KR20160079117A - 안과 질환과 관련된 대립유전자의 멀티플렉스 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
인간 대상으로부터의 샘플에서 각막 이영양증과 관련된 적어도 2개의 게놈 대립유전자를 검출하기 위한 시스템 및 방법이 개시되어 있으며, 여기서 대상의 세포(예컨대, 상피 세포)는 기재의 팁에 부착되어 있다. 상기 기재의 팁은 상기 기재에 부착된 세포를 용해시키는 용해액 중에서 교반한다. 상기 기재는 이 교반이 완료되면 용해액으로부터 분리한다. 얻어진 용해액을 인큐베이션한 다음, 상기 용해액으로부터 게놈 DNA를 단리하여 gDNA 용액을 형성한다. 이로부터, 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 및 gDNA 용액을 이용하여, 인간 TGFβI 유전자 내에 존재하는 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 정체(identity)가 확인된다. 이들 적어도 2개의 뉴클레오타이드는, 각막 이영양증과 관련된 각각의 독립적인 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 상응하는 TGFβI 유전자의 각각의 독립적인 위치에 위치한다.
Description
본원은 일반적으로 질환과 관련된 유전적 대립유전자의 단리 및 검출 방법에 관한 것이다. 특히, 본원은 아벨리노 각막 이영양증(Avellino corneal dystrophy) 관련 대립유전자의 검출을 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
실시간 PCR은 실질적으로 동일한 서열을 갖는 핵산 서열 간의 차이를 검출하는 데 사용될 수 있다. 서로 다르게 표지된 형광성 핵산 프로브, 예를 들면 야생형 서열에 결합하는 프로브 및 돌연변이 서열에 결합하는 프로브의 사용을 통해, 인간 게놈 내의 단일 뉴클레오타이드 변화는 빠르고 신뢰성 있게 검출될 수 있다. 이러한 분해능은 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP), 즉, 단백질의 코딩 및/또는 비코딩 서열 내에서 발견되는 단일 염기 변화가 인간 질환과 관련된, 의료 진단에 적용되어 왔다.
그러나, 실시간 PCR 분석은 고품질 샘플의 수집 및 단리에 크게 의존한다. 불량한 샘플 수집 및/또는 단리는 더 긴 분석 조건 및 더 많은 양의 실시간 PCR 시약의 사용을 요구하며, 이 둘은 비용 증가 및 생산성 저하를 야기한다. 더욱이, 실시간 PCR 단일 뉴클레오타이드 다형성 검출 분석이 실패하는 경우 추가적인 샘플을 수집할 필요가 있으며, 이는 시간 및 자원에서 훨씬 더 큰 손실을 유발할 수 있다.
따라서, 분석의 전체적인 성공률을 개선하고, 분석에 필요한 시약을 줄이고, 나중에 추가적인 샘플을 수집할 필요성을 줄이는, 개선된 샘플 수집 및 단리를 야기하는 방법이 매우 바람직하다. 더욱이, 소량의 샘플 물질로 실시간 PCR SNP 검출 분석을 수행하는 방법은 또한 고품질 샘플의 수집 및 단리와 연관된 난제를 감소시킬 것이다.
각막 이영양증은 상염색체 우성 유전 질환일 수 있으며, 이는 초기에는 환자의 각막의 중심에서 시야 흐림(blurred vision)을 야기한다. 상기 시야 흐림은 점차 각막의 주변부로 확산되어, 환자가 나이가 들어감에 따라 시력을 악화시킨다. 아벨리노 각막 이영양증(Avellino corneal dystrophy), 과립형 각막 이영양증(Granular corneal dystrophy), 래티스 타입 I 각막 이영양증(lattice type I corneal dystrophy), 티엘벵케(Thiel-Behnke), 및 레이스버클러스 각막 이영양증(Reis-bucklers corneal dystrophy)을 포함하는, 몇 가지 유형의 각막 이영양증이 규명되었다. 각막 이영양증은, 적어도 일부 경우, βIG-H3 단백질(TGFβI 단백질, TGFβI 단백질, 및 케라토에피텔린(keratoepithelin)으로도 알려짐)을 인코딩하는 형질전환 성장인자 베타 유도된(TGFβI) 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다.
아벨리노 각막 이영양증을 겪는 이형접합형 환자는 나이가 들어감에 따라 점차 시력이 상실하여 인생 말년에는 심각해진다. 이와 달리, 동종접합성 환자는 6세에 심각하거나 완전한 시력 상실을 나타낸다. 아벨리노 각막 이영양증은 1988년경에 하나의 구별되는 유형의 각막 이영양증으로서 최초로 인식되었다. 그 이전에는, 아벨리노 각막 이영양증은 아마도 과립형 각막 이영양증으로서 잘못 분류되었다. 오늘날, 아벨리노 각막 이영양증은 전세계적으로 가장 흔한 형태의 간질 각막 이영양증인 것으로 알려져 있다. 한국에서, 아벨리노 각막 이영양증은 870명당 약 1명꼴로 발생하는 것으로 여겨진다(Lee, J. H. et al., Ophthalmic Epidemiol., 17:160, 2010; see also Holland, E. J. et al., Ophthalmology, 99:1564, 1992; Kennedy, S. M. et al., Br. J. Ophthalmol., 80:489, 1996; Dolmetsch, A. M. et al., Can. J. Ophthalmol., 31:29, 1996; Afshari, N. A. et al., Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001; Stewart, H. S. Hum. Mutat., 14:126, 1999 참고).
이전에, 이형접합형 개인(예컨대, 하나의 야생형 βIG-H3 대립유전자 및 하나의 돌연변이 βIG-H3 대립유전자를 갖는 이형접합형 개인)은 라식 수술 후 가속화되는 시력 손실에 매우 민감한 것으로 발견되었다. 주목할만하게도, 수술 2년 후에, 이들 환자에서 공격성 증가와 함께 각막 혼탁 증가가 관찰되었고, 이는 결국 완전한 시력 상실을 야기하였다(Jun, R. M. et al., Opthalmology , 111:463, 2004). 이전에, 라식 또는 엑시머 레이저 수술이 각막 이영양증을 겪는 환자의 시야 흐림을 제거할 것이라는 기대감으로 눈 수술이 수행되어 왔다. 30만건의 가상적인 수의 라식 수술에 대해, 아벨리노 각막 이영양증을 겪는 이형접합형 환자의 1/1000의 최소 추정에 기초하여, 300명이 시력을 잃을 것이다. 라식 수술을 한 환자들은 주로 생산적인 활동을 하는 20대와 30대이므로, 이들의 시력 상실은 사회 및 경제 모두에 심각한 문제를 야기한다.
또한, 미국에서 2000년에 라식 수술이 승인된 후, 라식 수술을 한 아벨리노 각막 이영양증을 겪는 아프리카계 미국인 환자들이 시력을 잃은 것으로 나타났고, 이는 많은 비슷한 사례가 전 세계적으로 일어나고 있을지도 모른다는 것을 암시한다.
그러므로, 라식 수술에 의한 아벨리노 각막 이영양증의 진행을 예방하기 위하여 아벨리노 각막 이영양증의 정확한 진단이 요구됨에도 불구하고, 아벨리노 각막 이영양증의 진단은 단지 각막 혼탁의 현미경 관찰(예컨대, 세극등 검사(slit-lamp examination))에 의해서 수행되므로 종종 의사들은 라식 수술을 수행하는 환자의 잠재적인 증상을 놓쳐 시력 상실을 야기한다. 그러므로, 각막 이영양증의 신속하고 정확한 유전적 진단이 바람직하다.
아벨리노 각막 이영양증의 원인이 되는 βIG-H3 유전자에서의 돌연변이를 검출하기 위한 DNA 칩이 개발되었다(대한민국 출원공보 제10-2007-0076532호). 그러나, DNA 칩을 이용한 아벨리노 각막 이영양증의 진단은 불리하게도 샘플 내의 DNA를 증폭시키는 단계, 증폭된 DNA를 DNA 칩과 혼성화시키는 단계, 혼성화된 DNA 칩을 세척하는 단계, 및 양성 반응을 검출하는 단계를 포함하는, 몇 가지 단계를 필요로 한다.
상기 배경기술을 고려해 볼 때, 각막 이영양증과 관련된 다수의 돌연변이된 대립유전자를 검출하는 개선된 방법이 본 기술분야에서 요구된다.
본 개시내용은 인간 질환과 관련된 하나 이상의 대립유전자를 검출하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 하기 기재된 방법은 대상에 관한 의료 정보를 내놓는 분석들을 수행하는 것과 연관된 시간 및 비용을 줄인다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 상기 개선된 방법은 환자에게 감소된 비용으로, 아벨리노 각막 이영양증과 관련된 게놈 마커의 당일 검출을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 대상으로부터의 샘플에서 각막 이영양증과 관련된 적어도 2개의 게놈 대립유전자를 검출하는 방법을 제공한다: (A) 기재(substrate)의 팁에 부착된, 대상의 상피 세포를 제공하는 단계; (B) 상기 기재의 팁을, 상기 기재에 부착된 세포를 용해시키는 용해액 중에서 교반(agitate)하는 단계; (C) 상기 교반(B)이 완료되면, 용해액으로부터 기재를 분리하는 단계; (D) 상기 분리(C) 후, 상기 용해액을 인큐베이션하는 단계; (E) 상기 용해액으로부터 게놈 DNA를 단리하여 gDNA 용액을 형성하는 단계; 및 (F) 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 및 상기 gDNA 용액을 이용하여 TGFβI 유전자 내에 존재하는 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 정체(identity)를 확인하는 단계로서, 여기서 상기 적어도 2개의 뉴클레오타이드는, 각막 이영양증과 관련된 각각의 독립적인 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 상응하는, TGFβI 유전자의 각각의 독립적인 위치에 위치한다.
일부 구현예에서, 상기 TGFβI 유전자 내에 존재하는 적어도 2개의 뉴클레오타이드는 인간 게놈에서 적어도 1개의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 중 적어도 한 쌍은 서열번호: 1을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호: 2를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 역방향 PCR 프라이머를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 중 적어도 한 쌍은 서열번호: 43을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호: 44를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 역방향 PCR 프라이머를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍은 제1 증폭 프라이머쌍 및 제2 증폭 프라이머쌍을 포함한다. 상기 제1 증폭 프라이머쌍은 서열번호: 1을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호: 2를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 역방향 PCR 프라이머를 포함한다. 상기 제2 증폭 프라이머쌍은 서열번호: 43을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호: 44를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 역방향 PCR 프라이머를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 확인 단계(F)는 하기를 이용하는 것을 추가로 포함한다: (i) 서열번호: 25를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 제1 야생형 검출 프로브 및 서열번호: 26, 서열번호: 48, 또는 서열번호: 49를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 제1 돌연변이 검출 프로브; 및 (ii) 서열번호: 45 또는 서열번호: 47을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 제2 야생형 검출 프로브 및 서열번호: 46 또는 서열번호: 50을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 제2 돌연변이 검출 프로브.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 각막 이영양증을 검출하는 방법을 제공한다: (A) 적어도 제1 증폭 프라이머쌍 및 적어도 제2 증폭 프라이머쌍을 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 인간 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터, 아미노산 잔기 124를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 TGFβI 유전자 서열 및 아미노산 잔기 555를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 TGFβI 유전자 서열을 포함하는, 적어도 2개의 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키는 단계; (B) 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍의 제1 검출 프로브를 상기 제1 TGFβI 유전자 서열에 혼성화시키는 단계; (C) 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍의 제2 검출 프로브를 상기 제2 TGFβI 유전자 서열에 혼성화시키는 단계; 및 (D) 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍을 포함하는, 적어도 2개의 검출 프로브쌍의 사용에 기초하여 상기 제1 TGFβI 유전자 서열 및/또는 상기 제2 TGFβI 유전자 서열 내의 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 단계.
일부 구현예에서, 상기 제1 TGFβI 유전자 서열 및/또는 상기 제2 TGFβI 유전자 서열 내의 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 것은 상기 제1 TGFβI 유전자 서열 및/또는 상기 제2 TGFβI 유전자 서열 내의 2개 이상의 돌연변이를 검출하는 것을 포함하고, 상기 2개 이상의 돌연변이는 인간 게놈에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 제1 증폭 프라이머쌍은 제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제1 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 1을 포함하고, 상기 제2 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 2를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 제2 증폭 프라이머쌍은 제3 증폭 프라이머 및 제4 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제3 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 43으로 표시되고, 상기 제4 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 44로 표시된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 증폭 프라이머쌍은 제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제1 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 1을 포함하며, 상기 제2 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 2를 포함하며, 상기 제2 증폭 프라이머쌍은 제3 증폭 프라이머 및 제4 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제3 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 43을 포함하며, 상기 제4 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 44를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 돌연변이 중 하나는, 인코딩된 TGFβI 단백질 내에서, 아미노산 124에서, 시스테인으로 돌연변이된 아르기닌(R124C), 히스티딘으로 돌연변이된 아르기닌(R124H), 및/또는 류신으로 돌연변이된 아르기닌(R124L)에 상응한다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 돌연변이 중 하나는, 인코딩된 TGFβI 단백질 내에서, 아미노산 555에서, 트립토판으로 돌연변이된 아르기닌(R555W) 및/또는 글루타민으로 돌연변이된 아르기닌(R555Q)에 상응한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍 각각은 개별적으로 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 서열번호: 25-26, 서열번호: 25 및 48, 서열번호: 25 및 49, 서열번호: 27-28, 서열번호: 29-30, 서열번호: 31-32, 서열번호: 33-34, 서열번호: 35-36, 서열번호: 37-38, 서열번호: 39-40, 서열번호: 41-42, 서열번호: 45-46 및 서열번호: 46-47, 서열번호: 45 및 50, 및 서열번호: 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 뉴클레오타이드 서열쌍을 포함한다
일부 구현예에서, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 26을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 45 및 서열번호: 46을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 47 및 서열번호: 46을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 48을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 49를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 45 및 서열번호: 50을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 47 및 서열번호: 50을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 검출 프로브는 제1 표지와 커플링되고 상기 제2 검출 프로브는 제2 표지에 커플링된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 표지는 VIC이고 상기 제2 표지는 FAM이다.
일부 구현예에서, 상기 혼성화 단계(B)와 상기 혼성화 단계(C)는 동일한 중 용액에서 동시에 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 혼성화 단계(B)와 상기 혼성화 단계(C)는 동일한 용액 또는 상이한 용액 중에서 동시에 또는 상이한 시점에 수행된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 인간 대상에서 각막 이영양증을 검출하기 위한 반응 혼합물을 제공한다: (A) (1) 상기 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 아미노산 잔기 124를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 2개의 TGFβI 유전자 서열 중 제1 TGFβI 유전자 서열을, 그리고 (2) 상기 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 아미노산 잔기 555를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 2개의 TGFβI 유전자 서열 중 제2 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키고 결정하기 위한 적어도 제1 증폭 프라이머쌍 및 제2 증폭 프라이머쌍; 및 (B) 적어도 2개의 검출 프로브쌍, 여기서 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 각각에서의 검출 프로브는 적어도 2개의 TGFβI 유전자 서열 중 적어도 하나에 혼성화한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 증폭 프라이머쌍은 제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제1 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 1을 포함하며, 상기 제2 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 2를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 증폭 프라이머쌍은 제3 증폭 프라이머 및 제4 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제3 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 43을 포함하며, 상기 제4 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 44를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 적어도 하나는, 인코딩된 TGFβI 단백질 내에서, 아미노산 124에서, 시스테인으로 돌연변이된 아르기닌(R124C), 히스티딘으로 돌연변이된 아르기닌(R124H), 및/또는 류신으로 돌연변이된 아르기닌(R124L)에 상응하는 돌연변이를 검출하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 적어도 하나는, 인코딩된 TGFβI 단백질 내에서, 아미노산 555에서, 트립토판으로 돌연변이된 아르기닌(R555W) 및/또는 글루타민으로 돌연변이된 아르기닌(R555Q)에 상응하는 돌연변이를 검출하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 각각의 검출 프로브는 개별적으로 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 서열번호: 25-26, 서열번호: 25 및 48, 서열번호: 25 및 49, 서열번호: 27-28, 서열번호: 29-30, 서열번호: 31-32, 서열번호: 33-34, 서열번호: 35-36, 서열번호: 37-38, 서열번호: 39-40, 서열번호: 41-42, 서열번호: 45-46 및 서열번호: 46-47, 서열번호: 45 및 50, 및 서열번호: 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 뉴클레오타이드 서열쌍을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 26을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 45 및 서열번호: 46을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 47 및 서열번호: 46을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 48을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 49를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 45 및 서열번호: 50을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 여기서 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 47 및 서열번호: 50을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브 중 제1 검출 프로브는 제1 표지와 커플링되고 상기 적어도 2개의 검출 프로브 중 제2 검출 프로브는 제2 표지에 커플링된다.
일부 구현예에서, 상기 제1 표지는 VIC이고, 상기 제2 표지는 FAM이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 인간 대상에서 각막 이영양증을 검출하기 위한 반응 혼합물을 제공한다: (A) 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키고 결정하기 위한 적어도 제1 증폭 프라이머쌍; 및 (B) 적어도 3개의 검출 프로브의 세트, 여기서 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 중 하나의 검출 프로브는 TGFβI 유전자 서열에 노출될 때 TGFβI 유전자 서열에 혼성화한다.
일부 구현예에서, 상기 TGFβI 유전자 서열은 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 아미노산 잔기 124를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 25-42 및 48-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 25-42 및 48-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상의 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 25-42 및 48-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개 이상의 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 제1 검출 프로브 서열번호: 25 및 제2 검출 프로브 서열번호: 26을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 48 및 서열번호: 49로 이루어진 군으로부터 선택되는 제3 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는, 제3 검출 프로브와 다르며 서열번호: 48 및 서열번호: 49로 이루어진 군으로부터 선택되는 제4 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 26 및 48-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 증폭 프라이머쌍은 제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제1 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 1을 포함하며, 상기 제2 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 2를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 반응 혼합물은 하기를 추가로 포함한다: (C) 생물학적 샘플로부터 제2 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키고 결정하기 위한 적어도 제2 증폭 프라이머쌍; 및 (D) 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트, 여기서 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트 중 하나의 검출 프로브는 제2 TGFβI 유전자 서열에 노출될 때 제2 TGFβI 유전자 서열에 혼성화한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 TGFβI 유전자 서열은 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 아미노산 잔기 555를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상의 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개 이상의 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트는 서열번호: 45 또는 서열번호: 47인 제1 검출 프로브, 서열번호: 46인 제2 검출 프로브, 및 서열번호: 50인 제3 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 증폭 프라이머쌍은 제3 증폭 프라이머 및 제4 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제3 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 43을 포함하며, 상기 제4 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 44를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 TGFβI 유전자 서열은 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 아미노산 잔기 555를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상의 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개 이상의 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 45 또는 서열번호: 47인 제1 검출 프로브, 서열번호: 46인 제2 검출 프로브, 및 서열번호: 50인 제3 검출 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 각막 이영양증을 검출하는 방법을 제공한다: (A-1) 적어도 제1 증폭 프라이머쌍 및 적어도 3개의 검출 프로브의 세트를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 인간 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 제1 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키는 단계; (B-1) 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 중 제1 검출 프로브를 상기 제1 TGFβI 유전자 서열에 혼성화시키는 단계; 및 (C-1) (i) 상기 제1 TGFβI 유전자 서열에 대한 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 중 제1 검출 프로브의 혼성화, 및 (ii) 상기 제1 TGFβI 유전자 서열에 대한 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 중 제2 및 제3 검출 프로브의 혼성화 실패에 기초하여, 상기 제1 TGFβI 유전자 서열 내의 돌연변이를 검출하는 단계.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: (A-2) 동일한 반응 혼합물을 이용하여 생물학적 샘플로부터 제2 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키는 단계로서, 여기서 상기 반응 혼합물은 적어도 제2 증폭 프라이머쌍 및 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트를 포함하며; (B-2) 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트 중 제1 검출 프로브를 상기 제2 TGFβI 유전자 서열에 혼성화시키는 단계; 및 (C-2) (i) 상기 제1 TGFβI 유전자 서열에 대한 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트 중 제1 검출 프로브의 혼성화, 및 (ii) 상기 제2 TGFβI 유전자 서열에 대한 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트 중 제2 검출 프로브 및 제3 검출 프로브의 혼성화 실패에 기초하여 상기 제2 TGFβI 유전자 서열 내의 돌연변이를 검출하는 단계.
일부 구현예에서, 증폭 단계(A-1), 증폭 단계(A-2), 혼성화 단계(B-1), 혼성화 단계(B-2), 검출 단계(C-1), 및 검출 단계(C-2)는 생물학적 샘플의 동일한 분취량을 이용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 제1 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키는 것(A-1) 및 제2 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키는 것(A-2)는 동시에 수행된다.
