KR20200129539A - Pcr 및 제한효소를 이용한 각막이상증 분자 진단 방법. - Google Patents
Pcr 및 제한효소를 이용한 각막이상증 분자 진단 방법. Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 PCR 및 제한효소를 이용하여 각막이상증을 유발하는 TGFBI 유전자의 변이 여부를 손쉽고 빠르게 검출하는 방법에 관한 것으로, TGFBI 유전자 부위를 포함하는 DNA 부위를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 RsrII 제한효소 또는 이의 동일전달제한효소(Isoschizomers)를 유효성분으로 하는 TGFBI 유전자 변이 검출용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 검체를 직접 이용하거나 또는 검체로부터 DNA 시료를 추출하는 단계; 프라이머 세트를 이용하여 TGFBI 유전자 부위를 포함하는 DNA 부위를 증폭하기 위한 PCR을 수행하는 단계; 상기 단계의 PCR 산물에 RsrII 제한효소 또는 이의 동일전달제한효소(Isoschizomers)를 처리하는 단계; 제한효소 처리한 산물의 크기를 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 및 제한효소를 이용한 각막이상증 분자 진단 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 아벨리노 각막이상증(Avellino Corneal dystrophy)의 원인이 되는 TGFBI 유전자의 124번 아르지닌 (arginine, R)이 히스티딘(Histidine, H)으로의 변이 유무와 그 외 124번 아르지닌(R)이 다른 아미노산으로의 변이로 인하여 발생하는 다른 유형의 각막이상증을 정확하게 진단할 수 있도록 PCR(Polymerase Chain Reaction) 및 RsrⅡ 제한효소 또는 이의 동일전달제한효소(Isoschizomers)를 이용하여 TGFBI 유전자의 변이를 검출하는 방법에 관한 것에 관한 것이다.
TGFBI 유전자(Transforming Growth Factor-Beta-Induced gene) 연관 각막이상증은 TGFBI 유전자의 변이에 의한 이상단백질의 각막 침착으로 인하여 각막에 혼탁이 나타나며 연령이 증가함에 따라 증상이 심화되는 질환을 통칭하며 혼탁으로 심각한 시력저하를 동반한다.
TGFBI유전자는 5번 염색체 장완 31좌위(5q31)에 위치하며, TGFBI유전자의 변이에 의한 각막이상증은 특히 124번 아르지닌(arginine)이 히스티딘(histidine) 으로 변이(R124H)되어 나타나는 아벨리노형(Avellino corneal dystrophy), 류신(leucine)으로 변이(R124L)되어 나타나는 레이스 뷸러형 (Reis-Bucklers corneal dystrophy), 시스테인(cystenine)으로 변이(R124C)가 되어 나타나는 레티스형(Lattice corneal dystrophy), 마지막으로 세린(serine)으로 변이(R124S)되어 나타나는 그레뉼라형(Granular corneal dystrophy)으로 나눌 수 있다.
TGFBI의 124번 아르지닌(arginine)의 변이로 발생하는 각막이상증은 서양 사람의 경우 전체 TGFBI변이에 의한 각막이상증의 약 5% 미만으로 발생하는 매우 희귀한 질환이나, 한국, 일본, 중국에는 발생빈도가 매우 높은 변이 형태로서 한국의 경우 전체 각막이상증의 약 90% 이상이 TGFBI 유전자의 124번 아르지닌(arginine)이 히스티딘(histidine)으로 변이(R124H)된 아벨리노 각막이상증이다.
