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 48 cggaccgcac gga 13 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 49 cacggaccgc acggaga 17 <210> 50 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 50 ggaccacacg g 11 <210> 51 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 51 cggaccacac gga 13 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 52 cacggaccac acggaga 17 <210> 53 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 53 ggacctcacg g 11 <210> 54 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 54 cggacctcac gga 13 <210> 55 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 55 cacggacctc acggaga 17 <210> 56 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 56 cggaccgcac g 11 <210> 57 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 57 acggaccgca cgg 13 <210> 58 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 58 acacggaccg cacggag 17 <210> 59 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 59 cggactgcac g 11 <210> 60 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 60 acggactgca cgg 13 <210> 61 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 61 acacggactg cacggag 17 <210> 62 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 62 caagagaacg gagcaga 17 <210> 63 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 63 caagagaacg gagcag 16 <210> 64 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 64 aagagaacgg agcaga 16 <210> 65 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 65 caagagaatg gagcaga 17 <210> 66 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 66 caagagaatg gagcag 16 <210> 67 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 67 aagagaatgg agcaga 16

Claims (14)

  1. 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 50, 서열번호 53 및 서열번호 59로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 필수적으로 함유하는 각막이영양증 진단용 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 50의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 각막이영양증 진단용 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 53의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 각막이영양증 진단용 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 59의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클 레오티드는 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 각막이영양증 진단용 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 35의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 65의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 각막이영양증 진단용 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이는 13~17bp인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 각막이영양증 진단용 DNA 칩.
  8. 제7항에 있어서, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47 및 서열번호 56으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드가 추가로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  9. 제8항에 있어서, 서열번호 47의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  10. 제8항에 있어서, 서열번호 56의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  11. 제8항에 있어서, 서열번호 34의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 62의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  12. 제7항에 있어서, 서열번호 16 내지 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 56 및 서열번호 59로 구성된 그룹의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드들이 모두 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA칩.
  13. 서열번호 11 내지 서열번호 15, 서열번호 62 및 서열번호 65로 구성된 그룹의 올리고뉴클레오티드들이 모두 고정되어 있는 각막이영양증 진단용 DNA칩.
  14. 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 군에서 선택되는 프라이머 쌍.
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