일부 구현예에서, 혼성화 단계(B-1) 및 혼성화 단계(B-2)는 동시에 수행된다.
일부 구현예에서, 검출 단계(C-1) 및 검출 단계(C-2)는 동시에 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 반응 혼합물은 상기 기재된 특징 중 일부를 갖는다. 간결성을 위해, 상기 세부사항은 본원에서 반복되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 인간 대상에서 이형접합형 각막 이영양증의 검출을 통해 대상에서 레이저 눈 수술에 따른 합병증의 위험을 예측하기 위한, 상기 어느 곳에 언급된 반응 혼합물의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 레이저 눈 수술은 라식 및 엑시머 레이저 수술 중 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 인간 대상으로부터의 샘플에서 각막 이영양증과 관련된 게놈 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다: (A) 기재의 팁에 부착된 인간 대상의 상피 세포를 제공하는 단계; (B) 상기 기재의 팁을, 상기 기재에 부착된 세포를 용해시키는 용해액 중에서 교반하는 단계; (C) 상기 교반(B)이 완료되면, 상기 용해액으로부터 기재를 분리하는 단계; (D) 상기 분리(C) 후, 상기 용해액을 인큐베이션하는 단계; (E) 상기 용해액으로부터 게놈 DNA를 단리하여 gDNA 용액을 형성하는 단계; 및 (F) 상기 gDNA 용액을 적어도 3개의 검출 프로브에 동시에 노출시킴으로써 적어도 제1 프라이머쌍, 적어도 3개의 검출 프로브의 세트, 및 상기 gDNA 용액을 이용하여 TGFβI 유전자 내에 존재하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 정체를 확인하는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드는, 각막 이영양증과 관련된 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 상응하는, TGFβI 유전자의 특정 위치에 위치하며, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 중 적어도 2개의 검출 프로브 각각은 TGFβI 유전자의 특정 위치에 상이한 돌연변이를 검출하도록 구성된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: (G) 상기 gDNA 용액을 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 및 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트에 동시에 노출시킴으로써 적어도 제2 프라이머쌍, 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트, 및 gDNA 용액을 이용하여 TGFβI 유전자 내에 존재하는 적어도 제2 뉴클레오타이드의 정체를 확인하는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 제2 뉴클레오타이드는, 각막 이영양증과 관련된 제2 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 상응하는, TGFβI 유전자의 제2의 특정 위치에 위치하며, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트 중 적어도 2개의 검출 프로브는 TGFβI 유전자의 제2의 특정 위치에 있는 각각의 돌연변이를 검출하도록 구성된다.
일부 구현예에서, 상기 확인 단계(F)와 상기 확인 단계(G)는 동시에 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 확인 단계(F)와 상기 확인 단계(G)는 동일한 gDNA 용액을 이용하여 수행된다.
도 1a-1b는 일부 구현예에 따라, 질환과 관련된 게놈 대립유전자를 검출하는 개선된 방법(100)을 예시한다.
도 2는 일부 구현예에 따라, 아벨리노 각막 이영양증과 관련된 단일 뉴클레오타이드 다형성의 실시간 PCR 검출에 유용한 정방향 및 역방향 PCR 프라이머쌍의 서열목록(서열번호: 1-24)을 제공한다.
도 3은 일부 구현예에 따라, 아벨리노 각막 이영양증과 관련된 단일 뉴클레오타이드 다형성의 실시간 PCR 검출에 유용한 야생형 및 돌연변이 검출 프로브쌍의 서열목록(서열번호: 25-42)을 제공한다.
도 4는 도 5 내지 8에 나타난 대립유전자 검출 실험에서 사용된 프로브 서열 및 프라이머의 목록을 제공한다.
도 5는 도 4에 기술된 프로브를 이용하여 R124C, R124H, R124L, R555W 및 R555Q 돌연변이를 검출하는 것과 관련된 실험 데이터를 제공한다. 도 5a는 표시된 시약 혼합물 및 표시된 사이클링 조건(우측 패널)을 이용한 대립유전자 식별 플롯 실행(좌측 패널)을 제공한다. 도 5b는 정상 대조군과 비교하여 다양한 돌연변이에 대한 실시간 PCR 플롯을 제공한다. 도 5c는 동종접합성 대조군과 비교하여 다양한 돌연변이에 대한 실시간 PCR 플롯을 제공한다.
도 6은 도 4에 기재된 프로브를 이용하여 R124C, R124H, R124L, R555W 및 R555Q 돌연변이를 검출하는 것과 관련된 실험 데이터를 제공한다. 도 6a는 표시된 시약 혼합물 및 표시된 사이클링 조건(우측 패널)을 이용한 대립유전자 식별 플롯 실행(좌측 패널)을 제공한다. 도 6b는 정상 대조군과 비교하여 다양한 돌연변이에 대한 실시간 PCR 플롯을 제공한다. 도 6c는 동종접합성 대조군과 비교하여 다양한 돌연변이에 대한 실시간 PCR 플롯을 제공한다.
도 7은 도 4에 기재된 프로브를 이용하여 R124C, R124H, R124L, R555W 및 R555Q 돌연변이를 검출하는 것과 관련된 실험 데이터를 제공한다. 도 7은 표시된 시약 혼합물 및 표시된 사이클링 조건(우측 패널)을 이용한 대립유전자 식별 플롯 실행(좌측 패널)을 제공한다.
도 8은 도 4에 기재된 프로브를 이용하여 R124C, R124H, R124L, R555W 및 R555Q 돌연변이를 검출하는 것과 관련된 실험 데이터를 제공한다. 특히, 도 8은 표시된 시약 혼합물 및 표시된 사이클링 조건(우측 패널)을 이용한 대립유전자 식별 플롯 실행(좌측 패널)을 제공한다. 상기 대립유전자 식별 플롯(좌측 패널) 내의 표시 "B"는 샘플이 실시간 PCR 분석을 수행하기 전에 용해 버퍼로 전처리되었음을 가리킨다. 상기 대립유전자 식별 플롯(좌측 패널) 내의 표시 "DW-A"는 샘플이 실시간 PCR 분석을 수행하기 전에 증류수로 전처리되었음을 가리킨다. 상이한 샘플 점 주위의 원은, 검출된 대립유전자 각각에 대한, 2개의 매치된 샘플, "B" 및 "DW-A"를 각각 나타내며(좌측 패널 참조); 각 원 안에는 2개의 점이 있으며, 하나는 "B"에 대한 점이고, 하나는 샘플 "DW-A"에 대한 점이다.
도 2는 일부 구현예에 따라, 아벨리노 각막 이영양증과 관련된 단일 뉴클레오타이드 다형성의 실시간 PCR 검출에 유용한 정방향 및 역방향 PCR 프라이머쌍의 서열목록(서열번호: 1-24)을 제공한다.
도 3은 일부 구현예에 따라, 아벨리노 각막 이영양증과 관련된 단일 뉴클레오타이드 다형성의 실시간 PCR 검출에 유용한 야생형 및 돌연변이 검출 프로브쌍의 서열목록(서열번호: 25-42)을 제공한다.
도 4는 도 5 내지 8에 나타난 대립유전자 검출 실험에서 사용된 프로브 서열 및 프라이머의 목록을 제공한다.
도 5는 도 4에 기술된 프로브를 이용하여 R124C, R124H, R124L, R555W 및 R555Q 돌연변이를 검출하는 것과 관련된 실험 데이터를 제공한다. 도 5a는 표시된 시약 혼합물 및 표시된 사이클링 조건(우측 패널)을 이용한 대립유전자 식별 플롯 실행(좌측 패널)을 제공한다. 도 5b는 정상 대조군과 비교하여 다양한 돌연변이에 대한 실시간 PCR 플롯을 제공한다. 도 5c는 동종접합성 대조군과 비교하여 다양한 돌연변이에 대한 실시간 PCR 플롯을 제공한다.
도 6은 도 4에 기재된 프로브를 이용하여 R124C, R124H, R124L, R555W 및 R555Q 돌연변이를 검출하는 것과 관련된 실험 데이터를 제공한다. 도 6a는 표시된 시약 혼합물 및 표시된 사이클링 조건(우측 패널)을 이용한 대립유전자 식별 플롯 실행(좌측 패널)을 제공한다. 도 6b는 정상 대조군과 비교하여 다양한 돌연변이에 대한 실시간 PCR 플롯을 제공한다. 도 6c는 동종접합성 대조군과 비교하여 다양한 돌연변이에 대한 실시간 PCR 플롯을 제공한다.
도 7은 도 4에 기재된 프로브를 이용하여 R124C, R124H, R124L, R555W 및 R555Q 돌연변이를 검출하는 것과 관련된 실험 데이터를 제공한다. 도 7은 표시된 시약 혼합물 및 표시된 사이클링 조건(우측 패널)을 이용한 대립유전자 식별 플롯 실행(좌측 패널)을 제공한다.
도 8은 도 4에 기재된 프로브를 이용하여 R124C, R124H, R124L, R555W 및 R555Q 돌연변이를 검출하는 것과 관련된 실험 데이터를 제공한다. 특히, 도 8은 표시된 시약 혼합물 및 표시된 사이클링 조건(우측 패널)을 이용한 대립유전자 식별 플롯 실행(좌측 패널)을 제공한다. 상기 대립유전자 식별 플롯(좌측 패널) 내의 표시 "B"는 샘플이 실시간 PCR 분석을 수행하기 전에 용해 버퍼로 전처리되었음을 가리킨다. 상기 대립유전자 식별 플롯(좌측 패널) 내의 표시 "DW-A"는 샘플이 실시간 PCR 분석을 수행하기 전에 증류수로 전처리되었음을 가리킨다. 상이한 샘플 점 주위의 원은, 검출된 대립유전자 각각에 대한, 2개의 매치된 샘플, "B" 및 "DW-A"를 각각 나타내며(좌측 패널 참조); 각 원 안에는 2개의 점이 있으며, 하나는 "B"에 대한 점이고, 하나는 샘플 "DW-A"에 대한 점이다.
I. 도입
질환 관련 SNP의 검출은 다양한 의료 상태의 진단 및 예후를 위한 점점 더 중요한 도구가 되고 있다. 예를 들면, TGFβI 유전자의 엑손 4에서의 단일 뉴클레오타이드 변화의 존재는 아벨리노 각막 이영양증과 강한 연관이 있다. 이러한 SNP에 대해 이형접합형인 개인은 라식 수술 후 시력 상실에 대한 위험이 높은 것으로 확인되었다. 라식은 많은 사람들의 삶의 질을 크게 개선하는 의료 수술이지만, G/A TGFβI SNP를 갖는 개인의 경우, 라식은 흔히 4개월 내지 18개월 동안 점진적인 시력 장애를 유발하여, 시력 상실을 야기할 수 있다. 상기 시력 장애는 더 길거나 더 짧은 기간 내에 일어날 수 있다. 다행히도, 라식 수술을 피해야 하는 상기 돌연변이를 갖는 개인을 확인하기 위해 스크리닝이 수행될 수 있다.
본 개시내용은 샘플 단리, 제조, 및 분석을 개선하는 방법의 개발에 적어도 일부 기초한다. 일부 구현예에서, 예를 들면, 분석이 실패하거나 또는 부가적인 추적 시험을 수행할 필요가 있을 때, 환자 샘플의 재사용을 허용하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 이들 개선된 방법은 환자의 구강막으로부터 벗겨낸 세포를 갖는 기재(예컨대, 레이온 팁 또는 면봉)를 실온에서 30-45초 동안(상승된 온도에서 20분 동안 연장된 인큐베이션보다) 용해액에서 조심스레 휘젓는 것을 포함한다. 그리고 나서, 상기 용해액을 45℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 용해를 개선하고 게놈 샘플의 수율을 증가시킨다. 이후, 유리하게도, 상기 레이온 팁 또는 면봉은 재시험을 위해 사용되는 게놈 DNA의 재-단리를 위해 보관될 수 있다(예컨대, 동결되거나 냉동됨).
일부 구현예에서, 본원에 제공된 개선점은 실시간 PCR 검출 분석을 위해 소량의 게놈 DNA 주형의 사용을 통해 제공된다. 일부 구현예에서, 이것은 수행되는 실시간 PCR 사이클의 수를 증가시키고/거나(예컨대, 약 40 사이클로) 95℃에서 3초 변성 사이클 시간을 이용함으로써 달성된다. 유리하게도, 이들 방법에 의해 필요한 샘플량이 줄어들기 때문에, 실시간 PCR 시약에 대한 요구량 역시 줄어든다. 진단 분석에 사용되는 많은 시약들은 특허권이 있기 때문에 비쌀 수 있다. 사용되는 시약의 양을 감소시키는 것은 또한 시약과 관련된 비용을 현저히 감소시킬 수 있다.
이들 개별적인 단계 각각을 수행하기 위한 특정한 조건(예컨대, 샘플 핸들링, 인큐베이션 온도, 반응 부피, 반응 사이클 수, 반응 사이클 시간, 반응 사이클 온도)의 모든 조합이 TGFβI 유전자의 엑손 4에서 발견되는 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP과 같은, 질환 관련 SNP를 검출하기 위한 본원에 기재된 방법을 수행하는 데 사용될 수 있음이 고려된다.
II. 선택된 정의
본원에 사용된 바와 같이 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 본 발명의 어느 하나의 특정한 구현예에 제한하는 것을 의미하는 것이 아니라, 일반적으로 청구항 및 명세서에 기재된 본 발명의 어느 또는 모든 구현예에 적용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥이 달리 명확히 언급하지 않는 한 복수형 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "방법"의 언급은 본원에 기재된 유형의 하나 이상의 방법들, 및/또는 단계들을 포함하며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 본 기술분야의 숙련가에게 자명해질 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다형성(polymorphism)" 및 이의 변형은 상이한 게놈 또는 개인 간에 또는 중에서 2개 이상의 대체 게놈 서열 또는 대립유전자의 존재를 가리킨다. 용어 "유전적 돌연변이" 또는 "유전적 변이" 및 이의 변형은 다형성을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "단일 뉴클레오타이드 다형성"("SNP") 및 이의 변형은 대립유전자 간에 다른 하나의 뉴클레오타이드의 부위를 가리킨다. 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)은 단일 염기 변화 또는 점 돌연변이이지만, 개인 간에 유전적 변이를 야기하는 이른바 "인델" 돌연변이(뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실)도 포함한다. 모든 인간 유전적 변이의 약 90%를 차지하는 SNP는 30억-염기 인간 게놈 사이에 100 내지 300 염기마다 일어난다. 그러나, SNP는 바이러스와 같은 다른 유기체에서 훨씬 더 빈번하게 일어날 수 있다. SNP는 게놈의 코딩 또는 비코딩 영역에서 일어날 수 있다. 코딩 영역에서의 SNP는 단백질 산물의 아미노산 서열을 변화시키거나 변화시키지 않을 수 있다. 비코딩 영역에서의 SNP는 프로모터 또는 처리 부위를 변화시킬 수 있고, 유전자 전사 및/또는 처리에 영향을 미칠 수 있다. 개인이 관심있는 게놈 영역 내에 특정한 SNP를 갖는지에 관한 지식은 다양한 질환에 대한 진단적, 예방적 및 치료적 적용을 개발하기 위한 충분한 정보를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 아벨리노 각막 이영양증과 관련된 TGFβI 유전자의 엑손 4에 위치한 구아닌에서 아데닌으로의 SNP(guanine-to-adenine SNP)의 검출에 관한 것이다.
용어 "프라이머" 및 이의 변형은 PCR 반응에서 DNA 합성의 개시점으로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 가리킨다. 프라이머는 일반적으로 약 15 내지 약 35 뉴클레오타이드 길이이며, 표적 서열에 상보적인 영역에 혼성화한다.
용어 "프로브" 및 이의 변형(예컨대, 검출 프로브)은 PCR 반응에서 표적 핵산 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 가리킨다. 표적 서열은 분석될 핵산의 영역을 가리키며 관심있는 다형성 부위를 포함한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 대등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있음에도 불구하고, 방법 및 물질의 다양한 구현예가 본원에 구체적으로 기재되어 있다.
III. 샘플 제조
일부 구현예에서, 본 개시내용은 실시간 PCR 단일 뉴클레오타이드 다형성 검출 분석에서 사용되는 게놈 샘플을 단리하는 개선된 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 개선된 방법(100)은 도 1에 개괄된 단계들의 조합을 이용한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 대상으로부터 세포의 샘플을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 환자의 세포 표면을 상기 세포를 기재 상에 가역적으로 고정화할 수 있는 기재와 접촉함으로써 수집된다.
상기 개시된 방법은 다양한 샘플로부터 수득된 다양한 세포 유형에 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 개시된 방법에 사용하기 위한 세포 유형은 비제한적으로 상피 세포, 내피 세포, 결합 조직 세포, 골격 근육 세포, 내분비 세포, 심장 세포, 요 세포, 멜라노사이트, 케라티노사이트, 혈액 세포, 백혈구 세포, 버피 코트, 유모 세포(hair cell)(예컨대, 모근 세포 포함) 및/또는 타액 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 상피 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 피막하-혈관주위(상피 유형 1); 담염(pale)(상피 유형 2); 중간(상피 유형 3); 어둠(상피 유형 4); 미분화(상피 유형 5); 및 거대-수질(상피 유형 6)이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 구강 상피 세포(예컨대, 구강 스왑을 이용하여 수집된 상피 세포)이다. 일부 구현예에서, 상기 개시된 방법에서 사용되는 세포의 샘플은 상기 확인된 세포 유형의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 대상으로부터의 세포의 샘플을 제공하는 것(102)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 상기 세포는 구강 상피 세포이다.
상기 세포 샘플은 대상 세포를 기재에 가역적으로 결합시키는 임의의 다양한 방법에 의해 수집된다. 일부 구현예에서, 상기 기재는 상기 세포를 기재에 가역적으로 결합시키기 위해, 대상의 세포를 함유하는 샘플과의 물리적 상호작용에서 이용된다. 일부 구현예에서, 상기 기재는 상기 세포를 기재에 가역적으로 결합시키기 위해 대상의 몸과의 물리적 상호작용에서 이용된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 구강 세포 샘플이고, 상기 구강 세포의 샘플은 상기 대상의 구강 막(예컨대, 그들의 볼의 내부)을 상기 막으로부터 제거된 세포를 가역적으로 고정화시킬 수 있는 기재와 접촉함으로써 수집된다. 그러한 구현예에서, 사람의 치아를 닦는 것과 동등한 힘(예컨대, 가벼운 양의 힘 또는 압력)으로 스왑을 대상의 내부에 문지른다. 대상의 세포를 기재에 가역적으로 결합시키는 어떠한 방법이 상기 개시된 방법에서 사용하기 위해 고려된다.
일부 구현예에서, 상기 샘플은 유리하게는 비-침습적 방식으로 수집되며, 그와 같이 샘플 수집은 어느 곳에서나 그리고 거의 모든 사람에 의해 달성된다. 예를 들면, 일부 구현예에서 상기 샘플은 의사의 사무실에서, 대상의 집에서, 또는 라식 수술이 수행되거나 수행될 시설에서 수집된다. 일부 구현예에서, 환자, 환자의 의사, 간호사 또는 의사의 보조원 또는 다른 임상 인원이 샘플을 수집한다.
일부 구현예에서, 기재는 세포가 가역적으로 결합되는 다양한 물질 중 어느 것으로 구성된다. 예시적인 기재는 레이온, 면, 실리카, 엘라스토머, 쉘락, 호박, 천연 또는 합성 고무, 셀룰로오스, BAKELITE, NYLON, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴로니트릴, 또는 다른 물질 또는 이의 조합으로 구성된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 기재는 레이온 팁 또는 면봉을 갖는 스왑이다.
이후, 기재의 팁(예컨대, 레이온 스왑 또는 면 스왑의 팁)은 약 10초 내지 60초(1분), 또는 약 20초 내지 60초, 약 20초 내지 약 45초, 또는 약 20초 내지 약 30초, 약 15초 내지 약 60초, 약 15초 내지 약 45초, 또는 약 15초 내지 약 30초, 약 10초 내지 약 60초, 약 10초 내지 약 45초, 또는 약 10초 내지 약 30초, 약 10초 내지 약 15초 또는 약 10초 내지 약 20초 동안 용해액 중에서 교반된다. 일부 구현예에서, 상기 교반은 약 60초 또는 약 1분 동안 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 교반은 1분 미만(예컨대, 60초 미만) 동안 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 교반은 15초, 20초, 30초, 45초, 60초, 90초, 120초 이하 동안 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 교반은 45초 이하 동안 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 교반은 30초 이하 동안 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 교반은 20초 이하 동안 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 교반은 15초 이하 동안 일어난다.