특히, 아벨리노 각막이상증(R124H 변이)은 한국인에서의 유병률이 인구 1/870명~1/1000명일 정도로 많은 잠재적 환자들이 존재하고 있다고 보고되고 있어, 우리나라 국민 중 약 5만명 이상의 잠재적 환자 군이 있다고 알려져 있다. 따라서, TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증을 간편하고 빠르게 진단할 수 있는 분자 진단 기술 개발 및 kit 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
아벨리노 각막이상증에 대한 가장 기본적인 현미경 검사방법으로는 육안으로 각막의 혼탁이나 흰점의 유무를 관찰함으로써 바로 결과를 얻어낼 수 있는 장점이 있으나, 숙련된 안과전문의의 진단이 요구되며 진단에 주관적일 수 있으며 개인별로 발현되는 정도에 차이가 있을 수 있으므로 정확한 결과를 기대하기 어렵다. DNA 염기서열 분석법(sequencing)은 돌연변이를 보이는 부분을 포함한 DNA 부위를 증폭시키고 추출하여 정제 과정을 거친 후에야 서열 분석이 가능하고, 고가의 자동 DNA 서열 분석기를 사용하여야 하고, 직접 신호가 강조된 부분을 관찰하는 번거로운 과정을 거쳐야 하며 검사 시간도 24~48시간 정도가 소요된다. DNA 칩(chip) 검사방법은 DNA 증폭이나 정제과정이 필요 없고 검사시간이 6~8시간 정도로 소요되며 몇 군데의 표식(signal on the expected probe spot regions)을 관찰하여 간단히 검사결과를 확인할 수 있는 장점이 있으나 DNA 칩 가격이 다른 검사방법에 비하여 상대적으로 비싸다는 단점이 있다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 각막이상증을 유발하는 TGFBI 유전자의 변이 여부를 저비용으로 손쉽고 빠르게 검출하는 새로운 방법을 제공하는 것으로서, 보다 구체적으로는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 및 RsrⅡ 제한효소 또는 이의 동일전달제한효소(Isoschizomers)를 이용하여 TGFBI 유전자의 변이 여부를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TGFBI 유전자 부위를 포함하는 DNA를 프라이머 세트를 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄 반응)을 통해 증폭한 후 DNA 절단효소를 이용하여 절단하여 절단 조각을 생성하고, 상기 절단 조각들의 크기를 전기영동으로 분석하여 TGFBI 유전자 변이 여부를 검출한다.
구체적으로 본 발명은 각막이상증을 유발하는 TGFBI 유전자의 변이 여부를 검출하기 위한 TGFBI 유전자 부위를 포함하는 DNA 부위를 증폭하기 위한 프라이머 세트; 및 RsrII 제한효소 또는 이의 동일전달제한효소(Isoschizomers);를 유효성분으로 하는 TGFBI 유전자 변이 검출용 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로 본 발명은 각막이상증을 유발하는 TGFBI 유전자의 변이 여부를 검출하기 위해서 TGFBI 유전자의 124번 아르지닌(arginine)을 포함하는 엑손(exon) 4번과 양쪽의 인트론(intron)의 일부를 포함한 부위를 증폭하기 위한 프라이머 세트; 및 RsrII 제한효소 또는 이의 동일전달제한효소(Isoschizomers)를 유효성분으로 하는 TGFBI 유전자 변이 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 PCR 증폭을 위하여 직접 검체를 이용하거나, 또는 검체로부터 DNA 시료를 추출하는 단계; 프라이머 세트를 이용하여 TGFBI 유전자 부위를 포함하는 DNA 부위를 증폭하기 위한 PCR을 수행하는 단계; 상기 단계의 PCR 산물을 RsrII 제한효소 또는 이의 동일전달제한효소(Isoschizomers) 처리하는 단계; 제한효소 처리한 산물의 크기를 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 TGFBI 유전자 변이 검출 방법을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에서 제작하여 사용한 프라이머 세트와 제한효소는 하기 표와 같다.
[TGFBI 유전자 증폭용 PCR 프라이머 세트 및 제한효소]
서열번호 1:(forward) 프라이머 :5'-ATTACCTGCAAATACACACAGTACTTTG-3'
서열번호 2:(reverse) 프라이머: 5'-CAAGTCTTTCTGCCCAGTAGGGAAC-3'
제한효소: RsrII 또는 이의 동일전달제한효소(Isoschizomers)
동일전달제한효소(Isoschizomers)란 다른 세균에서 분리한 제한효소이면서도 그 인식배열은 상호 일치하는 것을 말한다.
상기 RsrII의 동일전달제한효소(Isoschizomers)는 CpoI, CspI, 또는 Rsr2I 중 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함하는 의미이다.
본 발명에서 PCR 증폭에 사용하는 시료는 검체로부터 DNA분리 정제과정을 거치는 방법 또는 검체를 직접 이용하는 방법 모두에 동일하게 적용될 수 있다. 검체로부터 DNA분리 정제과정을 거치는 방법은 DNeasy Blood & tissue kit(Qiagen)의 프로토콜에 따라 정제할 수 있고, 검체를 직접 이용할 경우는 검체를 다른 변형 없이 시료로 직접 사용할 수 있다. 검체로는 혈액, 모근, 구강상피세포 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, PCR(Polymerase Chain Reaction)은 당업계에 잘 알려져 있는 것으로서 표적 DNA를 주형으로 사용하고, 상기 표적 DNA에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 DNA를 증폭하는 과정을 의미한다.