일부 구현예에서, 교반은 용해액에서 기재의 임의의 움직임을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기재의 팁(예컨대, 레이온 스왑 또는 면 스왑의 팁)은, 복수의 구강 세포가 이후 및/또는 차후에 단리를 위해 기재에 부착된 상태를 유지하도록, 용해액에서 부드럽게 움직인다. 용해액에서의 그러한 움직임은 휘젓기 동작, 좌우 동작, 상하 동작 및/또는 디핑(dipping) 동작, 또는 용해액에서 기재의 어떠한 다른 움직임을 포함하며, 이는 일부 구강 세포를 용해액에 분산시키면서 복수의 구강 세포를 상기 팁에 부착된 상태로 유지시킨다.
일부 구현예에서, 상기 교반 단계는 실온, 예를 들면, 약 15℃ 내지 약 30℃, 약 18℃ 내지 약 28℃, 약 18℃ 내지 약 25℃ 또는 약 20℃ 내지 약 25℃의 온도에서 수행된다.
교반 후, 기재(예컨대, 레이온 팁 또는 면봉을 갖는 스왑)가 제거되며, 일부 구현예에서, 재시험 또는 추가(예컨대, 상이한 또는 부가적인) 시험이 요구되는 경우에 이후에 사용하기 위해 보관된다. 일부 구현예에서, 기재(예컨대, 레이온 팁 또는 면봉을 갖는 구강 스왑)는 용기에 넣어 냉동보관된다. 일부 구현예에서, 기재(예컨대, 레이온 팁 또는 면봉을 갖는 구강 스왑)는 냉장된다. 일부 구현예에서, 기재는, 하나 이상의 추가 추출에 여전히 유용한 상태를 유지하면서 임의의 다양한 온도에서 그리고 임의의 다양한 시간 동안 보관된다.
일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 0주, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 이상 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 0주 내지 12주, 1주 내지 12주, 2주 내지 12주, 3주 내지 12주, 4주 내지 o 12주, 5주 내지 12주, 6주 내지 12주, 7주 내지 12주, 8주 내지 12주, 9주, 10주 내지 12주, 또는 11주 내지 12주 동안 보관되고/거나 보관될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 또는 36개월 이상 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1개월 내지 36개월, 2개월 내지 36개월, 3개월 내지 36개월, 4개월 내지 36개월, 5개월 내지 36개월, 6개월 내지 36개월, 7개월 내지 36개월, 8개월 내지 36개월, 9개월 내지 36개월, 10개월 내지 36개월, 12개월 내지 36개월, 14개월 내지 36개월, 16개월 내지 36개월, 18개월 내지 36개월 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1개월 내지 30개월, 2개월 내지 30개월, 3개월 내지 30개월, 4개월 내지 30개월, 5개월 내지 30개월, 6개월 내지 30개월, 7개월 내지 30개월, 8개월 내지 30개월, 9개월 내지 30개월, 10개월 내지 30개월, 12개월 내지 30개월, 14개월 내지 30개월, 16개월 내지 30개월 또는 18개월 내지 30개월 동안 보관된다. 일부 구현예에서 샘플을 함유하는 기재는 1개월 내지 24개월, 2개월 내지 24개월, 3개월 내지 24개월, 4개월 내지 24개월, 5개월 내지 24개월, 6개월 내지 24개월, 7개월 내지 24개월, 8개월 내지 24개월, 9개월 내지 24개월, 10개월 내지 24개월, 12개월 내지 24개월, 14개월 내지 24개월, 16개월 내지 24개월, 18개월 내지 24개월 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1개월 내지 22개월, 2개월 내지 22개월, 3개월 내지 22개월, 4개월 내지 22개월, 5개월 내지 22개월, 6개월 내지 22개월, 7개월 내지 22개월, 8개월 내지 22개월, 9개월 내지 22개월, 10개월 내지 22개월, 12개월 내지 22개월, 14개월 내지 22개월, 16개월 내지 22개월, 18개월 내지 22개월 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1개월 내지 20개월, 2개월 내지 20개월, 3개월 내지 20개월, 4개월 내지 20개월, 5개월 내지 20개월, 6개월 내지 20개월, 7개월 내지 20개월, 8 내지 20개월, 9 내지 20개월, 10개월 내지 20개월, 12개월 내지 20개월, 14개월 내지 20개월, 16개월 내지 20개월, 18개월 내지 20개월 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1개월 내지 18개월, 2개월 내지 18개월, 3개월 내지 18개월, 4개월 내지 18개월, 5개월 내지 18개월, 6개월 내지 18개월, 7개월 내지 18개월, 8개월 내지 18개월, 9개월 내지 18개월, 10개월 내지 18개월, 12개월 내지 18개월, 14개월 내지 18개월, 16개월 내지 18개월 또는 17개월 내지 18개월 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1개월 내지 12개월, 2개월 내지 12개월, 3개월 내지 12개월, 4개월 내지 12개월, 5개월 내지 12개월, 6개월 내지 12개월, 7개월 내지 12개월, 8개월 내지 12개월, 9개월 내지 12개월, 10개월 내지 12개월 또는 11개월 내지 12개월 동안 보관된다.
일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 또는 약 8℃에서 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 약 2℃ 내지 약 8℃, 약 3℃ 내지 약 8℃, 약 4℃ 내지 약 8℃, 약 5℃ 내지 약 8℃, 약 6℃ 내지 약 8℃ 또는 약 7℃ 내지 약 8℃에서 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 약 -25℃, 약 -24℃, 약 -23℃, 약 -22℃, 약 -21℃, 약 -20℃, 약 -19℃, 약 -18℃, 약 -17℃, 약 -16℃ 또는 약 -15℃에서 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 약 -25℃ 내지 약 -15℃, 약 -22℃ 내지 약 -17℃, 약 -20℃ 내지 약 -15℃ 또는 약 -25℃ 내지 약 -20℃에서 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 t 약 -90℃, 약 -89℃, 약 -88℃, 약 -87℃, 약 -86℃, 약 -85℃, 약 -84℃, 약 -83℃, 약 -82℃, 약 -81℃, 약 -80℃, 약 -79℃, 약 -78℃, 약 -77℃, 약 -76℃, 약 -75℃, 약 -74℃, 약 -73℃, 약 -72℃, 약 -71℃, 약 -70℃, 약 -69℃, 약 -68℃, 약 -67℃, 약 -66℃ 또는 약 -65℃에서 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 약 -90℃ 내지 약 -65℃, 약 -85℃ 내지 약 -65℃, 약 -80℃ 내지 약 -65℃, 약 -75℃ 내지 약 -65℃ 또는 약 -70℃ 내지 약 -65℃에서 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 -90℃ 내지 -65℃에서 보관된다.
일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1회 이상 동결-해동되고/거나(예컨대, 동결된 후, 샘플을 함유하는 기재는 해동되고, 본 방법에 따라 사용되며, 재동결된다), 본 방법에서 사용된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 이상 동결-해동된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 이상 본 방법에서 사용된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1 내지 20회, 2 내지 20회, 3 내지 20회, 4 내지 30회, 5 내지 20회, 6 내지 20회, 7 내지 20회, 8 내지 20회, 9 내지 20회, 10 내지 20회, 11 내지 20회, 12 내지 20회, 13 내지 20회, 14 내지 20회, 15 내지 20회, 16 내지 20회, 17 내지 20회, 18 내지 20회, 19 내지 20회, 5 내지 15회, 5 내지 10회, 1 내지 10회 또는 1 내지 5회 동결-해동된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 1 내지 20회, 2 내지 20회, 3 내지 20회, 4 내지 30회, 5 내지 20회, 6 내지 20회, 7 내지 20회, 8 내지 20회, 9 내지 20회, 10 내지 20회, 11 내지 20회, 12 내지 20회, 13 내지 20회, 14 내지 20회, 15 내지 20회, 16 내지 20회, 17 내지 20회, 18 내지 20회, 19 내지 20회, 5 내지 15회, 5 내지 10회, 1 내지 10회, 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회 또는 1 내지 2회 본 방법에서 사용된다.
일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 실온 또는 약 15℃ 내지 약 30℃에서 1주 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플은 약 2℃ 내지 약 8℃ 또는 약 4℃에서 약 1, 2 또는 3주 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 -25℃ 내지 약 -15℃ 또는 약 -20℃에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플을 함유하는 기재는 약 -90℃ 내지 약 -65℃ 또는 약 -80℃에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 동안 보관된다.
유리하게도 그리고 놀랍게도, 기재로부터 추출된 세포 수의 감소가 개별적인 세포로부터 핵산의 추출 증가에 의해 방지되는 것으로 확인되었다. 일부 구현예에서, 추출 증가는 세포를 표준 관행과 비교하여 더 긴 시간 동안 인큐베이션하거나, 세포를 표준 관행과 비교하여 상승된 온도에서 인큐베이션하거나, 또는 이 둘의 조합에 의해 달성된다.
일부 구현예에서, 세포의 핵산의 증가된 추출은 표준 관행과 비교하여 증가되거나 더 긴 시간 동안 추출 인큐베이션을 수행함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 상기 추출 인큐베이션은 약 45분, 예컨대, 45±5, 45±10, 45±15, 또는 45±20분 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 추출 인큐베이션은 약 25분 내지 약 65분, 약 30분 내지 약 60분, 약 35분 내지 약 55분, 약 45분 내지 약 65분, 약 45분 내지 약 55분, 또는 약 40분 내지 약 50분 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 추출 인큐베이션 시간은 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분 또는 약 65분이다.
일부 구현예에서, 세포의 핵산의 추출 증가는 표준 관행과 비교하여 증가되거나 더 높은 온도에서 추출 인큐베이션을 수행함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 상기 추출 인큐베이션은 약 45℃, 예컨대, 45±2℃, 45±5℃, 또는 45±10℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 추출 인큐베이션 온도는 약 35℃ 내지 약 55℃, 약 40℃ 내지 약 50℃ 또는 약 43℃ 내지 약 47℃이다. 일부 구현예에서, 상기 추출 온도는 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃ 또는 약 55℃이다. 일부 구현예에서, 하나를 초과하는 추출 온도가 사용된다. 예를 들면 일부 구현예에서, 추출의 일부에 대해 표준 온도가 사용되고, 추출의 또 다른 부분에 대해 증가된 온도가 사용된다.
일부 구현예에서, 본 시스템 및 방법에 따른 차후의 용해를 위해 실질적으로 적은 수의 세포가 기재로부터 방출된다. 일부 구현예에서, 적어도 1개의 세포, 적어도 2개의 세포, 적어도 5개의 세포, 적어도 10개의 세포, 적어도 15개의 세포, 적어도 20개의 세포, 적어도 50개의 세포, 적어도 75개의 세포, 적어도 100개의 세포, 적어도 125개의 세포, 적어도 150개의 세포, 적어도 175개의 세포, 적어도 200개의 세포, 적어도 250개의 세포, 적어도 300개의 세포, 적어도 350개의 세포, 적어도 400개의 세포, 적어도 450개의 세포, 적어도 500개의 세포 또는 그 이상이 교반 동안 기재로부터 방출된다.
일부 구현예에서, 약 0.55 내지 2.00, 약 0.6 내지 약 2.00, 약 0.7 내지 약 2.00 약 0.8 내지 약 2.00, 약 0.9 내지 약 2.00, 약 1.0 내지 약 2.00 약 1.1 내지 약 2.00, 약 1.2 내지 약 2.00, 약 1.3 내지 약 2.00, 약 1.4 내지 약 2.00, 약 1.5 내지 약 2.00, 약 1.6 내지 약 2.00, 약 1. 7 내지 약 2.00, 약 1.8 내지 약 2.00, 또는 약 1.9 내지 약 2.00의 순도를 갖는 약 1 ng/μL 내지 약 50 ng/μL, 약 1 ng/μL 내지 약 40 ng/μL, 약 1 ng/μL 내지 약 30 ng/μL, 약 1 ng/μL 내지 약 20 ng/μL, 약 1 ng/μL 내지 약 10 ng/μL, 약 1 ng/μL 내지 약 5 ng/μL, 약 1 ng/μL 내지 약 4 ng/μL, 약 1 ng/μL 내지 약 3 ng/μL 또는 약 1 ng/μL 내지 약 2 ng/μL의 핵산이 상기 기재된 방법을 이용하여 단일 대상으로부터 이용된다(수득된다). 일부 구현예에서, 약 0.55 내지 2.00의 순도를 갖는 1 ng/μL 내지 50 ng/μL가 상기 기재된 방법을 이용하여 단일 대상으로부터 이용된다(수득된다).
IV. 용해액
다양한 용해액이 기술되어 왔고 본 기술분야의 숙련가에게 알려져 있다. 이러한 잘 알려진 용해액 중 어느 것이 샘플로부터 핵산을 단리하기 위해 본 방법에 이용될 수 있다. 예시적인 용해액은 INVITROGEN®, QIAGEN®, LIFE TECHNOLOGIES® 및 다른 제조사에 의해 판매되는 것과 같은 상업적으로 이용가능한 것뿐만 아니라 실험실 환경에서 숙련가에 의해 생성될 수 있는 것을 포함한다. 용해 버퍼 역시 잘 기술되어 왔으며, 문헌[Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012) 및 Current Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)]에 기재된 것을 포함한 다양한 용해 버퍼가 상기 개시된 방법에 유용할 수 있고, 이들 모두는 모든 목적을 위해 참고로 본원에 통합되어 있다.
세포 용해는 세포 내로부터 핵산을 회수하기 위해 흔히 수행되는 방법이다. 많은 경우에, 세포는 용해액, 통상적으로 세제를 포함하는 알칼리 용액, 또는 용해 효소의 용액과 접촉된다. 그러한 용해액은 전형적으로 염, 세제 및 완충제뿐만 아니라 숙련가가 사용하는 것으로 이해할 다른 제제를 함유한다. 완전 및/또는 부분 용해 후, 핵산은 용해액으로부터 회수된다.
일부 구현예에서, 세포는 약 pH 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 8 또는 약 7 내지 약 9 범위의 pH를 갖는, 수성 버퍼에 재현탁된다.
일부 구현예에서, 상기 버퍼 염 농도는 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM 또는 약 20 mM 내지 약 80 mM이다.
일부 구현예에서, 버퍼는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)과 같은 킬레이트제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 용해액은 예를 들면 비제한적으로 수크로스를 포함하는 폴리올 뿐만 아니라 말티톨, 솔비톨, 자일리톨, 에리트리톨, 및/또는 이소말트와 같은 당알콜과 같은 세포로부터 핵산 방출을 돕는 다른 화합물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리올은 약 2% 내지 약 15% w/w, 또는 약 5% 내지 약 15% w/w 또는 약 5% 내지 약 10% w/w의 범위이다.
일부 구현예에서, 용해액은 예를 들면 비제한적으로 트리톤 X-100, SDS, CTAB, X-114, CHAPS, DOC, 및/또는 NP-40과 같은, 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서 그러한 계면활성제는 약 1% 내지 약 5% w/w, 약 1% 내지 약 4% w/w, 또는 약 1% 내지 약 3% w/w의 범위이다.
구현예에서, 용해액은 예를 들면 비제한적으로 우레아, 소디움 도데실 설페이트 및/또는 티오우레아와 같은 카오트로프(chaotrope)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 카오트로프는 약 0.5 M 내지 8 M, 약 1 M 내지 약 6 M, 약 2 M 내지 약 6 M 또는 약 1 M 내지 3 M 범위의 농도로 사용된다.
일부 구현예에서, 용해액은 하나 이상의 부가적인 용해 시약을 추가로 포함하며, 그러한 용해 시약은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 그러한 용해 시약은 예를 들면 비제한적으로 리소자임과 같은, 세포벽 용해 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 용해 시약은 0.5% 소디움 도데실 설페이트를 함유하는 0.1 수성 수산화나트륨과 같은 알칼리 세제 용액을 포함한다.
일부 구현예에서, 용해액은 수크로스 용액와 같은 당 수용액 및 EDTA와 같은 킬레이트제, 예를 들면 STET 버퍼를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 용해 시약은 세포 현탁액을 원하는 농도의 2배(예를 들면 0.2 소디움 하이드록사이드, 1.0% 소디움 도데실 설페이트)를 갖는 동일한 부피의 용해액과 혼합함으로써 제조된다.
일부 구현예에서, 원하는 정도의 용해가 달성된 후, 용해액 및 용해된 세포를 포함하는 혼합물은 상기 용해 시약이 원하는 산물에 부정적인 영향을 미치지 않도록 조건을 조절하는 중화 또는 ?칭 시약과 접촉된다. 일부 구현예에서, pH는 예를 들면 비제한적으로 핵산을 포함하는 세포 내용물의 분해를 최소화하고/거나 방지하기 위해 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 8, 약 5 내지 약 7, 약 6 내지 약 7 또는 약 6.5 내지 7.5의 pH로 조절된다. 일부 구현예에서, 용해 시약이 알칼리 용액을 포함하는 경우, 중화 시약은 산성 버퍼, 예를 들면 알칼리 금속 아세테이트/아세트산 버퍼를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들면 비제한적으로 핵산을 포함하는 원하는 산물의 분해를 최소화하면서 용해가 실질적으로 완료되도록 용해 시약의 온도 및 조성과 같은 용해 조건이 선택된다.
일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15 또는 제20 용해액이 본 방법에 이용된다. 일부 구현예에서, 사용되는 용해 버퍼의 부피는 약 10 μL, 약 20 μL, 약 30 μL, 약 40 μL, 약 50 μL, 약 60 μL, 약 70 μL, 약 80 μL, 약 90 μL, 약 100 μL, 약 120 μL, 약 130 μL, 약 140 μL, 약 150 μL, 160 μL, 약 170 μL, 약 180 μL, 약 190 μL, 약 200 μL, 약 220 μL, 약 230 μL, 약 240 μL, 약 250 μL, 약 260 μL, 약 270 μL, 약 280 μL, 약 290 μL, 약 300 μL, 약 320 μL, 약 330 μL, 약 340 μL, 약 350 μL, 약 360 μL, 약 370 μL, 약 380 μL, 약 390 μL, 약 400 μL, 약 450 μL, 약 500 μL, 약 550 μL, 약 600 μL, 약 650 μL, 약 700 μL, 약 750 μL, 약 800 μL, 약 850 μL, 900 μL, 950 μL, 1000 μL, 1500 μL 또는 2000 μL이다. 일부 구현예에서, 상기 용해 버퍼는 약 10 μL 내지 약 1000 μL, 약 10 μL 내지 약 800 μL, 약 10 μL 내지 약 600 μL, 약 10 μL 내지 약 400 μL, 약 20 μL 내지 약 400 μL, 약 50 μL 내지 약 300 μL, 약 50 μL 내지 약 200 μL, 약 50 μL 내지 및 약 400 μL, 약 100 μL 내지 약 400 μL, 약 10 μL 내지 약 300 μL 또는 약 100 μL 내지 약 200 μL이다.
상기 중 어느 조합이 숙련가에 의해 이용될 수 있을 뿐만 아니라 다른 알려진 그리고 일상적인 방법과 조합될 수 있고, 그러한 조합은 본 발명에 의해 고려된다.
V. 용해 버퍼로부터 핵산의 정제
일부 구현예에서, 예를 들면 비제한적으로 게놈 DNA를 포함하는 핵산은 차후 분석을 수행하기 전에 용해 버퍼로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 핵산은 예를 들면 비제한적으로 실시간 PCR 분석과 같은 부가적인 분석을 수행하기 전에 용해 버퍼로부터 단리된다. 소량의 핵산의 단리에 유용한 임의의 다양한 방법이 상기 개시된 방법의 다양한 구현예에 의해 사용된다. 이들은 비제한적으로 침전, 겔 여과, 밀도 구배 및 고상 결합을 포함한다. 그러한 방법은 또한 예를 들면, 문헌[Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012) 및 Current Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)]에 기재되어 왔으며, 이들은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 통합되어 있다.
핵산 침전은 본 기술분야의 숙련가에 의해 알려진 단리를 위한 잘 알려진 방법이다. 비제한적으로 비드(예컨대, 실리카, 자기), 컬럼, 막의 형태 또는 본 기술분야에 알려진 임의의 다양한 다른 물리적 형태로 고상(solid phase)을 이용하는 고상 결합 방법을 포함하는, 다양한 고상 결합 방법 역시 본 기술분야에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 상기 개시된 방법에서 사용되는 고상은 핵산에 가역적으로 결합한다. 그러한 고상의 예는 적어도 2개의 상이한 고상의 혼합물인 이른바 "혼합층(mixed-bed)" 고상을 포함하며, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 통합된 미국특허출원 제2002/0001812호에 기재된 바와 같이 상이한 용액 조건하에 핵산에 대한 수용력을 가지며, 상이한 조건하에 핵산을 방출하는 능력 및/또는 수용력을 갖는다. 상기 개시된 방법에 따른 핵산에 대한 고상 친화도는 기재에 용질을 결합시키기 위해 전형적으로 사용되는 많은 수단 중 어느 것을 통해서일 수 있다. 그러한 수단의 예는 비제한적으로, 이온성 상호작용(예컨대, 음이온-교환 크로마토그래피) 및 소수성 상호작용(예컨대, 역상 크로마토그래피), pH 차등 및 변화, 염 차등 및 변화(예컨대, 농도 변화, 카오트로픽 염/제제의 사용)를 포함한다. 예시적인 pH 기반 고상은 비제한적으로 낮은 pH(<6.5)에서 핵산에 결합하여 높은 pH(>8.5)에서 핵산을 방출하는 INVITROGEN ChargeSwitch 정규화된 구강 키트 자기 비드 및 7.5 미만의 pH에서 핵산에 결합하고 8보다 큰 pH에서 핵산을 방출하는 모노-아미노-N-아미노에틸(MANAE)에서 사용된 것을 포함한다. 예시적인 이온 교환 기반 기재는 비제한적으로 PHARMACIA (Piscataway, N.J.)사로부터의 DEA-SEPHAROSE™, Q-SEPHAROSE™, 및 DEAE-SEPHADEX™, Dow Chemical Company (Midland, Mich.)사로부터의 DOWEX® I, Rohm & Haas (Philadelphia, Pa.)사로부터의 AMBERLITE®, Duolite International (Cleveland, Ohio)사로부터의 DUOLITE®, DIALON TI 및 DIALON TII를 포함한다.
단독으로 또는 다른 방법과 조합하여 사용하기 위해 임의의 개별적인 방법이 고려되며, 그러한 유용한 조합은 본 기술분야의 숙련가에 의해 잘 이해되고 인식된다.
VI. 핵산 분석
상기 개시된 방법은 게놈 분석을 포함하는 다양한 핵산 분석을 위해 게놈 DNA(gDNA)와 같은 핵산을 단리하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 분석은 비제한적으로 하나 이상의 결실, 삽입, 전이 및 전환(transversion)을 포함하는 다양한 유전적 돌연변이의 검출을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 단일-뉴클레오타이드 다형성(SNP)이다.
상기 단리된 핵산, 예를 들면 비제한적으로 게놈 DNA(gDNA)를 분석하기 위한 다양한 방법이 본 기술분야에 알려져 있으며, 이는 실시간 PCR 분석과 같은 PCR 방법, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 핵산 서열 분석뿐만 아니라 핵산 조성물을 분석하는 그리고 본 기술분야의 숙련가에게 알려진 다양한 다른 방법을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012) 및 Current Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)]을 참고한다.
a. 실시간
PCR
실시간 PCR 분석의 설계를 위해, 종종 앰플리콘으로도 불리는, 2개의 프라이머 옆에 배치된 후 증폭되는 DNA 단편, 사용되는 2개의 프라이머 및 검출 프로브 또는 프로브들을 포함하는 몇 가지 부분이 조정된다.
실시간 PCR은 서열-특이적 방식으로 게놈 대립유전자와 결합하는 짧은 폴리뉴클레오타이드("검출 프로브"로 불림)에 접합된 형광성 염료의 시각적 방출에 의존한다. 단일 뉴클레오타이드가 상이한 실시간 PCR 프로브들은 상이한 파장에서 형광을 발하는 프로브의 접합 및 검출에 의해 실시간 PCR 분석에서 구분될 수 있다. 실시간 PCR은 검출 적용(진단 적용), 정량 적용 및 유전자형 분석 적용에서 유용하다.
실시간 PCR을 수행하기 위한 몇 가지 관련된 방법이 본 기술분야에 개시되어 있으며, 이는 TAQMAN® 프로브(미국특허 제5,210,015호 및 제5,487,972호, 및 Lee et al., Nucleic Acids Res. 21:3761-6, 1993), 분자 비콘 프로브(미국특허 제5,925,517호 및 제6,103,476호, 및 Tyagi 및 Kramer, Nat. Biotechnol . 14:303-8, 1996), 셀프-프로빙 앰플리콘(스콜피온)(미국특허 제6,326,145호, 및 Whitcombe et al., Nat. Biotechnol . 17:804-7, 1999), 앰플리센서(Chen et al., Appl . Environ. Microbiol . 64:4210-6, 1998), 앰플리플루오르(미국특허 제6,117,635호, 및 Nazarenko et al., Nucleic Acids Res. 25:2516-21, 1997, 치환 혼성화 프로브(Li et al., Nucleic Acids Res. 30:E5, 2002), DzyNA-PCR(Todd et al., Clin . Chem. 46:625-30, 2000), 형광 제한효소 검출(Cairns et al., Biochem . Biophys . Res. Commun . 318:684-90, 2004) 및 인접 혼성화 프로브(미국특허 제6,174,670 및 Wittwer et al., Biotechniques 22:130-1, 134-8, 1997)에 의존하는 분석을 포함한다.
일부 경우에, 실시간 PCR은, 예를 들면 비제한적으로 SNP를 포함하는 다양한 유전자 돌연변이를 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 특정한 유전자 후보에서 SNP의 검출은 연결된 ?칭 모이어티의 사용에 의한 형광 분자의 분자내 ?칭의 사용에 기초하여, 실시간 PCR을 이용함으로써 수행된다. 따라서, 예시적인 구현예에 따르면, 실시간 PCR 방법은 또한 분자 비콘 기술의 사용을 포함한다. 상기 분자 비콘 기술은 내부적으로 ?칭된 형광단을 갖는 헤어핀-모양의 분자를 이용하며, 상기 내부적으로 ?칭된 형광단의 형광은 관심있는 DNA 표적에 결합함으로써 회복된다(예컨대, Kramer, R. et al. Nat. Biotechnol . 14:303-308, 1996 참고). 일부 구현예에서, 축적되는 PCR 산물에 대한 분자 비콘 프로브의 결합 증가가 게놈 DNA에 존재하는 SNP를 특이적으로 검출하는 데 사용된다.
많은 적합한 유전자형 분석 과정 중 하나는 TAQMAN® 대립유전자 식별 분석이다. 이 분석의 일부 경우에, 프로브의 5' 말단에 형광성 리포터 염료 및 프로브 3' 말단에 ?처 염료로 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브가 이용된다. 온전한(intact) 프로브에 대한 ?처의 근접은 리포터에 대해 낮은 형광을 유지한다. PCR 반응 동안, DNA 폴리머라아제의 5' 뉴클레아제 활성이 프로브를 절단하여, 염료 및 ?처를 분리시킨다. 그 결과, 리포터의 형광이 증가한다. PCR 산물의 축적은 리포터 염료의 형광 증가를 모니터링함으로써 직접 검출된다. DNA 폴리머라아제의 5' 뉴클레아제 활성은, 상기 프로브가 표적에 혼성화되어 PCR 동안 증폭되는 경우에만 프로브를 리포터와 ?처 사이에서 절단한다. 상기 프로브는, 특정한 SNP 대립유전자가 존재하는 경우에만, 표적 SNP 위치의 양쪽에 걸쳐 핵산 분자에 혼성화되도록 설계된다.
예로써, TGFβI 유전자의 엑손 4에 위치한 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP를 증폭하기 위해, 미국 특허공개 제2012/0077200호에 기술된 바와 같이 정방향 및 역방향 PCR 프라이머쌍(도 2에서 서열번호: 1 내지 24)이 구축되었다. 일부 구현예에서, 상기 문헌에 개시된 정방향 및 역방향 프라이머쌍 중 어느 것이 본원에 개시된 개선된 방법에서 사용된다. 바람직한 구현예에서, 서열번호: 1(정방향) 및 서열번호: 2(역방향)의 정방향 및 역방향 프라이머쌍이 본원에 제공된 개선된 방법에서 사용된다.
TGFβI 유전자의 엑손 4에서 구아닌에서 아데닌으로의 돌연변이를 검출하기 위해, 도 3에서 나타나 바와 같은 서열번호: 25 내지 42에 따른 뉴클레오타이드 서열을 갖는 야생형("G") 및 아벨리노 각막 이영양증 관련 돌연변이("A") 대립유전자의 검출을 위한 형광 표지된 실시간 PCR 프로브쌍이 미국 특허공개 제2012/0077200호에 기술된 바와 같이 구축되었다. 일부 구현예에서, 상기 야생형 및 돌연변이 프로브 중 어느 것이 본원에 개시된 개선된 방법에서 사용된다. 바람직한 구현예에서, 서열번호: 25(야생형) 및 서열번호: 26(돌연변이)의 야생형 및 돌연변이 프로브쌍이 본원에 제공된 개선된 방법에서 사용된다. 질환 관련 대립유전자와 야생형 대립유전자를 구분하기 위해, 상기 야생형 프로브를 VIC로 표지하고, 상기 돌연변이 프로브를 FAM으로 표지하였다. 상보적인 유전자 단편에 대한 결합을 용이하게 하기 위하여 좁은 홈 결합물질(MGB)을 상기 프로브에 부착시켰다.
b. 실시간
PCR
사이클
실시간 PCR 방법은 증폭을 위한 방법의 부분으로서 다양한 단계 또는 사이클을 포함한다. 이들 사이클은 이중 가닥 핵산을 변성시키는 것, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 검출 프로브를 표적 게놈 DNA 서열에 어닐링하는 것 및 상기 어닐링된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로부터 제2 가닥 DNA를 합성하는 것(즉, 복제하는 것)을 포함한다. 이러한 3단계 공정은 본원에서 하나의 사이클로서 불린다.
일부 구현예에서, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 사이클이 이용된다. 일부 구현예에서, 약 10 내지 약 60 사이클, 약 20 내지 약 50 또는 약 30 내지 약 40 사이클이 이용된다. 일부 구현예에서, 40 사이클이 이용된다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 핵산을 변성시키는 단계는 약 80℃ 내지 100℃, 약 85℃ 내지 약 99℃, 약 90℃ 내지 약 95℃의 온도에서 약 1초 내지 약 5초, 약 2초 내지 약 5초, 또는 약 3초 내지 약 4초 동안 일어난다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 핵산을 변성시키는 단계는 95℃의 온도에서 약 3초 동안 일어난다.
일부 구현예에서, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 검출 프로브를 표적 게놈 DNA 서열에 어닐링하는 단계는 약 40℃ 내지 약 80℃, 약 50℃ 내지 약 70℃, 약 55℃ 내지 약 65℃에서 for 약 15초 내지 약 45초, 약 20초 내지 약 40초, 약 25초 내지 약 35초 동안 일어난다. 일부 구현예에서, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 검출 프로브를 표적 게놈 DNA 서열에 어닐링하는 단계는 약 60℃에서 약 30초 동안 일어난다.
일부 구현예에서, 상기 어닐링된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로부터 제2-가닥 DNA을 합성하는 것(즉, 복제하는 것)은 약 40℃ 내지 약 80℃, 약 50℃ 내지 약 70℃, 약 55℃ 내지 약 65℃에서 약 15초 내지 약 45초, 약 20초 내지 약 40초, 약 25초 내지 약 35초 동안 일어난다. 일부 구현예에서, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 검출 프로브를 표적 게놈 DNA 서열에 어닐링하는 단계는 약 60℃에서 약 30초 동안 일어난다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 본 방법에 따라 제조된 약 1 μL, 약 2 μL, 약 3 μL, 약 4 μL 또는 약 5 μL의 게놈 DNA 샘플이 단지 약 0.05 μL, 약 0.10 μL 약 0.15 μL, 약 0.20 μL, 약 0.25 μL 또는 약 0.25 μL의 30X, 35X, 40X, 45X, 50X 또는 100X 실시간 PCR 분석 믹스 및 증류수와 조합되어 PCR 마스터 믹스를 형성하는 것으로 확인되었다. 일부 구현예에서, 상기 PCR 마스터 믹스는 약 5 μL, 약 6 μL, 약 7 μL, 약 8 μL, 약 9 μL, 약 0 μL, 약 11 μL, 약 12 μL, 약 13 μL, 약 14 μL, 약 15 μL, 약 16 μL, 약 17 μL, 약 18 μL, 약 19 μL 또는 약 20 μL 이상의 최종 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같이 제조된 2 μL의 게놈 DNA 샘플이 PCR 마스터 믹스를 형성하기 위해 단지 약 0.15 μL의 40X 실시간 PCR 분석 믹스 및 2.85 μL의 증류수와 조합되는 것으로 확인되었다.
예시적인 반응이 본원에 기재되어 있음에도 불구하고, 숙련가는 프로브 설계에 기초하여 온도 및 시간을 변형하는 방법을 이해할 것이다. 더욱이, 본 방법은 상기 시간 및 온도의 임의의 조합을 고려한다.
c.
PCR
프라이머
및
프라이머
설계
일부 구현예에서, 프라이머는 실험실 환경에서 시험되고 설계된다. 일부 구현예에서, 프라이머는 인 실리코 방법에 기초하여 컴퓨터에 의해 설계된다. 프라이머 서열은 증폭될 앰플리콘 또는 표적 핵산 서열에 기초한다. 더 짧은 앰플리콘은 더 긴 앰플리콘과 비교하여 전형적으로 더 효율적으로 복제되며 더 효율적인 증폭을 야기한다.
프라이머 설계시, 숙련가는 설계되는 프라이머의 GC 및 AT 함량뿐만 아니라 2차 구조 고려사항(GC 함량 증가는 2차 구조 증가를 야기할 수 있음)에 기초하여 용융 온도(Tm; 프라이머-표적 이합체의 절반이 해리되어 단일 가닥이 될 때의 온도로서 이합체 안정성을 나타냄; Tm 증가는 안정성 증가를 나타냄)를 고려할 필요를 이해할 것이다. TM은 본 기술분야에 알려진 다양한 방법을 이용하여 계산될 수 있고, 숙련가는 TM을 계산하기 위한 그러한 다양한 방법을 쉽게 이해할 것이며, 그러한 방법은 예를 들면 웹(world wide web) 상의 promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm에서 이용가능한 TM 계산기와 같은 온라인 도구에서 이용가능한 것을 포함한다. 프라이머 특이성은 Taq 폴리머라아제에 의해 연장되는 부위인 3' 말단 서열과 조합하여 그의 완전한 서열에 의해 정의된다. 일부 구현예에서, 잘못된 프라이밍(false-priming) 및 부정확한 증폭 산물의 생성을 감소시키는 것을 돕기 위해, 3' 말단은 표적 서열 내의 다른 어느 곳에서도 발견되지 않는 적어도 5개 내지 7개의 독특한 뉴클레오타이드를 가져야 한다. 정방향 및 역방향 프라이머는 전형적으로 표적에 유사한 효율로 결합한다. 일부 경우에, NCBI BLAST(웹상의 ncbi.nlm.nih.gov에 위치함)와 같은 도구가 정렬을 수행하고 프라이머 설계를 돕기 위해 사용된다.
본 기술분야의 숙련가는 표적 핵산 서열을 위한 프라이머 설계에 관한 기본을 잘 알 것이고, 다양한 참고 매뉴얼 및 교과서가 그러한 방법을 광범위하게 교시하고 있으며, 이는 예를 들면, 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 통합된 문헌[Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012) and Current Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013) and Real-Time PCR in Microbiology: From Diagnostics to Characterization (Ian M. MacKay, Calster Academic Press; 2007); PrimerAnalyser Java tool available on the World Wide Web at primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.html and Kalendar R, et al. (Genomics, 98(2): 137-144 (2011))]을 포함한다.
프라이머 설계의 부가적인 측면은 프라이머 복잡성 또는 언어학적 서열 복잡성이다(Kalendar R, et al. (Genomics , 98(2): 137-144 (2011) 참고). 더 큰 언어학적 서열 복잡성(예컨대, 뉴클레오타이드 배열 및 조성)을 갖는 프라이머가 전형적으로 더 효율적이다. 일부 구현예에서, 상기 언어학적 서열 복잡성 계산 방법은 단순한 서열 반복, 불완전한 직접적인 또는 역전된 반복, 폴리퓨린 및 폴리피리미딘 3가닥의 cDNA 구조, 및 4가닥의 구조(예컨대, G-4중체)를 포함하는 낮은-복잡성 영역의 검출을 위해 비교된 서열 간의 보존 영역을 서치하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 언어학적 복잡성(LC) 측정은 전체 서열 길이를 따라 알파벳-수용력 L-그램(alphabet-capacity L-gram) 방법(A. Gabrielian, A. Bolshoy, Computer & Chemistry 23:263-274 (1999) 및 Y.L. Orlov, V.N. Potapov, Complexity: an internet resource for analysis of DNA sequence complexity, Nucleic Acids Res. 32: W628-W633(2004) 참조)을 이용하여 수행되며 서열 내의 1부터 L 크기 워드의 관찰된 범위 (xi)의 합을 이 서열 길이에 대한 예측된(E) 값의 합으로 나눔으로써 계산된다. 일부 G-풍부(및 C-풍부) 핵산 서열은 G-4중체의 스택(stack)을 함유하는 4가닥의 DNA 구조로 접힌다(웹의 quadruplex.org 참고). 일부 경우에, 이들 4중체는 2 또는 4개의 DNA 분자의 분자내 결합, 2개의 G-염기를 함유하는 서열들의 이합체화, 또는 구아닌의 4개의 블록을 함유하는 단일 가닥의 분자내 폴딩에 의해 형성되며(P.S. Ho, PNAS, 91:9549-9553 (1994); I.A. Il'icheva, V.L. Florent'ev, Russian Journal of Molecular Biology 26:512-531(1992); D. Sen, W. Gilbert, Methods Enzymol. 211:191-199 (1992); P.A. Rachwal, K.R. Fox, Methods 43:291-301 (2007); S. Burge, G.N. Parkinson, P. Hazel, A.K. Todd, K. Neidle, Nucleic Acids Res. 34:5402-5415 (2006); A. Guedin, J. Gros, P. Alberti, J. Mergny, Nucleic Acids Res. 38:7858-7868 (2010); O. Stegle, L. Payet, J.L. Mergny, D.J. MacKay, J.H. Leon, Bioinformatics 25:i374-i382 (2009); 일부 경우에, 이들은 이들의 낮은 언어학적 복잡성 ((TTAGGG)4에 대해 LC=32%임) 때문에, 프라이머 설계로부터 제거된다.
이들 방법은 CG 함량 및 용융 온도에 관한 GC 왜곡(skew), (G-C)/(G+C), AT 왜곡, (A-T)/(A+T), CG-AT 왜곡, (S-W)/(S+W), 또는 퓨린-피리미딘 (R-Y)/(R+Y) 왜곡을 갖는 서열에서의 패턴 분석을 위한 다양한 생물정보를 포함하고, 언어학적 서열 복잡성 프로파일을 결정하기 위한 도구를 제공한다. 예를 들면 n (n은 양의 정수임) 염기의 슬라이딩 윈도우에서의 GC 왜곡은 식 (G-C)/(G+C)에 따라 하나의 염기의 단계를 이용하여 계산되며, 여기서 상기 윈도우 내의 모든 서열에 대하여 G는 구아닌의 총수이고, C는 시토신의 총수이다(Y. Benita, et al., Nucleic Acids Res. 31:e99 (2003)). 양성 GC-왜곡 값은 G 염기의 과잉을 가리킨 반면, 음성 GC-왜곡 값은 C 염기의 과잉을 나타내었다. 유사하게, 다른 왜곡이 상기 서열에서 계산된다. 상기 방법뿐만 아니라 다른 방법이 일부 구현예에서 프라이머 복잡성을 결정하는 데 이용된다.
비제한적인 예 구현예에 따르면, 실시간 PCR은 엑소뉴클레아제 프라이머(TAQMAN® 프로브)를 이용하여 수행된다. 그러한 구현예에서, 상기 프라이머는 증폭 반응 내에 존재하는 이중-표지된 프로브를 절단하기 위해 Taq과 같은 내열성 폴리머라아제의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용한다(예컨대, Wittwer, C. et al. Biotechniques 22:130-138, 1997 참고). PCR 산물에 상보적임에도 불구하고, 이 분석에서 사용되는 프라이머 프로브는 PCR 프라이머와 다르며, 형광을 낼 수 있는 분자 및 형광을 ?칭할 수 있는 분자 모두로 이중 표지되어 있다. 상기 프로브가 온전한 경우, DNA 프로브 내의 형광 신호의 분자내 ?칭이 신호를 거의 야기하지 않는다. 상기 형광 분자가 증폭 동안 Taq의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 방출되는 경우, ?칭이 크게 감소되어 형광성 신호를 증가시킨다. 형광성 프로브의 비제한적인 예는 6-카복시-플루오레세인 모이어티 등을 포함한다. 예시적인 ?처는 블랙 홀 ?처 1 모이어티 등을 포함한다.