본 발명의 프라이머(primer)란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
제한효소(restriction enzyme)는 분자생물학의 기본이 되는 효소류 중의 하나로서 대상 유전자의 특정한 염기서열을 인식하여 절단하는 기능을 갖고 있다.
본 발명에서 RsrⅡ 제한효소는 도 1에 나타난 바와 같이 CGGWCCG라는 특이적 염기서열을 인식하여 절단하는 효소이다. 여기서 W는 어떠한 염기서열이 와도 RsrII 제한효소의 인식부위에는 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명에서 제시한 TGFBI의 PCR증폭부위 염기서열중 아미노산 122번 Threonine(T), 123번 Aspartic Acid(D) 124번 arginine(R)을 코드하는 염기서열, ACG GAC CGC가 RsrII 제한효소의 특이적 인식부위에 해당된다. 따라서 정상 TGFBI 유전자의 경우 RsrII 제한효소에 의해서 유전자가 절단되어 유전자의 크기(size)가 달라지지만, 124번 아르지닌을 코드하는 CGC 가 CAC(histidine)로 변이가 발생한 경우나, CGC→ CTC(Leucine), CGC→ TGC(cysteine), 또는 CGC→ AGC(serine)로 변이가 발생한 경우 RsrII 제한효소는 해당 염기서열을 인식하지 못하여 유전자가 절단되지 않아 유전자의 크기(size)가 달라지지 않는다. 이에 따라 제한효소 처리 후 유전자의 크기(size)를 분석하면 TGFBI 변이 여부를 검출할 수 있게 된다.
본 발명의 실시예에서는 유전자의 크기(size)를 분석하기 위하여 제한효소를 처리한 산물을 1.5% 아가로스겔을 이용한 전기영동을 통해 크기 차이를 보이는 DNA 밴드를 확인하였다.(실시예 5)
확인 결과, 정상 유전자의 경우 확연하게 500bp와 300bp의 절단 산물로 분리된 것으로 나타났다. 124번 아르지닌(arginine)의 동형접합자 변이인 경우는 예상 결과와 같이 증폭된 PCR산물이 전혀 RsrII 제한효소에 의해 절단이 이루어지지 않은 800bp산물 그대로 남아 있음을 알 수 있다. 한편, 이형접합자 변이의 경우는 500bp와 300bp절단 산물외에도 800bp의 미절단 산물이 확연하게 나타나는 결과를 얻었다.(도 3 (b))
따라서, 본 발명의 TGFBI 유전자 변이 검출용 조성물 및 TGFBI 유전자 변이 검출 방법을 이용하면, 124번 아르지닌(arginine)이 히스티딘(histidine, R124H)으로 변이되어 나타나는 아벨리노형(Avellino corneal dystrophy), 그리고 류신(leucine, R124L)으로 변이되어 나타나는 레이스 뷸러형 (Reis-Bucklers corneal dystrophy), 시스테인(cysteine, R124C)으로 변이되어 나타나는 레티스형(Lattice corneal dystrophy), 마지막으로 세린(serine, R124S)으로 변이되어 나타나는 그레뉼라형(Granular corneal dystrophy) 각막이상증 여부를 한 번에 알아낼 수 있다.
본 발명에 따르면 검체로부터 DNA 분리 정제를 하지 않고 검체를 직접 이용한 간단한 PCR과 RsrII 제한효소 처리만으로도 유전자 변이 여부를 검출할 수 있으므로, 고가의 자동 DNA 서열 분석기나 DNA 칩을 사용하는 진단 방법에 비하여 시간적, 비용적인 면에서 매우 효과적으로 TGFBI 변이에 의한 아벨리노 각막이상증의 진단검사가 가능하다. 구체적으로 검체 채집 후 분석완료까지 3시간 정도 밖에는 소요되지 않아 유전자 변이 여부를 빠르게 알 수 있는 장점이 있다.