다양한 PCR 프라이머가 상기 개시된 방법에서 유용할 수 있다. 예시적인 프라이머는 비제한적으로 본원에 기재된 것을 포함한다. 상기 개시된 방법에서 사용하기 위한 프라이머는 또한 모든 목적을 위해 참고로 본원에 통합된 미국 특허공개 제20120077200호에서 확인된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법에서 사용하기 위한 PCR 프라이머는 비제한적으로 표 1에 열거된 하기의 것을 포함하며, 이는 TGFβI 유전자의 검출에 유용하다. 표 2 및 3은 웹의 primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.html을 이용하여 계산된 바와 같이, 각각의 프라이머에 대한 생물물리학적 파라미터를 제공한다.
TGFβI 유전자를 위한 예시적인 프라이머 | ||
프라이머명 | 서열번호: | 프라이머 서열 |
ACD Fw 프라이머 | 서열번호: 1 | 5'-TCC ACC ACC ACT CAG CTG TA |
ACD Re 프라이머 | 서열번호: 2 | 5'-CCA TCT CAG GCC TCA GCT T (60 bp) |
AV Fw 프라이머 | 서열번호: 3 | 5'-TGC AGC CCT ACC ACT CTC AA |
AV Re 프라이머 | 서열번호: 4 | 5'-AGG CCT CGT TGC TAG G (150 bp) |
Real Fw 프라이머 | 서열번호: 5 | 5'-TAG TCT CTT ATT CTA ATA GA |
Real Re 프라이머 | 서열번호: 6 | 5'-GCT GCA GAC TCT GTG TTT AA (860 bp) |
ACD Fw2 프라이머 | 서열번호: 7 | 5'-CCA TCC CTC CTT CTG TCT TCT G |
ACD Re2 프라이머 | 서열번호: 8 | 5'-CGG GCC CCT CCA TCT C (140 bp) |
ACD Fw3 프라이머 | 서열번호: 9 | 5'-CAG AGA AGG GAG GGT GTG GTT |
ACD Re3 프라이머 | 서열번호: 10 | 5'-GGG CGA AGA TGG TGA AGC T (190 bp) |
ACD Fw4 프라이머 | 서열번호: 11 | 5'-TCC TCG TCC TCT CCA CCT GTA |
ACD Re4 프라이머 | 서열번호: 12 | 5'-AGC TGG CAA GGA GGC CC |
ACD Fw5 프라이머 | 서열번호: 13 | 5'-TTT GGG CTT TCC CAC ATG C |
ACD Re5 프라이머 | 서열번호: 14 | 5'-GGC AGA CGG AGG TCA TCT CA |
ACD Fw6 프라이머 | 서열번호: 15 | 5'-GTA GTA CCG TGC TCT CTG |
ACD Re6 프라이머 | 서열번호: 16 | 5'-AGT TCC CCA TAA GAA TCC CCC |
ACD Fw7 프라이머 | 서열번호: 17 | 5'-GGC TGG ACC CCC AGA GG |
ACD Re7 프라이머 | 서열번호: 18 | 5'-ACC CCT CGG GGA AGT AAG G |
ACD Fw8 프라이머 | 서열번호: 19 | 5'-AAC CTT TAC GAG ACC CTG GGA |
ACD Re8 프라이머 | 서열번호: 20 | 5'-GAC TCC CAT CCA TCA TGC CC |
ACD Fw9 프라이머 | 서열번호: 21 | 5'-AGT CGT TGG ATC CAC CAC CA |
ACD Re9 프라이머 | 서열번호: 22 | 5'-GAC GTC ATT TCC TAC TGT TTC AGG |
ACD Fw10 프라이머 | 서열번호: 23 | 5'-CCC CCC AGA AAC AGC CTG |
ACD Re10 프라이머 | 서열번호: 24 | 5'-TTC TAA GGG GTT AAG GAG AAA GCT T |
GCD1 Fw 프라이머 | 서열번호: 43 | 5'-ACA CAG TCT TTG CTC CCA CAA A |
GCD1 Re 프라이머 | 서열번호: 44 | 5'-ACT TAA GTT GGT CTT TAC CCA AGA GTC T |
정방향 프라이머에 대한 생물물리학적 파라미터 | ||||||
정방향 프라이머 | 길이 | Tm1 | Tm2 | GC 함량 | % 복잡성 | PCR 효율 |
서열번호: 1 | 19 | 55.4 | 57.8 | 57.9 | 70 | 70 |
서열번호: 3 | 20 | 57.1 | 58 | 55 | 81 | 66 |
서열번호: 5 | 20 | 40.2 | 45.7 | 25 | 73 | 38 |
서열번호: 7 | 22 | 55.9 | 60.2 | 54.5 | 62 | 43 |
서열번호: 9 | 21 | 57.5 | 60.2 | 57.1 | 64 | 40 |
서열번호: 11 | 21 | 57.6 | 60.2 | 57.1 | 66 | 57 |
서열번호: 13 | 19 | 55.4 | 55.7 | 52.6 | 81 | 80 |
서열번호: 15 | 18 | 50.6 | 55.3 | 55.6 | 75 | 66 |
서열번호: 17 | 17 | 57.8 | 62.2 | 76.5 | 74 | 60 |
서열번호: 19 | 21 | 56.6 | 58.2 | 52.4 | 82 | 73 |
서열번호: 21 | 20 | 57.4 | 58 | 55 | 78 | 46 |
서열번호: 23 | 18 | 56.5 | 59.9 | 66.7 | 69 | 69 |
평균 | 19.67 | 54.96 | 57.80 | 56.05 | 72.69 | 59.85 |
중간 | 20 | 56.55 | 58.1 | 55.3 | 73.5 | 63 |
표준 편차 | 1.50 | 5.00 | 4.24 | 11.78 | 6.84 | 14.10 |
역방향 프라이머에 대한 생물물리학적 파라미터 | ||||||
역방향 프라이머 | 길이 | Tm1 | Tm2 | GC 함량 | % 복잡성 | PCR 효율 |
서열번호: 2 | 19 | 55.5 | 57.8 | 57.9 | 72 | 52 |
서열번호: 4 | 16 | 52.1 | 54.5 | 62.5 | 78 | 78 |
서열번호: 6 | 20 | 52.4 | 53.9 | 45 | 84 | 41 |
서열번호: 8 | 16 | 55.2 | 59.6 | 75 | 63 | 53 |
서열번호: 10 | 19 | 56.5 | 57.8 | 57.9 | 78 | 69 |
서열번호: 12 | 17 | 58.5 | 59.8 | 70.6 | 74 | 66 |
서열번호: 14 | 20 | 57.6 | 60.1 | 60 | 84 | 74 |
서열번호: 16 | 21 | 54.9 | 58.2 | 52.4 | 71 | 51 |
서열번호: 18 | 19 | 56.6 | 60 | 63.2 | 78 | 60 |
서열번호: 20 | 20 | 56.5 | 60.1 | 60 | 65 | 65 |
서열번호: 22 | 24 | 55.5 | 58.7 | 45.8 | 88 | 67 |
서열번호: 24 | 25 | 55.3 | 57.2 | 40 | 74 | 40 |
평균 | 19.69 | 55.61 | 58.13 | 57.33 | 76.54 | 60.69 |
중간 | 19.5 | 55.5 | 58.45 | 58.95 | 76 | 62.5 |
표준 편차 | 2.77 | 1.86 | 2.10 | 10.33 | 7.52 | 12.30 |
일부 구현예에서, 상기 개시된 방법에 사용하기 위한 실시간 PCR 프라이머는 적어도 70%, 적어도 72%, 적어도 75%, 적어도 77%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99%의 언어학적 서열 복잡성을 갖는다.
d. 검출
프로브
설계 및 검출
프로브
다양한 검출 프로브가 상기 개시된 방법에 유용할 수 있고 유전자형 분석 및 또는 정량을 위해 이용된다. 본 기술분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이용되는 검출 프로브는 비제한적으로 가수분해 프로브(TAQMAN® 프로브, 5' 뉴클레아제 프로브 또는 이중-표지된 프로브로도 알려짐), 혼성화 프로브, 및 스콜피온 프라이머(프라이머 및 검출 프로브를 하나의 분자로 조합함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 프로브 설계는 프로브가 사용된 PCR 프라이머와 양립가능하도록(예컨대, 프라이머 및 프로브가 실시간 PCR 분석에서 서로의 기능을 방해하지 않아야 함), 원하는 프로브 표적에 기초하여 본 기술분야의 숙련가에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 프로브는 효율적인 신호 생성을 촉진하기 위해 프라이머보다 더 높은 Tm을 갖도록 설계된다. Tm은 본 기술분야에 알려진 임의의 다양한 방법을 이용하여 계산되며, 숙련가는 Tm을 계산하기 위한 그러한 다양한 방법을 쉽게 이해할 것이며, 그러한 방법은 예를 들면 웹상의 promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm에서 이용가능한 계산기와 같은 온라인 도구에서 이용가능한 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 프로브의 Tm 증가는 프라이머가 폴리머라아제에 의해 연장되기 전에 검출 프로브가 결합되는 것을 제공한다.
일부 구현예에서, 검출 프로브는 다양한 변형을 함유한다. 일부 구현예에서, 검출 프로브는 비제한적으로 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드 변형, 포스포로티오에이트 백본 변형, 포스포로디티오에이트 백본 변형, 포스포르아미데이트 백본 변형, 메틸포스포네이트 백본 변형, 3' 말단 포스페이트 변형 및/또는 3' 알킬 치환과 같은, 변형된 핵산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 검출 프로브는 변형으로 인해 표적 서열에 대해 증가된 친화성을 갖는다. 그러한 검출 프로브는 길이가 증가된 검출 프로브 뿐만 아니라 화학적 변형을 함유하는 검출 프로브를 포함한다. 그러한 변형은 비제한적으로 2'-플루오로(2'-데옥시-2'-플루오로-뉴클레오사이드) 변형, LNA(잠금 핵산), PNA(펩타이드 핵산), ZNA(집 핵산), 모폴리노, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 폴리양이온성 접합체 및 2'-피렌 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 프로브는 2' 플루오로 변형(aka, 2'-데옥시-2'-플루오로-뉴클레오사이드), LNA(잠금 핵산), PNA(펩타이드 핵산), ZNA(집 핵산), 모폴리노, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및/또는 폴리양이온성 접합체를 포함하는 하나 이상의 변형을 함유한다.
일부 구현예에서, 검출 프로브는 본원에 기재된 것과 같은 검출가능한 모이어티뿐만 아니라 본 기술분야의 숙련가에게 알려진 임의의 검출가능한 모이어티를 함유한다. 그러한 검출가능한 모이어티는 예를 들면 비제한적으로 형광성 표지 및 화학발광성 표지를 포함한다. 그러한 검출가능한 모이어티의 예는 또한 FRET 쌍의 멤버를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출 프로브는 검출가능한 독립체(entity)를 함유한다.
형광성 표지의 예는 비제한적으로 AMCA, DEAC(7-디에틸아미노쿠마린-3-카복실산); 7-하이드록시-4-메틸쿠마린-3; 7-하이드록시쿠마린-3; MCA(7-메톡시쿠마린-4-아세트산); 7-메톡시쿠마린-3; AMF(4'-(아미노메틸)플루오레세인); 5-DTAF(5-(4,6-디클로로트리아지닐)아미노플루오레세인); 6-DTAF(6-(4,6-디클로로트리아지닐)아미노플루오레세인); 6-FAM(6-카복시플루오레세인; aka FAM; TAQMAN® FAMTM 포함); TAQMAN VIC®; 5(6)-FAM 카다베린; 5-FAM 카다베린; 5(6)-FAM 에틸렌디아민; 5-FAM 에틸렌디아민; 5-FITC(FITC 이성질체 I; 플루오레세인-5-이소티오시아네이트); 5-FITC 카다베린; 플루오레세인-5-말레이미드; 5-IAF(5-아이오도아세타미도플루오레세인); 6-JOE(6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인); 5-CRl lO(5-카복시로다민 110); 6-CRl lO(6-카복시로다민 110); 5-CR6G(5-카복시로다민 6G); 6-CR6G(6-카복시로다민 6G); 5(6)-카복시로다민 6G 카다베린; 5(6)-카복시로다민 6G 에틸렌디아민; 5-ROX(5-카복시-X-로다민); 6-ROX(6-카복시-X-로다민); 5-TAMRA(5-카복시테트라메틸로다민); 6-TAMRA(6-카복시테트라메틸로다민); 5-TAMRA 카다베린; 6-TAMRA 카다베린; 5-TAMRA 에틸렌디아민; 6-TAMRA 에틸렌디아민; 5-TMR C6 말레이미드; 6-TMR C6 말레이미드; TR C2 말레이미드; TR 카다베린; 5-TRITC; G 이성질체(테트라메틸로다민-5-이소티오시아네이트); 6-TRITC; R 이성질체(테트라메틸로다민-6-이소티오시아네이트); 단실 카다베린(5-디메틸아미노나프탈렌-l-(N-(5-아미노펜틸))설폰아미드); EDANS C2 말레이미드; 플루오레스카민; NBD; 및 피로메텐 및 이의 유도체를 포함한다.
화학발광성 표지의 예는 비제한적으로 서던 블롯 및 웨스턴 블롯과 함께 사용되는 표지(예를 들어, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3rd ed.) (2001) 참고; 그 전체가 참고로 본원에 통합됨)를 포함한다. 예는 비제한적으로 -(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3"-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄(AMPPD); 아크리디늄 에스테르 및 아다만틸-안정화된 1,2-디옥세탄, 및 이의 유도체를 포함한다.
프로브의 표지화는 본 기술분야에 알려져 있다. 표지된 프로브는 증폭 동안 증폭된 영역 내에서 혼성화하는 데 사용된다. 프로브는 이들이 증폭을 위한 프라이머로서 작용하는 것을 피하기 위해 변형된다. 검출 프로브는 2개의 형광성 염료인 다른 염료의 형광을 ?칭할 수 있는 하나의 염료로 표지된다. 하나의 염료는 프로브의 5' 말단에 부착되며 다른 염료는 내부 부위에 부착되어, 프로브가 비-혼성화된 상태일 때 ?칭이 일어난다.
전형적으로, 실시간 PCR 프로브는 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 관여하는 염료의 쌍(리포터 염료 및 수용체 염료)로 이루어지며, 이에 의해 수용체 염료가 리포터 염료의 방출을 ?칭한다. 일반적으로, 형광-표지된 프로브는 앰플리콘 정량의 특이성을 증가시킨다.
상기 개시된 방법의 일부 구현예에 사용되는 실시간 PCR은 또한 이러한 개시내용에 비추어, 본 기술분야의 숙련가에 의해 결정된 바와 같이, 하나 이상의 혼성화 프로브(즉, 검출 프로브)의 사용을 포함한다. 비제한적인 예로써, 그러한 혼성화 프로브는 비제한적으로 상기 기재된 방법에서 제공된 것 중 하나 이상을 포함한다. HEX 채널 및/또는 FAM 채널 프로브와 같은 예시적인 프로브가 본 기술분야의 숙련가에 의해 이해된다.
예시적인 구현예에 따르면, 검출 프로브 및 프라이머는 예컨대, 프라이머 설계 소프트웨어를 이용한 인 실리코 분석 및 미국 국립 생물공학정보 센터(NCBI)에 보관된 유전자 및 게놈의 이용가능한 뉴클레오타이드 데이터베이스에 대해 교차-참조를 이용하여 간편하게 선택된다. 일부 구현예에서 프라이머 및/또는 프로브의 선택을 위해 일부 추가 지침이 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 프라이머 및 프로브는 서로 근접하지만 겹치지 않도록 선택된다. 일부 구현예에서, 프라이머들은 동일한(또는 근접한) TM(예컨대, 약 58℃ 내지 약 60℃)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 프로브의 TM은 프라이머의 TM을 위해 선택된 것보다 약 10℃ 더 높다. 일부 구현예에서, 프로브 및 프라이머의 길이는 약 17 내지 39 염기 쌍 등이 되도록 선택된다. 적절한 프라이머 및/또는 프로브를 선택하는 데 있어 이러한 지침 및 다른 지침이 본 기술분야의 숙련가에 의해 일부 경우에 사용된다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 프로브는 비제한적으로 표 4에 열거된 하기 예시적인 프로브를 포함한다.
TGFβI 유전자를 위한 예시적인 프로브 | ||
프로브명 | 서열번호: | 프로브 서열 |
정상 프로브 1 | 서열번호: 25 | VIC-CAC GGA CCG CAC GGA-NFQ (15 bp) |
돌연변이 프로브 1 | 서열번호: 26 | FAM-CAC GGA CCA CAC GGA-NFQ |
정상 프로브 2 | 서열번호: 27 | VIC-ACA CGG ACC GCA CG-NFQ |
돌연변이 프로브 2 | 서열번호: 28 | FAM-ACA CGG ACC ACA CG-NFQ (14 bp) |
정상 프로브 3 | 서열번호: 29 | VIC-TAC ACG GAC CGC A-NFQ |
돌연변이 프로브 3 | 서열번호: 30 | FAM-TAC ACG GAC CAC A-NFQ (13 bp) |
정상 프로브 4 | 서열번호: 31 | VIC-CTG TAC ACG GAC CGC ACG-NFQ |
돌연변이 프로브 4 | 서열번호: 32 | FAM-CTG TAC ACG GAC CAC ACG-NFQ (18 bp) |
정상 프로브 5 | 서열번호: 33 | VIC-CTG TAC ACG GAC CGC ACG GAG-NFQ |
돌연변이 프로브 5 | 서열번호: 34 | FAM-CTG TAC ACG GAC CAC ACG GAG-NFQ (21 bp) |
정상 프로브 6 | 서열번호: 35 | VIC-GCT GTA CAC GGA CCG CAC GGA GAA-NFQ |
돌연변이 프로브 6 | 서열번호: 36 | FAM-GCT GTA CAC GGA CCA CAC GGA GM-NFQ |
정상 프로브 7 | 서열번호: 37 | VIC-ACC GCA CGG AGA AGC-NFQ |
돌연변이 프로브 7 | 서열번호: 38 | FAM-ACC ACA CGG AGA AGC-NFQ |
정상 프로브 8 | 서열번호: 39 | VIC-ACC GCA CGG AGA AGC TGA GGC-NFQ |
돌연변이 프로브 8 | 서열번호: 40 | FAM-ACC ACA CGG AGA AGC TGA GGC-NFQ |
정상 프로브 9 | 서열번호: 41 | VIC-ACC GCA CGG AGA AGC TGA GGC CTG-NFQ |
돌연변이 프로브 9 | 서열번호: 42 | FAM-ACC ACA CGG AGA AGC TGA GGC CTG-NFQ |
정상 프로브 10 | 서열번호: 45 | VIC-CAC CAA GAG AAC GGA-NFQ |
돌연변이 프로브 10 | 서열번호: 46 | FAM-CAC CAA GAG AAT GG-NFQ |
정상 프로브 10a | 서열번호: 47 | VIC-CAC CAA GAG AAC GGA G-MGB NFQ |
#TGFβI R124C | 서열번호: 48 | FAM-CAC GGA CTG CAC GGA-MGB NFQ |
#TGFβI R124L | 서열번호: 49 | FAM-CAC GGA CCT CAC GGA-MGB NFQ |
#TGFβI R555Q-1 | 서열번호: 50 | FAM-AC CAA GAG AACA GA G--MGB NFQ |
VII. 진단 시험
일부 구현예에서, 다양한 돌연변이 중 어느 것을 검출함으로써 하나 이상의 유전적 상태를 확인하기 위해 진단 시험이 이용된다. 일부 구현예에서, 진단 시험은 예를 들면 신체적 표시, 징후 및/또는 증상뿐만 아니라 가족력 정보에 기초하여 특정한 질환이 의심될 때 진단을 확인하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 진단 시험의 결과는 의료 분야의 숙련가가 주어진 환자에 대한 적절한 치료 요법을 결정하는 것을 돕고 보다 개인맞춤형이고 보다 효과적인 치료 요법을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 치료 요법은 본 기술분야의 숙련가에 의해 결정된 바와 같이 다양한 약제학적 치료, 수술 치료, 생활방식 변화 또는 이의 조합 중 어느 것을 포함한다.
상기 개시된 방법에 의해 수득된 핵산은 결실, 삽입, 전환(transversion) 및 전이와 같은 돌연변이를 검출하기 위한 시험을 포함하는, 다양한 진단 시험에서 유용하다. 일부 구현예에서, 그러한 진단은 질환이 발현되기 위해 2 카피를 요구하는 질환에 대한 유전자 중 1 카피를 갖는 병에 걸리지 않은 개인을 확인하는 것, 치료 요법을 개발하는데 상기 정보가 유용할 수 있는 질환에 대한 유전자 중 1 카피를 갖는 병에 걸리지 않은 개인을 확인하는 것, 착상전 유전적 진단, 산전 진단 시험, 신생아 선별, 계통 DNA 시험(유전적 계통 목적을 위해), 헌팅턴병과 같은 성인형(adult-onset) 장애를 예측하기 위한 전증상 시험, 성인형 암 및 알츠하이머병이 생길 위험성을 추정하기 위한 전증상 시험, 증상을 보이는 개인의 확정 진단, 및/또는 법의학/신원확인 테스트에 유용하다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 각막 이영양증의 검출에서 유용하다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 TGFβI 유전자에서 R124 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 C(G/A)C SNP로도 불리는 TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 418에서의 C의 A로의 전이에 의해 유발되는 R124H 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은, 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 TGFβI 유전자에서 R555 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 (C/T)GG SNP로도 불리는 TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 1663에서의 C의 T로의 전이에 의해 유발되는 R555W 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은, 과립형 각막 이영양증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 TGFβI 유전자에서 R124 및/또는 626 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 (C/T)GC SNP SNP로도 불리는 TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 417에서의 C의 T로의 전이에 의해 유발되는 R124C 돌연변이 또는 TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 1924에서의 A의 C로의 전이에 의해 유발되는 H626P 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은, 래티스 이상증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 TGFβI 유전자에서 R124 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 C(G/T)C SNP로도 불리는 TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 418에서의 G의 T로의 전이에 의해 유발되는 R124L 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은, 레이스버클러 각막 이영양증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 TGFβI 유전자에서 R555 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 C(G/A)G SNP로도 불리는 TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 1664에서의 G의 A로의 전이에 의해 유발되는 R555Q 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은, 티엘벵케 각막 이영양증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다.
일부 구현예에서, 신생아 선별은 유전적 장애를 확인하기 위해 출생 후 곧바로 이용되는 어떤 유전적 스크리닝을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 요법이 생애 초기에 결정되므로, 신생아 선별은 유전적 장애의 확인에 유용하다. 그러한 시험은 비제한적으로 페닐케톤뇨증 및 선천성 갑상선 기능 저하증에 대해 유아를 시험하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일 카피의 유전자 돌연변이를 갖는 사람을 확인하기 위해 보인자 시험(carrier testing)이 이용된다. 일부 경우에, 2 카피로 존재할 때, 돌연변이는 유전적 장애를 일으킬 수 있다. 일부 경우에, 1 카피는 유전적 장애를 일으키는데 불충분하다. 일부 경우에, 주어진 환자를 위해 적절한 치료 요법을 수행하는 것을 보장하기 위해 아벨리노 돌연변이의 존재 및 수술 절차를 수행하기 전 사전-스크리닝과 같이, 2 카피의 존재는 특정한 치료 요법에 대해 금지된다. 일부 구현예에서, 그러한 정보는 또한 출산을 고려하고 있는 개인에게 유용하며, 개인이 현명한 결정을 하는 것을 도울 뿐만 아니라, 개별 환자 뿐만 아니라 환자의 친척들에게 중요한 조언을 제공하는데 있어 의료 분야의 숙련가에게 도움을 준다.
일부 구현예에서, 예측하는 유형 및/또는 전증상 유형의 시험이 다양한 장애와 관련된 유전자 돌연변이를 검출하는 데 사용된다. 일부 경우에, 이들 시험은 유전적 장애가 있는 가족 구성원이 있지만 시험 시점에는 상기 장애의 어떠한 특징도 나타내지 않을 수 있는 사람에게 도움이 된다. 일부 구현예에서, 예측 시험은 예를 들면 비제한적으로 어떤 유형의 암을 포함하는 유전적 기초를 갖는 장애가 생길 사람의 가능성을 증가시키는 돌연변이를 확인한다. 일부 구현예에서, 전증상 시험은 어떤 신체적 징후 또는 증상이 나타나기 전에, 사람이 유전적 장애가 생길지 여부를 판단하는 데 유용하다. 예측 및 전증상 시험의 결과는 특정 장애가 생길 사람의 위험성에 관한 정보를 제공하고 환자뿐만 아니라 환자의 친척을 위해 적절한 의료 치료 요법에 관해 결정을 내리는 데 도움을 준다. 예측 시험은 또한 비제한적으로 치료레이저각막절제술(phototherapeutic keratectomy(PTK)) 및/또는 굴절교정 레이저각막절제술(Photorefractive keratectomy(PRK))과 같은, 라식 수술 및/또는 다른 굴절 수술을 수행하는 것을 금지하는 아벨리노 돌연변이의 존재와 같은, 어떤 치료 요법을 금지하는 돌연변이를 검출하기 위해, 일부 구현예에서 이용된다. 예를 들면, 아벨리노 돌연변이를 나타내는 환자는 라식 수술 또는 다른 굴절 수술을 해서는 안 된다.
일부 구현예에서, 진단 시험은 또한 유전적 변이가 약물 반응에 미치는 영향을 판단하는 유전적 시험을 포함하는 파마코게노믹스(pharmacogenomics)를 포함한다. 상기 파마코게노믹스 분석으로부터 얻은 정보는 적절한 치료 요법을 결정하고 개발하는 데 유용하다. 의료 분야의 숙련가는 적절한 치료 요법을 설계하는 데 있어서 유전적 변이의 존재 및/또는 부재에 관한 정보를 이용한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법을 이용하여 유전적 프로파일이 결정되는 질환은 비제한적으로 안과 장애, 암, 당뇨병, 고혈압, 정신분열증, 및 가장 흔한 선천성 기형, 예컨대 구순구개열(cleft lip), 구개 파열(cleft palate), 신경관 결손, 연골형성부전(Achondroplasia), 알파-1 항트립신 결핍, 항인지질 증후군, 자폐증, 상염색체 우성 다낭성 신장 질환, 샤르코마리투스(Charcot-Marie-Tooth), 대장암, 묘성 증후군(Cri du chat), 크론병, 낭포성 섬유증, 더컴병(Dercum disease), 다운 증후군, 듀안 증후군, 뒤센형 근육위축증(Duchenne Muscular Dystrophy), 인자 V 라이덴 혈전증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 가족성 지중해 열병, 취약 X 증후군, 고셰병, 혈색소 침착증, 혈우병, 완전전뇌증(Holoprosencephaly), 헌팅턴병, 클라인펠터 증후군, 마르판 증후군(Marfan syndrome), 근긴장성 이상증(myotonic dystrophy), 신경섬유종증, 누난 증후군(Noonan Syndrome), 골형성부전증(osteogenesis imperfecta), 파킨슨병, 페닐케톤뇨증, 폴란드 기형(Poland Anomaly), 포르피린증(Porphyria), 조로증(Progeria), 색소성 망막염, 중증 복합 면역결핍증(SCID), 겸상 세포 질환, 척수성 근위축증, 테이삭스병(Tay-Sachs), 지중해 빈혈, 트리메틸아민뇨증, 터너 증후군, 구개심장안면증후군(Velocardiofacial Syndrome), WAGR 증후군, 윌슨병, 뿐만 아니라 유전적 성분과 관련된 임의의 다른 질환을 포함한다. 안과 장애 및/또는 안과 성분을 포함하는 장애는 비제한적으로 선립종안검맥립종(chalazion), 다래끼(stye), 첩모난생중(trichiasis), 안검내반(entropion), 안검외반(ectropion), 토안(lagophthalmos), 안검염(bleharitis), 누낭염(dacryocystitis), 안와봉와염(orbital cellulitis), 익상편(ptergium), 익상편 각막 이영양증(pterygiumcorneal dystrophy), 결막염(conjunctivitis), 신생아 안염(ophthalmia neonatorum), 박테리아 각막 궤양, 진균 각막 궤양, 녹내장, 푸크스 이상증(Fuchs dystropy), 원뿔 각막(keratoconus), 진행성 황반 변성, 색소성 망막염(Retinitis pigmentosa, 백내장, 망막 장애, 황반 변성, 당뇨병성 눈 문제(예를 들면, 당뇨병성 망막증), 실눈-눈꺼풀처짐-역내안각주름 증후군(blepharophimosis-ptosis-epicanthus-inversus syndrome(BPES)), 안피부백피(oculocutaneous albinism), 마르판 증후군(Marfan syndrome), 스티클러 증후군(Stickler syndrome), 및 CHARGE(coloboma, heart anomalies, atresia of the choanae, retardation of growth and development, genital/urinary anomalies, ear abnormalities or deafness) 증후군을 포함한다. 각막 이영양증은 비제한적으로 아벨리노 각막 이영양증, 과립형 각막 이영양증, 래티스 타입 I 각막 이영양증, 푸크스 이상증, 티엘벵케 및 레이스버클러스 각막 이영양증을 포함한다. 암은 비제한적으로 암종, 육종, 아세포종, 림프종, 백혈병 생식 세포 종양, 및 미지 기원의 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 암은 비제한적으로 두경부, 피부, 대장, 구강, 교아종, 유방, 후두, 식도, 내피, 자궁내막, 난소, 폐, 비뇨생식기, 직장, 전립선, 신장, 흑색종, 신장, 췌장, 위장, 혈액, 간, 자궁 및 뇌뿐만 아니라 유두종 바이러스-유도된 암과 같은 바이러스 유도된 암을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 개인을 위한 유전적 프로파일을 결정하는 데 사용되는 게놈 DNA를 제공함으로써 개인 맞춤형 약물 치료 요법의 개발에 유용하다. 일부 구현예에서, 그러한 유전적 프로파일 정보는 치료 요법을 결정하고/거나 개발하기 위해 본 기술분야의 숙련가에 의해 이용된다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 방법에 의해 단리된 핵산에서 확인된 다양한 유전적 변이 및 돌연변이의 존재 및/또는 부재는 개인 맞춤형 약물 치료 요법 또는 계획의 일부로서 본 기술분야의 숙련가에 의해 사용된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 상기 개시된 방법을 이용하여 수득된 정보는 특정 질환에 대한 진단을 결정하고/거나 치료 요법을 결정하기 위해 데이터베이스 또는 다른 확립된 정보와 비교된다. 일부 경우에, 특정한 환자에서 유전적 돌연변이의 존재 또는 부재와 관련된 정보는 제안된 치료 요법과 관련된 결정을 내리기 위해 데이터베이스 또는 다른 표준 출처의 정보와 비교된다. 일부 경우에, 유전적 돌연변이의 존재는 특정한 치료 요법을 수행하는 것을 가리킨다. 일부 경우에 유전적 돌연변이의 부재는 특정한 치료 요법을 수행하지 않는 것을 가리킨다.
일부 구현예에서, 특정한 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재에 관한 정보는 치료약(therapeutic entity)을 이용한 치료의 치료 효능을 확인하기 위한 것뿐만 아니라, 치료약을 이용한 치료를 위한 치료 요법을 조정하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재에 관한 정보는 치료 요법을 수행할지 여부를 결정하는 데 이용된다. 일부 구현예에서, 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재에 관한 정보는 치료 요법을 계속할지 여부를 결정하는 데 이용된다. 일부 구현예에서, 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재는 치료 요법을 중단할지 여부를 결정하는 데 이용된다. 다른 구현예에서, 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재는 치료 요법을 변형할지 여부를 결정하는 데 이용된다. 일부 구현예에서, 유전적 변이의 존재 및/또는 부재는 치료 요법의 일부로서 투여되고 있는 치료의 투여량을 증가시키거나 감소시킬지 여부를 결정하는 데 사용된다. 다른 구현예에서, 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재는 치료 요법의 일부로서 투여된 치료의 투여 빈도를 바꿀지 여부를 결정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재는 치료의 1일당, 1주일당 투여 수, 1일당 시간을 바꿀지 여부를 결정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재는 치료의 투여량을 바꿀지 여부를 결정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재는, 치료 요법을 개시하기 전 및/또는 치료 요법을 시작한 후에 확인한다. 일부 구현예에서, 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재를 확인하고, 유전적 돌연변이의 존재 또는 부재에 관한 지정된 표준 정보와 비교한다.
일부 구현예에서, 상기 개시된 방법을 이용하여 하나를 초과하는 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재의 복합(composite)이 생성되며, 그러한 복합은 하나를 초과하는 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재에 관한 정보의 임의의 수집을 포함한다. 일부 구현예에서, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상 또는 40 이상의 유전적 돌연변이의 존재 또는 부재가 조사되며 이는 복합의 생성을 위해 사용된다. 예시적인 정보는, 일부 구현예에서, 핵산 또는 단백질 정보, 또는 핵산 및/또는 단백질 유전적 돌연변이 모두와 관련된 정보의 조합을 포함한다. 일반적으로, 상기 복합은 유전적 돌연변이의 존재 및/또는 부재에 관한 정보를 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 복합은 치료 요법을 수행하거나, 유지하거나 또는 중단하기 위해 지정된 표준 정보와의 비교를 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 비제한적으로 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP, 과립형 각막 이영양증 관련 SNP, 래티스 이상증 관련 SNP, 레이스버클러 각막 이영양증 관련 SNP, 및/또는 티엘벵케 각막 이영양증 관련 SNP로부터 선택되는 2, 3, 4 또는 5개의 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 과립형 각막 이영양증 관련 SNP, 래티스 이상증 관련 SNP, 레이스버클러 각막 이영양증 관련 SNP, 및/또는 티엘벵케 각막 이영양증 관련 SNP와 조합되어, 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP, 래티스 이상증 관련 SNP, 레이스버클러 각막 이영양증 관련 SNP, 및/또는 티엘벵케 각막 이영양증 관련 SNP와 조합되어, 과립형 각막 이영양증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP, 과립형 각막 이영양증 관련 SNP, 레이스버클러 각막 이영양증 관련 SNP, 및/또는 티엘벵케 각막 이영양증 관련 SNP와 조합되어, 래티스 이상증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP, 과립형 각막 이영양증 관련 SNP, 래티스 이상증 관련 SNP, 및/또는 티엘벵케 각막 이영양증 관련 SNP와 조합되어, 레이스버클러 각막 이영양증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP, 과립형 각막 이영양증 관련 SNP, 래티스 이상증 관련 SNP 및/또는 레이스버클러 각막 이영양증 관련 SNP와 조합되어, 티엘벵케 각막 이영양증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다.
일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP로부터 선택된 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 상기 SNP는 인간 TGFβI 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드의 위치 124, 555 및/또는 626에서 돌연변이를 야기하는 SNP를 포함한다. 이들 돌연변이는 TGFβI 유전자에서 R124 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 C(G/A)C SNP로도 지칭되는, TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 418에서 G의 A로의 전이에 의해 야기되는 R124H 돌연변이를 포함)를 야기하는 것, TGFβI 유전자에서 R555 돌연변이 ((C/T)GG SNP로도 지칭되는, TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 1663에서 C의 T로의 전이에 의해 야기되는 R555W 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은 과립형 각막 이영양증 관련 SNP, TGFβI 유전자에서 R124 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 (C/T)GC SNP로도 지칭되는, TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 417에서 C의 T로의 전이에 의해 야기되는 R124C 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은 래티스 이상증 관련 SNP, TGFβI 유전자에서 R124 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 C(G/T)C SNP로도 지칭되는, TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 418에서 G의 T로의 전이에 의해 야기되는 R124L 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은 레이스버클러 각막 이영양증 관련 SNP 및/또는 TGFβI 유전자에서 R555 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 C(G/A)G SNP로도 지칭되는, TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 1664에서 G의 A로의 전이에 의해 야기되는 R555Q 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은 티엘벵케 각막 이영양증 관련 SNP를 포함한다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은 예를 들면 TGFβI 유전자에서 R555 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 (C/T)GG SNP로도 지칭되는 TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 1663에서 C의 T로의 전이에 의해 야기되는 R555W 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은 과립형 각막 이영양증 관련 SNP와 조합되어, TGFβI 유전자에서 R124 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 C(G/A)C SNP로도 지칭되는, TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 418에서 G의 A로의 전이에 의해 야기되는 R124H 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은 예를 들면 TGFβI 유전자에서 H626P 돌연변이(예를 들면 비제한적으로 TGFβI 유전자의 뉴클레오타이드 1924에서 A의 C로의 전이에 의해 야기되는 H626P 돌연변이를 포함)를 야기하는 것과 같은, 아벨리노 각막 이영양증 관련 SNP의 검출을 통해 검출된다.
일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q 및/또는 H626P 중 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 R124C, R124H, R124L, R555W, 및/또는 R555Q 중 2, 3, 4 및/또는 5개의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 R124H, R124L, R555W 및/또는 R555Q 중 하나 이상과 조합되어R124C의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 R124C, R124L, R555W 및/또는 R555Q 중 하나 이상과 조합되어 R124H의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 R124C, R124H, R124L 및/또는 R555Q 중 하나 이상과 조합되어 R555W의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 R124C, R124H, R124L 및/또는 R555W 중 하나 이상과 조합되어 R555Q의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, R124H는 R555W과 조합되어 검출된다. 일부 구현예에서, 각막 이영양증은, 예를 들면 R124C, R124H, R124L, R555W 및/또는 R555Q 중 하나 이상과 조합되어 H262P의 검출을 통해 검출된다. 일부 구현예에서, R124C, R124H, R124L, R555W 및/또는 R555Q가 모두 검출된다. 일부 구현예에서, R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q 및/또는 H626P가 모두 검출된다.
VIII.
진단 키트
일부 구현예에서, 상기 기재된 시약 중 어느 것 또는 모두는 진단 키트 내로 포장된다. 그러한 키트는 본원에 기재된 프라이머, 프로브, 버퍼 및/또는 다른 시약 중 어느 것 및/또는 모두를 임의의 조합으로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q 및/또는 H626P 중 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 검출을 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124C, R124H, R124L, R555W 및 R555Q 중 2, 3, 4, 및/또는 5개의 검출을 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124C, R124H, 및 R124L의 검출을 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R555W 및 R555Q의 검출을 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124C의 검출을 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124H의 검출을 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124L의 검출을 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R555W의 검출을 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R555Q의 검출을 위한 시약을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q 및/또는 H626P 중 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124C, R124H, R124L, R555W 및 R555Q 중 2, 3, 4, 및/또는 5개의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124C, R124H, 및 R124L의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R555W 및 R555Q의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124C의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124H의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R124L의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R555W의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 R555Q의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, H626P의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트 내의 시약은 동결건조된 분말로서 포함된다. 일부 구현예에서, 키트 내의 시약은 재구성을 위한 설명서와 함께 동결건조된 분말로서 포함된다. 일부 구현예에서, 키트 내의 시약은 액체로서 포함된다. 일부 구현예에서, 시약은 플라스틱 및/또는 유리 바이알 또는 다른 적절한 용기 내에 포함된다. 일부 구현예에서 프라이머 및 프로브는 키트 내의 개별적인 용기 내에 모두 함유된다. 일부 구현예에서, 프라이머는 하나의 용기에 함께 포장되고, 프로브는 또 다른 용기에 함께 포장된다. 일부 구현예에서, 프라이머 및 프로브는 하나의 용기에 함께 포장된다.