도 1은 TGFBI 유전자 124번 아르지닌(arginine)부위를 포함하는 일부의 염기서열 안의 RsrII제한 효소 특이적 인식부위(CGGWCCG)를 나타낸 것이다. 여기서 W는 어떠한 염기서열이 와도 RsrII제한효소의 인식부위에는 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
도 2는 본 발명에 따른 124번 아르지닌(arginine)이 위치한 엑손(exon) 4번과 양쪽 인트론(intron)부위를 포함한 800 bp의 PCR증폭 산물 부위를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)을 통하여 증폭된 TGFBI 유전자 산물의 예상 크기(size)와 RsrII 제한효소 처리 후에 예상되는 절단 절편의 크기(도 3 (a)) 및 실제 PCR 증폭 과 제한효소 처리 후의 전기영동 영상(도 3 (b))을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 124번 아르지닌(arginine)이 위치한 엑손(exon) 4번과 양쪽 인트론(intron)부위를 포함한 800 bp의 PCR증폭 산물 부위를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)을 통하여 증폭된 TGFBI 유전자 산물의 예상 크기(size)와 RsrII 제한효소 처리 후에 예상되는 절단 절편의 크기(도 3 (a)) 및 실제 PCR 증폭 과 제한효소 처리 후의 전기영동 영상(도 3 (b))을 나타낸 것이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 시료의 추출
본 발명에 PCR 증폭에 사용되는 시료는 검체로부터 DNA분리 정제과정을 거치는 방법 또는 직접 검체를 이용하는 방법 모두에 동일하게 적용될 수 있다. 검체로부터 DNA분리 정제과정을 거치는 방법은 혈액을 DNeasy Blood & tissue kit(Qiagen)의 프로토콜에 따라 정제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 검체를 직접 이용하는 방법은 검체를 다른 변형 없이 시료로 직접 사용할 수 있다. 검체로는 혈액, 모근, 구강상피세포 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한편 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자라면 필요에 따라 PCR 증폭에 사용되는 시료를 선택하여 사용할 수 있음은 자명하다.
본 발명의 실시예에서는 검체를 직접 이용하는 방법을 선택하였으며, 정상 유전자 혈액, 이형접합자 변이 유전자 혈액, 동형 접합자 변이 유전자 혈액을 직접 시료로 사용하였다.
<실시예 2> 프라이머 제작
아벨리노 각막이상증 및 124번 아르지닌(arginine)연관 변이에 의한 다른 유형의 각막이상증을 동시에 진단하기 위하여 TGFBI 유전자 124번 아르지닌(arginine)을 포함하는 DNA 시료의 특정 부위를 PCR 증폭한 후 정상 유전자형만 제한효소로 잘릴 수 있도록 PCR 프라이머를 제작하였다.
TGFBI 유전자 124번 아르지닌(arginine)을 포함하는 DNA 시료의 특정 부위는 도 2에 나타난 것과 같이 TGFBI 유전자상의 124번 아르지닌(arginine)을 포함하는 엑손(exon) 4번과 양쪽의 인트론(intron)부위의 염기 서열을 포함한다.
한편 PCR로 증폭되는 DNA 부위는 TGFBI유전자형이 제한효소에 의해 절단된 후 전기영동 상에서 구분이 될 수 있도록 유전자 변이 검출에 적절한 크기가 되어야 하므로, 본 발명에서는 전체 크기를 800 bp로 하고 제한효소에 의해 300 bp 와 500 bp로 절단되도록 PCR로 증폭되는 DNA 부위를 설정하였다.
도 2는 본 발명에 사용한 124번 아르지닌(arginine)이 위치한 엑손(exon) 4번 부위와 양쪽 인트론(intron)부위를 포함한 800 bp의 PCR증폭 산물 부위를 나타내고 있다.
구체적으로 본 발명에서는 TGFBI 유전자 PCR산물이 제한효소로 절단되면 도 3 (a)에 도시된 예상 결과처럼, 상위 밴드가 500bp, 하위 밴드가 300bp의 크기로 절단되어 분리된 전기영동 패턴을 보이고, 124번 아르지닌(argignine)이 돌연변이가 발생한 경우 제한효소에 의해서 절단 이루어지지 않고 800bp의 밴드가 보일 수 있도록 프라이머를 제작하였다.
본 발명의 TGFBI 유전자 124번 아르지닌(arginine)의 변이에 의해서 발병하는 각막이상증 유전자 진단을 위해 개발된 프라이머 세트는 하기와 같다.
[TGFBI 유전자 증폭용 PCR 프라이머 세트]
서열번호 1: forward 프라이머: 5'-ATTACCTGCAAATACACACAGTACTTTG-3'
서열번호 2: reverse 프라이머: 5'-CAAGTCTTTCTGCCCAGTAGGGAAC-3'
본 발명의 실시예에서는 PCR증폭 산물 부위의 크기를 124번 아르지닌(arginine)이 위치한 엑손(exon) 4번 부위와 양쪽 인트론(intron)부위를 포함한 800 bp로 설정하도록 프라이머 세트를 개발하였으나 이에 한정되지 않으며, 이 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진자라면 필요에 따라 PCR증폭 산물 부위의 크기를 실시예와 다르게 설정하도록 프라이머 세트를 개발할 수 있음은 자명하다.