일부 구현예에서, 키트는 대조군 gDNA 및/또는 DNA 샘플을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서 포함된 대조군 DNA 샘플은 TGFβI R124 정상이다. 일부 구현예에서 포함된 대조군 DNA 샘플은 R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q 및/또는 H626P를 포함하는, 검출되는 돌연변이에 상응한다. 일부 구현예에서, TGFβI R124 정상에 상응하는 대조군 DNA 샘플 및 R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q 및/또는 H626P에 상응하는 돌연변이 DNA 샘플이 포함된다. 일부 구현예에서, TGFβI R124 정상에 상응하는 대조군 DNA 샘플 및 R124C, R124H, R124L, R555W 및/또는 R555Q에 상응하는 돌연변이 DNA 샘플이 포함된다. 일부 구현예에서, TGFβI R124 정상에 상응하는 대조군 DNA 샘플 및 R124C, R124H 및/또는 R124L에 상응하는 돌연변이 DNA 샘플이 포함된다. 일부 구현예에서, TGFβI R124 정상에 상응하는 대조군 DNA 샘플 및 R555W 및/또는 R555Q에 상응하는 돌연변이 DNA 샘플이 포함된다. 일부 구현예에서, TGFβI R124 정상에 상응하는 대조군 DNA 샘플 및 R124C에 상응하는 돌연변이 DNA 샘플이 포함된다. 일부 구현예에서, TGFβI R124 정상 DNA에 상응하는 대조군 DNA 샘플 및 R124H에 상응하는 돌연변이 DNA 샘플이 포함된다. 일부 구현예에서, TGFβI R124 정상에 상응하는 대조군 DNA 샘플 및 R124L에 상응하는 돌연변이 DNA 샘플이 포함된다. 일부 구현예에서, TGFβI R124 정상 DNA에 상응하는 대조군 DNA 샘플 및 R555W에 상응하는 돌연변이 DNA 샘플이 포함된다. 일부 구현예에서, TGFβI R124 정상에 상응하는 대조군 DNA 샘플 및 R555Q에 상응하는 돌연변이 DNA 샘플이 포함된다. 일부 구현예에서, TGFβI R124 정상에 상응하는 대조군 DNA 샘플 및 H626P에 상응하는 돌연변이 DNA 샘플이 포함된다. 일부 구현예에서, 대조군 DNA 샘플의 농도는 5 ng/μL, 10 ng/μL, 20 ng/μL, 30 ng/μL, 40 ng/μL, 50 ng/μL, 60 ng/μL, 70 ng/μL, 80 ng/μL, 90 ng/μL, 100 ng/μL, 110 ng/μL, 120 ng/μL, 130 ng/μL, 140 ng/μL, 150 ng/μL, 160 ng/μL, 170 ng/μL, 180 ng/μL, 190 ng/μL 또는 200 ng/μL이다. 일부 구현예에서, 대조군 DNA 샘플의 농도는 50 ng/μL, 100 ng/μL, 150 ng/μL 또는 200 ng/μL이다. 일부 구현예에서, 대조군 DNA 샘플의 농도는 100 ng/μL이다. 일부 구현예에서, 대조군 DNA 샘플들은 동일한 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 대조군 DNA 샘플들은 상이한 농도를 갖는다.
일부 구현예에서, 키트는 버퍼, 예를 들면, GTXpress TAQMAN® 시약 혼합물, 또는 임의의 동등한 버퍼를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 버퍼는 본원에 기재된 임의의 버퍼를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 벡터(예컨대, M13 벡터 포함)와 같은, 클로닝에 사용하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 DNA의 정제에 사용하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 대상에서 각막 이영양증의 검출을 위한 키트를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 설명서는 본원에 기재된 프로토콜의 다양한 양태를 포함한다.
실시예
실시예
1: DNA 추출(DNA Extract All Reagents,
ThermoFisher
)
하기 기재된 바와 같이 그리고 본원에 제공된 개시내용에 따라 구강 상피 또는 모근 또는 전혈로부터 DNA를 추출하였다.
구강 상피 또는 모근으로부터 DNA를 추출하기 위해, 샘플을 먼저 1X PBS 300 μL에서 전처리하였다. 그 다음, 30 μL 용해액을 튜브에 부가하고, 상기 혼합물을 볼텍싱하였다. 그리고 나서, 상기 혼합물을 95℃에서 3분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 30 μL의 DNA 안정화 용액(Life Technologies/Thermo Scientific, USA)을 부가하고 상기 혼합물을 볼텍싱하였다. 그리고 나서, 상기 혼합물을 13,000 RPM에서 1분 동안 원심분리하였다.
전혈로부터 DNA를 추출하기 위해, 3 μL의 전혈로 출발하여, 샘플을 먼저 1X PBS 300 μL에서 전처리하였다. 그 다음, 30 μL의 용해액을 튜브에 부가하고, 상기 혼합물을 볼텍싱하였다. 그리고 나서, 상기 혼합물을 95℃에서 3분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 30 μL의 DNA 안정화 용액(Life Technologies/Thermo Scientific, USA)을 부가하고 상기 혼합물을 볼텍싱하였다. 그리고 나서, 상기 혼합물을 13,000 RPM에서 1분 동안 원심분리하였다.
상기 과정을 완료한 후, 상업적으로 이용가능한 Tecan® Infinite® 200 PRO NanoQuant를 이용하여 DNA 농도를 판독하였다. 정량을 위해, 100 μL의 용리액을 투명한 96 웰 플레이트 내로 피펫팅하였다. 그 다음, 100 μL의 준비된 블랭크 용액을 웰 H12에 부가하였다. 그리고 나서, NanoQuant와 함께 제공된 제조사의 설명서를 이용하여 농도를 판독하였다.
하기 표 5 및 6에 기재된 프로브 및 프라이머를 이용하여 반응 혼합물을 준비하였다.
프로브 서열 | |
프로브 | 서열 |
TGFβI R124정상 (서열번호: 25) | VIC-CAC GGA CCG CAC GGA- MGB NFQ |
TGFβI R124H (서열번호: 26) | FAM-CAC GGA CCA CAC GGA- MGB NFQ |
TGFβI R124C (서열번호: 48) | FAM-CAC GGA CTG CAC GGA- MGB NFQ |
TGFβI R124L (서열번호: 49) | FAM-CAC GGA CCT CAC GGA- MGB NFQ |
TGFβI R555정상 (서열번호: 45) | VIC-CAC CAA GAG AAC GGA-MGB NFQ |
TGFβI R555W (서열번호: 46) | FAM-CAC CAA GAG AAT GG-MGB NFQ |
TGFβI R555Q (서열번호: 50) | FAM-AC CAA GAG AAC AGA G-MGB NFQ |
프라이머 서열 | |
프라이머 | 서열 |
TGFβI 124 F (서열번호: 1) | TCC ACC ACC ACT CAG CTG TA |
TGFβI 124 R (서열번호: 2) | CCA TCT CAG GCC TCA GCT T |
TGFβI 555 F (서열번호: 43) | ACA CAG TCT TTG CTC CCA CAA A |
TGFβI 555 R (서열번호: 44) | ACT TAA GTT GGT CTT TAC CCA AGA GTC T |
예시적인 반응 혼합물에 사용된 성분 및 비율이 하기 표 7에 나타나 있다.
반응 혼합물 | ||
All reagent extract (전혈) | 3.00 μl | |
GTXpress TaqMan® | 10.00 μl | |
프라이머 (124R) (역방향) | 10 pMol | 0.50 μl |
프라이머 (124F) (정방향) | 10 pMol | 0.50 μl |
프라이머 (555R) (역방향) | 10 pMol | 0.50 μl |
프라이머 (555F) (정방향) | 10 pMol | 0.50 μl |
프로브 (NL/VIC) | 10 pMol | 0.20 μl |
프로브 (R124H/FAM) | 10 pMol | 0.30 μl |
프로브 (R124C/FAM) | 10 pMol | 0.20 μl |
프로브 (R124L/FAM) | 10 pMol | 0.50 μl |
프로브 (R555N/VIC) | 10 pMol | 0.20 μl |
프로브 (R555Q-1/FAM) | 10 pMol | 0.20 μl |
프로브 (R555W/FAM) | 10 pMol | 0.20 μl |
증류수 | 3.20 μl |
예시적인 PCR 사이클링 조건이 하기 표 8에 나타나 있다.
PCR 사이클링 | ||||
판독 전 | 유지 단계 |
사이클링 단계
40 사이클 |
판독 후 | |
60℃ | 95℃ | 95℃ | 64℃ | 60℃ |
1분 | 20초 | 3초 | 30초 | 1분 |
상기 프로토콜을 사용하여 도 4-8에 제공된 실시간 PCR 데이터를 생성하였다.
참고문헌
모든 제목 및 부분 명칭은 단지 명확성 및 참고 목적을 위해 사용되며 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 기술분야의 숙련가는 본원에 기재된 발명의 의미 및 범위에 따라 상이한 제목의 다양한 양태를 적절하게 조합하는 유용성을 인식할 것이다.
본원에 언급된 모든 참고문헌은 마치 각각의 개별적인 문헌 또는 특허 또는 특허출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로써 본원에 통합된 것으로 명시적으로 그리고 개별적으로 표시된 것과 같은 정도로 그 전체가 참고로써 그리고 모든 목적을 위해 본원에 참고로 통합된다.
본 기술분야의 숙련가에게 자명할 바와 같이, 그 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원의 많은 변형 및 변이가 이뤄질 수 있다. 본원에 기재된 특정한 구현예 및 실시예는 단지 예로써 제공되며, 본원은 청구항이 가지는 등가물의 전체 범위에 따라, 첨부된 청구항의 용어에 의해서만 한정될 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Avellino Lab USA, Inc.
<120> METHODS FOR MULTIPLEX DETECTION OF ALLELES ASSOCIATED WITH OPHTHALMIC CONDITIONS
<130> 070335-5007-WO
<140> PCT/US14/65975
<141> 2014-11-17
<150> 61/905,051
<151> 2013-11-15
<160> 52
<170> Patentin version 3.2
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<223> probe
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<213> Artificial Sequence
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<223> probe
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<211> 24
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<223> probe
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gctgtacacg gaccacacgg agaa 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
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<211> 15
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> probe
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
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accacacgga gaagctgagg c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
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<220>
<223> probe
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accacacgga gaagctgagg cctg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Normal Probe 10
<400> 45
Val Ile Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys Gly
1 5 10 15
Gly Ala Asn Phe Gln
20
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant Probe 10
<400> 46
Phe Ala Met Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gly Asn Phe Gln
20
<210> 47
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Normal Probe 10a
<400> 47
Val Ile Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Cys Gly
1 5 10 15
Gly Ala Gly Asn Phe Gln
20
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<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #TGFBI R124C
<400> 48
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1 5 10 15
Gly Ala Asn Phe Gln
20
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #TGFBI R124L
<400> 49
Phe Ala Met Cys Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Cys Ala Cys Gly
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tgcaacctca acaccctcct ggaaagagga gaatactggg gatatcctgg ggtctttctg 1560
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gaaagatgag agggatatga ggcctcaaca tcaaaatgca agcacctggc atttttatta 1680
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tagtgaggta gagagtgact tagttcagac acagaatgct gttgggagag taataactat 2580
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gcccagaagc aacttgctca tttcaattaa gcttcagcat gaacttccta tgtacacagc 2820
ccacccacac tccccgatgt gagaaggaga gggtcacagc cgcccccagc ctctgctgct 2880
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ctcttgggta aagaccaact taagtacacg tctccatttt tctaaagtag tgatccctca 27840
gggccccagc agcaaacagt tggcacatca aggattgact tgaagggatt ttatgacaag 27900
actattagtg aaagagtggg cgggactaaa ggaactagca aaggatgagg ccaaccaggg 27960
actagcaacc ctgggaagcc tttactaccc ctaggcctgg gggaatggga ggatgagagc 28020
aggaaccagg gaggtcatga gccttggaca agggcacaga acagcagcca gagccatgtg 28080
cagccagcca ctgtcagaac catgcaaggg ggaccactca gcgccccagc ctccctctca 28140
gacagttgcc atctgggtct cttgttggct gatgcgagag caggagggag cccactgatg 28200
cagttcatag agctcagcct cctgggcagg aaaccgggca gagaggagta gaaaagaatt 28260
aagggtggct gcgaccagcc cagtcactga ggcacgtttc ccactggaga cctatgagca 28320
cagtgataat aaagccagtt acctgcactg actatccctc cagacaaaag ctttcccaag 28380
aagttagtca tggctctgag agatctagtt gaggatgttt ggcaggggat ctagtggtta 28440
cgggtggcta agaaaaatga ggaaggtaag agtatcttgc agcctgtgtt gggaggatta 28500
aataggatgc cacacacagg gccaggcaga cagcctggtc agtaatagcc atgacgatgg 28560
gggcgggggg agcaggaatg ggagttgcag tgtttagctc agatgcatgc ctgtgagaga 28620
tgcttccact ctcacagaaa gatgagacca aggaaaagga ggaggaagag gaaggacctt 28680
gacaaacctt ggggcccaca ttgtctacac ctcccttcct gctctagagc agaatagaaa 28740
gttcaggttg caggcagctc taagttgaat tcgtgtcctg tttaattttc tttattgcta 28800
aatgaatgcc tgtgtctgtg atgctgacgt atgttcctaa ggagagggga gaagttcatt 28860
ctgaacataa acttttcatc ctctctctgt ccagcaagaa tggaatattc cccaagtggc 28920
ctgagccagc ttggctttct ttttgttttc aattatgtgg gagttgagga gggggatggg 28980
aaaagcttcc caaacacacc ctcccccagg cctgaggcac ccctggggga cagagagtgt 29040
tagaggttgg tacaggtgtt agagatattg aaaggacatc ccatgcaccc caggggctgg 29100
tgtggctctg tacttccagg caatattttg tggaagggga accttgtcag ctccaggttg 29160
tggatgtttg aaaatcagtt ggtacccagt ggctccatcc tctggcaggc atgtggattt 29220
gtcaataacc aagtgaactc tccaaaataa gttaaaactt cctcccttct cagtttcaag 29280
atgctggaaa tagctgttca taagccctgg ggaaatttag ccctttggct ggtaatggga 29340
gtatccgaga tgagagggca gctggaaact ttcggaatga cctcccacac ttaatttggg 29400
aaatgcctct gcacctttat gggcaaccag atgcctgccc cagttgctgg agacactgat 29460
gtgggctgaa aggaatgctg agacgtgacg aggagagatg ctgcggaggg aatatccccc 29520
tcagccctga cctcatcggc tccatggctc ctccacagta cagctgtcta ctcttttaag 29580
ttctcccttc aggaaatagc catctcaaac agaatgtgca tttgagggca gaatgtgtaa 29640
atattgcact actgtgttat aaccgtcagg agccatgctg atgatgaaac gtcccagatg 29700
ccggtgctgg aaaggtccct ggctttccaa gcaaatattt atctcatgga aacatgagtc 29760
atactcacag aggagtatgg attaactcct tctcagcagc cagggagccc agcatcccag 29820
acagcatatt taacccagag gccaactgac tgctggggca gatttgtggt catgaacatg 29880
tgctttgtgt cctctgacca ttagacagat tgtgggtcac aacgttgagt atacagtggg 29940
agcttaataa gtgcttattc cctgggcagg gagttcttca tttcaggggt gaccacttac 30000
atcttctcct ctgggccctc cttgaccagg ctaattacca ttcttgggat taactctatc 30060
tccttttccc gcaacctgca ggagatgcca aggaacttgc caacatcctg aaataccaca 30120
ttggtgatga aatcctggtt agcggaggca tcggggccct ggtgcggcta aagtctctcc 30180
aaggtgacaa gctggaagtc agcttggtaa gtgtcctgca aatcaaaggc tggctaaatt 30240
tccccagggc agggctccag gacatatctc acccccagga tggaattata cacacacaac 30300
cttcaagttg cagcccgaat ctctgagtgt aattcgtcca aagaaaaaga gaaaagagaa 30360
gagggtcttc agggaaatca agtgagatca tagttagaca tgagtaagaa cttccagatt 30420
tacaagggaa tagagcatct gatttggcat ctgagagagg ctattagatc ttccttctct 30480
taaggaggtt gtaggcaact agttatgtga ctgaagagat cagtctgtac tcacaccatc 30540
ccacccccca aacccagggc ttcactgagt tgtaccatga accagaccat cccaagaggc 30600
tttttgagtt ctgacacttg ctctgtgagc cttcccttgc tctgcacatt gatgatataa 30660
ctttgtaact gcactaagag tgttcctaaa gcagatagcc agccgagctc cagaaatctc 30720
cctggctgca cctgcagagg ccactgaccc ctctgtggag ggaccgctct tcagtgtgtg 30780
gctggcttct actctctgct cctctctctt ggtcttcagc catccattgc tcaccagttt 30840
ctcacgagga gcataggaag atatgcatgt agggaggtag gcacggggat gacttgtttg 30900
actttagcag gtcattcaag aatctcctcg cacctggttt cagatgctgg ggtcctgtct 30960
gtcacaggct tctgtgcctc ctaccccctt gagtttgtca catggccctt caggaaggcc 31020
tgagatagat ttgccctggg tgggcctcct atgagaaaat cttaagtgag gcacccaggc 31080
aaaatggaaa gagccttttg cccagagcag gaagcctgtc ttccatttcc agctgttcca 31140
cctacttagc ttaaaagagg cacttcgcct gtcttcagtc tcagtctcag tctcctcttc 31200
tgtggaatgg gacaataata tctactctcc ttatcataca ctgctgtgag gactgagtgg 31260
atcacacaaa aaagcattat gtaaattgca aagtgctaaa tccacacagg agatttgaat 31320
taatccacca cactgaaggt ctgtcaaggg cagggactgt ttcattcacc agagtatccc 31380
cagtctaaca caggacttgg catatgaaaa gtgttcagta ggccgggtgc agtggctcat 31440
gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccaa agtgggcgga tcatctgagg tcaggagttc 31500
aagtccagcc tggccaacgt ggtgaaacca catctctact aaaaatacaa aattagctgg 31560
gcgtggtggc acatgcctgt aatcacagct actctggagg ctgaggcagg agaatcactt 31620
gaacccagga ggcggaggtt gcagtgagtc gagatcatgc cactgcactc cagcctgggc 31680
gacaagattg aaactccatc tcaaaaacaa agaacaagga aaaaaacgaa aactgttcag 31740
taaacacttg ctgaatgaat aaaataaata tataaatgta taaataaatg ctctactttc 31800
aaccactact ctgtttttct tttagaaaaa caatgtggtg agtgtcaaca aggagcctgt 31860
tgccgagcct gacatcatgg ccacaaatgg cgtggtccat gtcatcacca atgttctgca 31920
gcctccaggt aagtgtcgca tccccactga ctctgcagcc agtccttttc ttcatgtggc 31980
agttggtgga gagaagaaaa actgttctaa acaatgatga gaataacatg taattgtgat 32040
agttaaactg tgcctatgtg actgattgca gagtgaattg ggagctgttg gttttgaatg 32100
caccacacta aggaatgtga ggacacattg ctctttgcgg agttgcccag ctatattagc 32160
tcccctcgga cacagcccag ttttctgtat tcgcgtggat gctgtccgcg cgattcccag 32220
cactcctctt acagcatctc acctcagtgt atgttccttg cctccagtgc agttgaacct 32280
cagtcctgcc tctcctcatg tgtgcattca cctttcttgg tgctctctcc ccatgggcca 32340
agttctacca tgagttatga aacattatgg agaaaacatg tctttggaaa tgtgagccag 32400
aaagcccacc agtgcccctc agtcacggtt gttatgaatg acatgctaat ggtttcactc 32460
tggtcaaacc tgccttttct ttcctcttca gccaacagac ctcaggaaag aggggatgaa 32520
cttgcagact ctgcgcttga gatcttcaaa caagcatcag cgttttccag ggtaagatgc 32580
ctgctaggtt tgcgcctagc ctgagcagcc tcaggtcctc tgtttgggcc atagaggagc 32640
ctctccagcc cctgtcttcc ttggctgctc cccagggctc tcttaaaact tctccccact 32700
cccactgagg catcctcagc cccagcctgt gtcaaattca gagtaaagaa ccaaggcaac 32760
tccctggctt tcatgggcca aagcgcaggc tttcacaccg aggcctctga gcctcagatc 32820
atggggaagt cactgctgga gagaacagac atagctctgg aagccatctg cccaagaggg 32880
cagcccatcc caagttcatc ttacagtggc caggcctgcc ctgagccggg gcctctgggt 32940
cactcttctg ctgtccatgg cattgcccat cctgggtgag gctggggctc tcctgggcac 33000
tgtatgtatt ctggatacag ggatactggg ctcgctatgt gtgtggagcc atcccttcct 33060
tgccccagcc ccacctccct ctcaaaccct ctctggctct ttctgagctt cctttcctgc 33120
tccccagctt gcccagtgct cagtgcccca cttggctctt ttgctacttc gggtcaggtg 33180
gagcctcttg ggaatgtgaa gtgccttaca gaaagattgc acttcaagag gagaggctgc 33240
agggagccat cctaaaccca gaggcctgga gcttactgtg tcactttact tttgtacaca 33300
ggggtctcct tagtgccctc gagaaggatt cttggccctg agcttctact cctgaggcca 33360
cctctgtgca gccccagctc cctcaactct aggctgtagt ctcagtggga aagcctggct 33420
tgggggtctc ctaggaatgt ccacctgaag gcacacttga taggggcttg cacaacttat 33480
gtctgccaag gccacctgag gaactccctg gtgcctataa gttccacctt ccccttcctc 33540
ttcctcgccc cagcattttt tctgagtagg ggtggcaatg ggcaaagcca ttgtcataag 33600
cagttgcagg tataactttc actagaaaac ctgacacctt gtgttttctt tcaggcttcc 33660
cagaggtctg tgcgactagg tgagtctggt ctgggtttga agtcattgca gacctgttta 33720
ggccttaccc ccaagcaagc ccaagcctgc catctgctgt atatagataa gaacatcatg 33780
gtgcagtaaa agaagcctgg cctttggagt cagaacagca gggtgacttg gggtcagacc 33840
cagagcaccc catttccttc tctgtaagat gaggataata agagtaacaa ccttttaggg 33900
ttaaggtgag ttttcagctt aggaagtctg ggaatattgc aaagggcttg gcaggaaccc 33960
atggtgagga tctagttcca agttgatagg tacagaaaac cagaacatcg ggccttgagt 34020
aaagagtgaa gtttcacaaa ccacaaagca cctgctatgt gcaggagagc atggcagaag 34080
gaggctgctt ggccctggtc cttgagattc tgacagtgtc ctagacagac atggggagat 34140
ctgcacctat ttgacgttac caacttctct ttttcagccc ctgtctatca aaagttatta 34200
gagaggatga agcattagct tgaagcacta caggaggaat gcaccacggc agctctccgc 34260
caatttctct cagatttcca cagagactgt ttgaatgttt tcaaaaccaa gtatcacact 34320
ttaatgtaca tgggccgcac cataatgaga tgtgagcctt gtgcatgtgg gggaggaggg 34380
agagagatgt actttttaaa tcatgttccc cctaaacatg gctgttaacc cactgcatgc 34440
agaaacttgg atgtcactgc ctgacattca cttccagaga ggacctatcc caaatgtgga 34500
attgactgcc tatgccaagt ccctggaaaa ggagcttcag tattgtgggg ctcataaaac 34560
atgaatcaag caatccagcc tcatgggaag tcctggcaca gtttttgtaa agcccttgca 34620
cagctggaga aatggcatca ttataagcta tgagttgaaa tgttctgtca aatgtgtctc 34680
acatctacac gtggcttgga ggcttttatg gggccctgtc caggtagaaa agaaatggta 34740
tgtagagctt agatttccct attgtgacag agccatggtg tgtttgtaat aataaaacca 34800
aagaaacata 34810
<210> 52
<211> 683
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gene protein product
<400> 52
Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu
20 25 30
Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val
35 40 45
Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn
50 55 60
Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly
85 90 95
Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val
100 105 110
Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu
115 120 125
Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser
130 135 140
Asn Glu Ala Trp Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val
145 150 155 160
Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val
165 170 175
Gly Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr
180 185 190
Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly
195 200 205
Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala
210 215 220
Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr
225 230 235 240
Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu
245 250 255
Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn
260 265 270
Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile
275 280 285
Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg
290 295 300
Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala
305 310 315 320
Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu
325 330 335
Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile
340 345 350
Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp
355 360 365
Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala
370 375 380
Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu
385 390 395 400
Gly Asn His Leu Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu
405 410 415
Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg
420 425 430
Asn Leu Leu Arg Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
435 440 445
Leu Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg
450 455 460
Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala
465 470 475 480
Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg
485 490 495
Val Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp
500 505 510
Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr
515 520 525
Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn
530 535 540
Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly
545 550 555 560
Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu
565 570 575
Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu
580 585 590
Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val
595 600 605
Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val
610 615 620
Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln
625 630 635 640
Glu Arg Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln
645 650 655
Ala Ser Ala Phe Ser Arg Ala Ser Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro
660 665 670
Val Tyr Gln Lys Leu Leu Glu Arg Met Lys His
675 680
Claims (76)
- 대상으로부터의 샘플에서 각막 이영양증과 관련된 적어도 2개의 게놈 대립유전자를 검출하는 방법으로서, 하기 (A) 내지 (F)를 포함하는 검출 방법:
(A) 기재(substrate)의 팁에 부착된, 대상의 상피 세포를 제공하는 단계;
(B) 상기 기재의 팁을, 상기 기재에 부착된 세포를 용해시키는 용해액 중에서 교반하는 단계;
(C) 상기 교반(B)이 완료되면, 상기 용해액으로부터 기재를 분리하는 단계;
(D) 상기 분리(C) 후, 상기 용해액을 인큐베이션하는 단계;
(E) 상기 용해액으로부터 게놈 DNA를 단리하여, gDNA 용액을 형성하는 단계; 및
(F) 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 및 상기 gDNA 용액을 이용하여 TGFβI 유전자 내에 존재하는 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 정체(identity)를 확인하는 단계로서, 상기 적어도 2개의 뉴클레오타이드는, 각막 이영양증과 관련된 각각의 독립적인 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 상응하는, TGFβI 유전자의 각각의 독립적인 위치에 위치하는 것인 단계. - 제1항에 있어서, 상기 TGFβI 유전자 내에 존재하는 적어도 2개의 뉴클레오타이드는 인간 게놈 내에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 검출 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 중 적어도 한 쌍은 서열번호: 1을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호: 2를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 것인 검출 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 중 적어도 한 쌍은 서열번호: 43을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호: 44를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 것인 검출 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍은 제1 증폭 프라이머쌍 및 제2 증폭 프라이머쌍을 포함하고,
상기 제1 증폭 프라이머쌍은 서열번호: 1을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호: 2를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하며;
상기 제2 증폭 프라이머쌍은 서열번호: 43을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호: 44를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 것인 검출 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확인 단계(F)는
(i) 서열번호: 25를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 제1 야생형 검출 프로브 및 서열번호: 26, 서열번호: 48, 또는 서열번호: 49를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 제1 돌연변이 검출 프로브; 및
(ii) 서열번호: 45 또는 서열번호: 47을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 제2 야생형 검출 프로브 및 서열번호: 46 또는 서열번호: 50을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 제2 돌연변이 검출 프로브
를 사용하는 것을 추가로 포함하는 것인 검출 방법. - 각막 이영양증을 검출하는 방법으로서, 하기 (A) 내지 (D)를 포함하는 검출 방법:
(A) 적어도 제1 증폭 프라이머쌍 및 적어도 제2 증폭 프라이머쌍을 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 인간 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터, 아미노산 잔기 124를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 TGFβI 유전자 서열 및 아미노산 잔기 555를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 TGFβI 유전자 서열을 포함하는, 적어도 2개의 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키는 단계;
(B) 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍의 제1 검출 프로브를 상기 제1 TGFβI 유전자 서열에 혼성화시키는 단계;
(C) 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍의 제2 검출 프로브를 상기 제2 TGFβI 유전자 서열에 혼성화시키는 단계; 및
(D) 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍을 포함하는 적어도 2개의 검출 프로브쌍의 사용에 기초하여 상기 제1 TGFβI 유전자 서열 및/또는 상기 제2 TGFβI 유전자 서열 내의 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 단계. - 제7항에 있어서, 상기 제1 TGFβI 유전자 서열 및/또는 제2 TGFβI 유전자 서열 내의 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 것은 제1 TGFβI 유전자 서열 및/또는 제2 TGFβI 유전자 서열 내의 2개 이상의 돌연변이를 검출하는 것을 포함하고, 상기 2개 이상의 돌연변이는 인간 게놈 내에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 검출 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 적어도 제1 증폭 프라이머쌍은 제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제1 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 1을 포함하고, 상기 제2 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 2를 포함하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 제2 증폭 프라이머쌍은 제3 증폭 프라이머 및 제4 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제3 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 43으로 표시되고, 상기 제4 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 44로 표시되는 것인 검출 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 제1 증폭 프라이머쌍은 제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머를 포함하고,
상기 제1 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 1을 포함하며,
상기 제2 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 2를 포함하고,
상기 제2 증폭 프라이머쌍은 제3 증폭 프라이머 및 제4 증폭 프라이머를 포함하며,
상기 제3 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 43을 포함하고,
상기 제4 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 44를 포함하는 것인 검출 방법. - 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이 중 하나는, 인코딩된 TGFβI 단백질 내에서, 아미노산 124에서, 시스테인으로 돌연변이된 아르기닌(R124C), 히스티딘으로 돌연변이된 아르기닌(R124H), 및/또는 류신으로 돌연변이된 아르기닌(R124L)에 상응하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이 중 하나는, 인코딩된 TGFβI 단백질 내에서, 아미노산 555에서, 트립토판으로 돌연변이된 아르기닌(R555W) 및/또는 글루타민으로 돌연변이된 아르기닌(R555Q)에 상응하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍 각각은 개별적으로 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 서열번호: 25-26, 서열번호: 25 및 48, 서열번호: 25 및 49, 서열번호: 27-28, 서열번호: 29-30, 서열번호: 31-32, 서열번호: 33-34, 서열번호: 35-36, 서열번호: 37-38, 서열번호: 39-40, 서열번호: 41-42, 서열번호: 45-46 및 서열번호: 46-47, 서열번호: 45 및 50, 및 서열번호: 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 뉴클레오타이드 서열쌍을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 26을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 45 및 서열번호: 46을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 47 및 서열번호: 46을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 48을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 49를 포함하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 45 및 서열번호: 50을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브쌍은 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제3 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제4 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 47 및 서열번호: 50을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제7항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 검출 프로브는 제1 표지와 커플링되고, 상기 제2 검출 프로브는 제2 표지에 커플링되는 것인 검출 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 제1 표지는 VIC이고, 상기 제2 표지는 FAM인 검출 방법.
- 제7항에 있어서, 혼성화 단계(B)와 혼성화 단계(C)를 동일한 용액 중에서 동시에 수행하는 것인 검출 방법.
- 제7항에 있어서, 혼성화 단계(B)와 혼성화 단계(C)를 동일한 용액 또는 상이한 용액 중에서 동시에 또는 상이한 시점에 수행하는 것인 검출 방법.
- 하기 (A) 및 (B)를 포함하는, 인간 대상에서 각막 이영양증을 검출하기 위한 반응 혼합물:
(A) (1) 상기 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 아미노산 잔기 124를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 2개의 TGFβI 유전자 서열 중 제1 TGFβI 유전자 서열을, 그리고 (2) 상기 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 아미노산 잔기 555를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 2개의 TGFβI 유전자 서열 중 제2 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키고 결정하기 위한 적어도 제1 증폭 프라이머쌍 및 제2 증폭 프라이머쌍; 및
(B) 적어도 2개의 검출 프로브쌍으로서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 각각에서의 검출 프로브는 적어도 2개의 TGFβI 유전자 서열 중 적어도 하나에 혼성화하는 것인 적어도 2개의 검출 프로브쌍. - 제26항에 있어서, 상기 제1 증폭 프라이머쌍은 제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제1 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 1을 포함하며, 상기 제2 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 2를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 제2 증폭 프라이머쌍은 제3 증폭 프라이머 및 제4 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제3 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 43을 포함하며, 상기 제4 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 44를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 적어도 하나는, 인코딩된 TGFβI 단백질에서, 아미노산 124에서, 시스테인으로 돌연변이된 아르기닌(R124C), 히스티딘으로 돌연변이된 아르기닌(R124H), 및/또는 류신으로 돌연변이된 아르기닌(R124L)에 상응하는 돌연변이를 검출하기 위해 사용되는 것인 반응 혼합물.
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 적어도 하나는, 인코딩된 TGFβI 단백질에서, 아미노산 555에서, 트립토판으로 돌연변이된 아르기닌(R555W) 및/또는 글루타민으로 돌연변이된 아르기닌(R555Q)에 상응하는 돌연변이를 검출하기 위해 사용되는 것인 반응 혼합물.
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍의 각각의 검출 프로브쌍은 개별적으로 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 서열번호: 25-26, 서열번호: 25 및 48, 서열번호: 25 및 49, 서열번호: 27-28, 서열번호: 29-30, 서열번호: 31-32, 서열번호: 33-34, 서열번호: 35-36, 서열번호: 37-38, 서열번호: 39-40, 서열번호: 41-42, 서열번호: 45-46 및 서열번호: 46-47, 서열번호: 45 및 50, 및 서열번호: 47 및 50으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 뉴클레오타이드 서열쌍을 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 26을 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 45 및 서열번호: 46을 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 47 및 서열번호: 46을 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 48을 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 25 및 서열번호: 49를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 45 및 서열번호: 50을 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브쌍 중 하나는 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 제1 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 상기 제2 검출 올리고뉴클레오타이드 프로브는 각각 뉴클레오타이드 서열쌍 서열번호: 47 및 서열번호: 50을 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브 중 제1 검출 프로브는 제1 표지와 커플링되고, 상기 적어도 2개의 검출 프로브 중 제2 검출 프로브는 제2 표지에 커플링되는 것인 반응 혼합물.
- 제39항에 있어서, 상기 제1 표지는 VIC이고, 상기 제2 표지는 FAM인 반응 혼합물.
- 하기 (A) 및 (B)를 포함하는, 인간 대상에서 각막 이영양증을 검출하기 위한 반응 혼합물:
(A) 상기 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키고 결정하기 위한 적어도 제1 증폭 프라이머쌍; 및
(B) 적어도 3개의 검출 프로브의 세트로서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 중 하나의 검출 프로브는 상기 TGFβI 유전자 서열에 노출될 때 TGFβI 유전자 서열에 혼성화하는 것인 적어도 3개의 검출 프로브의 세트. - 제41항에 있어서, 상기 TGFβI 유전자 서열은 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 아미노산 잔기 124를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 25-42 및 48-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 25-42 및 48-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상의 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 25-42 및 48-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개 이상의 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항 내지 45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 제1 검출 프로브 서열번호: 25 및 제2 검출 프로브 서열번호: 26을 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제46항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 48 및 서열번호: 49로 이루어진 군으로부터 선택되는 제3 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제47항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는, 상기 제3 검출 프로브와 다르며 서열번호: 48 및 서열번호: 49로 이루어진 군으로부터 선택되는 제4 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 26 및 48-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 증폭 프라이머쌍은 제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제1 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 1을 포함하며, 상기 제2 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 2를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 (C) 및 (D)를 추가로 포함하는 것인 반응 혼합물:
(C) 생물학적 샘플로부터 제2 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키고 결정하기 위한 적어도 제2 증폭 프라이머쌍; 및
(D) 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트로서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트 중 하나의 검출 프로브는 상기 제2 TGFβI 유전자 서열에 노출될 때 제2 TGFβI 유전자 서열에 혼성화하는 것인 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트. - 제51항에 있어서, 상기 제2 TGFβI 유전자 서열은 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 아미노산 잔기 555를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상의 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개 이상의 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트는 서열번호: 45 또는 서열번호: 47인 제1 검출 프로브, 서열번호: 46인 제2 검출 프로브, 및 서열번호: 50인 제3 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 증폭 프라이머쌍은 제3 증폭 프라이머 및 제4 증폭 프라이머를 포함하고, 상기 제3 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 43을 포함하며, 상기 제4 증폭 프라이머는 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 44를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항에 있어서, 상기 TGFβI 유전자 서열은 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 아미노산 잔기 555를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항 또는 제58항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항, 제58항 및 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상의 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항 및 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 45-47 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개 이상의 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 제41항 및 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트는 서열번호: 45 또는 서열번호: 47인 제1 검출 프로브, 서열번호: 46인 제2 검출 프로브, 및 서열번호: 50인 제3 검출 프로브를 포함하는 것인 반응 혼합물.
- 하기 (A-1), (B-1) 및 (C-1)을 포함하는, 각막 이영양증을 검출하는 방법:
(A-1) 적어도 제1 증폭 프라이머쌍 및 적어도 3개의 검출 프로브의 세트를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여, 인간 대상으로부터의 생물학적 샘플로부터 제1 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키는 단계;
(B-1) 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 중 제1 검출 프로브를 상기 제1 TGFβI 유전자 서열에 혼성화시키는 단계; 및
(C-1) (i) 상기 제1 TGFβI 유전자 서열에 대한 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 중 제1 검출 프로브의 혼성화, 및 (ii) 상기 제1 TGFβI 유전자 서열에 대한 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 중 제2 및 제3 검출 프로브의 혼성화 실패에 기초하여, 상기 제1 TGFβI 유전자 서열 내의 돌연변이를 검출하는 단계. - 제63항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 제41항 내지 제50항 및 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 기재된 반응 혼합물을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제63항 또는 제64항에 있어서, 하기 (A-2), (B-2) 및 (C-2)를 추가적으로 포함하는 것인 검출 방법:
(A-2) 동일한 반응 혼합물을 이용하여 생물학적 샘플로부터 제2 TGFβI 유전자 서열을 증폭시키는 단계로서, 상기 반응 혼합물은 적어도 제2 증폭 프라이머쌍 및 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트를 포함하는 것인 단계;
(B-2) 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트 중 제1 검출 프로브를 상기 제2 TGFβI 유전자 서열에 혼성화시키는 단계; 및
(C-2) (i) 상기 제2 TGFβI 유전자 서열에 대한 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트 중 제1 검출 프로브의 혼성화, 및 (ii) 상기 제2 TGFβI 유전자 서열에 대한 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트 중 제2 검출 프로브 및 제3 검출 프로브의 혼성화 실패에 기초하여, 상기 제2 TGFβI 유전자 서열 내의 돌연변이를 검출하는 단계. - 제65항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 기재된 반응 혼합물을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제65항 또는 제66항에 있어서, 증폭 단계(A-1), 증폭 단계(A-2), 혼성화 단계(B-1), 혼성화 단계(B-2), 검출 단계(C-1), 및 검출 단계(C-2)를 생물학적 샘플의 동일한 분취량을 이용하여 수행하는 것인 검출 방법.
- 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 TGFβI 유전자 서열의 증폭 단계(A-1)와 상기 제2 TGFβI 유전자 서열의 증폭 단계(A-2)를 동시에 수행하는 것인 검출 방법.
- 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 혼성화 단계(B-1)과 혼성화 단계(B-2)를 동시에 수행하는 것인 검출 방법.
- 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 단계(C-1)과 검출 단계(C-2)를 동시에 수행하는 것인 검출 방법.
- 인간 대상에서 이형접합형 각막 이영양증의 검출을 통해 대상에서 레이저 눈 수술에 따른 합병증의 위험을 예측하기 위한 제7항 내지 제70항 중 어느 한 항에 기재된 반응 혼합물의 용도.
- 제71항에 있어서, 상기 레이저 눈 수술은 라식 및 엑시머 레이저 수술 중 하나를 포함하는 것인 용도.
- 하기 (A) 내지 (F)를 포함하는, 인간 대상으로부터의 샘플에서 각막 이영양증과 관련된 게놈 돌연변이를 검출하는 방법:
(A) 기재의 팁에 부착된 인간 대상의 상피 세포를 제공하는 단계;
(B) 상기 기재의 팁을, 상기 기재에 부착된 세포를 용해시키는 용해액 중에서 교반하는 단계;
(C) 상기 교반(B)이 완료되면, 상기 용해액으로부터 기재를 분리하는 단계;
(D) 상기 분리(C) 후, 상기 용해액을 인큐베이션하는 단계;
(E) 상기 용해액으로부터 게놈 DNA를 단리하여 gDNA 용액을 형성하는 단계; 및
(F) 적어도 제1 프라이머쌍, 적어도 3개의 검출 프로브의 세트, 및 상기 gDNA 용액을 이용하여, 상기 gDNA 용액을 상기 적어도 3개의 검출 프로브에 동시에 노출시킴으로써, TGFβI 유전자 내에 존재하는 적어도 제1 뉴클레오타이드의 정체를 확인하는 단계로서,
상기 적어도 제1 뉴클레오타이드는, 각막 이영양증과 관련된 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 상응하는, TGFβI 유전자의 특정 위치에 위치하며,
상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 중 적어도 2개의 검출 프로브 각각은 TGFβI 유전자의 특정 위치에 있는 상이한 돌연변이를 검출하도록 구성되는 것인 단계. - 제73항에 있어서, 하기 (G)를 추가로 포함하는 검출 방법:
(G) 적어도 제2 프라이머쌍, 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트, 및 상기 gDNA 용액을 이용하여, 상기 gDNA 용액을 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 세트 및 상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트에 동시에 노출시킴으로써, TGFβI 유전자 내에 존재하는 적어도 제2 뉴클레오타이드의 정체를 확인하는 단계로서,
상기 적어도 제2 뉴클레오타이드는, 상기 적어도 제1 뉴클레오타이드의 위치에 독립적으로, 각막 이영양증과 관련된 제2 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 상응하는, TGFβI 유전자의 제2의 특정 위치에 위치하며,
상기 적어도 3개의 검출 프로브의 제2 세트 중 적어도 2개의 검출 프로브는 TGFβI 유전자의 제2의 특정 위치에 있는 각각의 돌연변이를 검출하도록 구성되는 것인 단계. - 제75항에 있어서, 확인 단계(F)와 확인 단계(G)를 동시에 수행하는 것인 검출 방법.
- 제74항 또는 제75항에 있어서, 확인 단계(F)와 확인 단계(G)를 동일한 gDNA 용액을 이용하여 수행하는 것인 검출 방법.
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