<실시예 3> PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭
상기 프라이머 세트를 제작한 후 이 프라이머 세트를 이용하여 실시예 1에서 추출한 시료를 PCR증폭 하였다. 프라이머는 최종적으로 100pmole/㎕의 농도로 증류수로 희석하여 사용하였다. PCR은 총량 20㎕ (증류수 15.6㎕, dNTP(10mM) 0.5㎕, Advantage중합효소 (Clontech사) 0.4㎕, 10X Adavantage 중합효소 완충용액 2㎕, 서열번호 1 포워드 프라이머 0.5 ㎕, 서열번호 2 리버스 프라이머 0.5 ㎕, 시료 혈액 0.5㎕)를 이용하였다.
PCR 수행은 최초 변성을 95℃, 2분간 실시한 후, 변성은 95℃에서 30초, 어닐링 60℃에서 30초, 신장 72℃에서 1분으로 하고, 34번의 반복cycle을 수행한 후, 마지막 신장을 72℃에서 2분간 수행하였다.
도 3 (b)의 전기영동 영상 중 좌측 'PCR증폭' 부분은 실제 목적 TGFBI 유전자 부위 PCR 증폭 산물의 실제 전기영동 결과를 보여준다. 좌측의 PCR증폭 결과는 상기의 실시예 2의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 것으로서 PCR산물은 정상, 이형접합자 변이 및 동형접합자 변이 모두에서 동일한 800bp의 증폭 산물을 보이고 있다.
<실시예 4> 제한효소 처리
PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭된 DNA를 제한효소를 이용하여 자르는 작업을 수행하였다. 구체적으로 실시예 3에서 증폭된 PCR산물에 RsrII 제한효소를 이용하여 제한효소 제조사의 프로토콜에 따라 제한효소 처리를 실시하였다.
제한효소는 RsrII (New England Biolabs. Inc, Hertfurdshire, Massachusetts, USA)를 이용하여 하기와 같은 조건에서 제한효소 처리를 하였다. 본 발명에서 제시한 Rsr II 제한효소는 타사의 어떠한 RsrII 제품 또는 RsrII의 동일전달제한효소(Isoschizomers, 예, CpoI, CspI, Rsr2I) 에 대해서도 유효하다.
도 1은 TGFBI 유전자 124번 아르지닌(arginine)부위를 포함하는 일부의 염기서열 안의 RsrII 제한효소의 특이적 인식부위(CGGWCCG)를 나타낸 것이다. 본 발명에서 제시한 TGFBI의 PCR증폭부위 염기서열중 아미노산 122번 Threonine(T), 123번 Aspartic Acid(D) 124번 arginine(R)을 코드하는 염기서열, ACG GAC CGC가 RsrII의 특이적 인식부위에 해당된다. 따라서 정상 TGFBI 유전자의 경우 RsrII에 의해서 유전자가 절단되지만, 124번 아르지닌을 코드하는 CGC가 CAC(histidine)로 변이가 발생한 경우나, CGC→ CTC(Leucine), CGC→ TGC(cysteine), 또는 CGC→ AGC(serine)로 변이가 발생한 경우 제한효소는 해당 염기서열을 인식하지 못하여 유전자가 절단되지 않는다. 이에 따라 제한효소 처리 후 유전자의 크기(size)를 분석하면 TGFBI 변이 여부를 검출할 수 있게 된다. 여기서 W는 어떤 염기 서열이 와도 관계없이 Rsr II 제한효소가 인식함을 나타낸다.
제한 효소 처리는, PCR 증폭 산물 5㎕, 10X 제한효소 완충용액 2㎕, RsrII 제한효소(10unit/㎕) 0.2㎕,증류수 12.8㎕를 첨가하여, 37℃에서 2시간 반응하였다.
동일전달제한효소(Isoschizomer)를 사용하여 제한 효소 처리를 할 경우에는 제한효소 제조사의 프로토콜에 따라 제한효소 처리를 실시하면 된다. 예를 들면 Themoscientific사의 Cpo I 및 Vivantis사 Rsr 2I 의 경우 제한 효소 처리는 상기 Rsr II로 처리 시와 동량을 첨가하여 반응 온도 37℃에서 2시간 반응하며, Clontech사 Cpo I 제품을 사용 할 경우 상기 Rsr II로 처리 시와 동량을 첨가하여 반응 온도 30℃에서 2시간 반응한다.
<실시예 5> 전기영동 분석
실시예 4에서 RsrII 제한효소 처리한 산물에 대하여 1.5 % 아가로스겔을 이용한 전기영동을 통해 크기 차이를 보이는 DNA 밴드를 확인하였다.
도 3은 도 2에 표시된 부위를 PCR(중합효소 연쇄반응, Polymerase Chain Reaction)을 통하여 증폭된 TGFBI 유전자 산물의 예상 size 및 RsrII 제한 효소 처리 후의 예상되는 절단 절편의 크기(도 3 (a)) 및 실시예 3의 PCR증폭 산물과 실시예 4의 제한효소 처리 산물의 실제 전기영동 결과(도 3 (b))를 나타내고 있다.
제한효소 처리 후 예상되는 전기영동 결과를 나타내는 도 3 (a)를 살펴보면, 정상인 유전자는 제한효소에 의하여 500bp와 300bp의 절단 산물로 나타날 것이고, 124번 아르지닌(arginine, R)의 동형접합자 변이인 경우는 증폭된 PCR산물이 제한효소에 의해 절단이 전혀 이루어지지 않아 800bp산물이 그대로 남아 있을 것이고, 이형접합자 변이의 경우는 500bp 와 300bp절단 산물외에 800bp의 미절단 산물도 남아 있을 것으로 예상된다.
도 3 (b)는 실시예 3의 TGFBI 유전자 부위 PCR증폭 산물과 실시예 4의 RsrII 제한효소 처리 산물의 실제 전기영동 결과를 보여준다. 좌측의 PCR 증폭 산물은 상기의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 것으로서 PCR산물은 정상, 이형접합자 변이 및 동형접합자 변이 모두에서 동일한 800bp의 크기를 보이고 있다. 우측의 RsrII 제한효소 처리 산물은 예상했던 결과처럼, 정상인 유전자의 경우 확연하게 500bp와 300bp의 절단 산물로 분리된 것으로 나타났고, 124번 아르지닌(arginine, R)의 동형접합자 변이인 경우는 증폭된 PCR산물이 RsrII 제한효소에 의해 전혀 절단이 이루어지지 않아 800bp산물 그대로 남아 있음을 알 수 있다. 한편, 이형접합자 변이의 경우는 500bp 와 300bp절단 산물 외에도 800bp의 미절단 산물이 확연하게 나타나는 결과를 얻었다.
M: 레인(크기 마커) WT: 정상 유전자
Hetero: 이형접합자 변이 Homo: 동형접합자 변이
Hetero: 이형접합자 변이 Homo: 동형접합자 변이
<110> Watson RnD Co. LTD
<120> Detection Method of Corneal Dystrophies caused TGFBI mutations
using Polymerase Chain Reaction and RsrII Restriction Enzyme
Digestion
<130> SS-0001
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
attacctgca aatacacaca gtactttg 28
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
caagtctttc tgcccagtag ggaac 25
Claims (3)
- (1) PCR 증폭을 위하여 검체를 직접 이용하거나 검체로부터 DNA 시료를 추출하는 단계;
(2) 프라이머 세트를 이용하여 TGFBI 유전자 부위를 포함하는 DNA 부위를 증폭하기 위한 PCR을 수행하는 단계;
(3) 상기 (2)단계의 PCR 산물에 RsrII 제한효소 또는 이의 동일전달제한효소(Isoschizomers)를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 및 제한효소를 이용한 각막이상증 분자 진단 방법.
- 제1항에 있어서,
(4) 상기 (3) 단계에서 얻은 산물의 크기를 분석하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 및 제한효소를 이용한 각막이상증 분자 진단 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 PCR 및 제한효소를 이용한 각막이상증 분자 진단 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020190054102A KR20200129539A (ko) | 2019-05-09 | 2019-05-09 | Pcr 및 제한효소를 이용한 각막이상증 분자 진단 방법. |
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Publications (1)
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|---|---|
| KR20200129539A true KR20200129539A (ko) | 2020-11-18 |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20070076532A (ko) | 2006-01-18 | 2007-07-24 | 메디제네스(주) | 각막이영양증 진단용 ｄｎａ 칩 |
| KR20100115030A (ko) | 2009-04-17 | 2010-10-27 | (주)아벨리노 | 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머 |
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2019
- 2019-05-09 KR KR1020190054102A patent/KR20200129539A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
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| KR20100115030A (ko) | 2009-04-17 | 2010-10-27 | (주)아벨리노 | 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머 |
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