CN115820837A

CN115820837A - 一种角膜营养不良的pcr检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115820837A
Application number: CN202211374422.6A
Authority: CN
Inventors: 于晓光; 杜政霖
Original assignee: Wenzhou Puxi Gene Technology Co ltd
Current assignee: Wenzhou Puxi Gene Technology Co ltd
Priority date: 2022-11-04
Filing date: 2022-11-04
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明提供一种检测角膜营养不良的PCR检测试剂盒，所述的试剂盒中的引物探针组合物为SEQ ID NO.1‑10，所述的试剂盒在用于扩增时扩增体系中包括0.5‑0.8g/L的氯乙酸。本发明通过设计检测引物和探针组合物，优化检测条件，提高了对角膜营养不良的检测效果，在临床上具有使用前景。

Description

一种角膜营养不良的PCR检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种角膜营养不良的PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

角膜营养不良是与家族遗传有关的原发性进行性角膜病变的总称。多数角膜营养不良为常染色体显性遗传，该病病程较为缓慢，且药物治疗难以起效。部分晚期患者严重影响视力时需要进行角膜移植手术。对角膜营养不良的及时检测可以使患者得到及时的治疗，避免病情的进一步加重。

角膜营养不良可以通过遗传学检查、病理学检查、角膜内皮显微镜检查、房角镜检查进行疾病诊断。由于角膜营养不良相关的遗传学突变不止一种，遗传学检查可以确定其遗传类型。且部分角膜营养不良患者为杂合性突变，症状表现较为不明显，因此通过病理学检查、角膜内皮显微镜检查、房角镜检查等方法难以确诊，贻误治疗时机。

对角膜营养不良患者进行基因检测多采用PCR试剂盒来完成，通过结果比对确定突变类型，以对角膜营养不良的患病风险进行评估。

申请号为CN201610976247.6的中国专利中公开了：一种检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，所述方法在相同的反应体系中，使用针对角膜营养不良多态性位点的基因野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测；然后根据样本用针对野生型模板的增强型ARMS引物进行荧光定量PCR检测的Ct野生型和针对突变型模板的增强型ARMS引物进行ARMS荧光定量PCR检测的Ct突变型以及Ct突变型与Ct野生型之间差值△Ct值，来判断多态性位点的型别从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。

申请号为CN201810571591.6的中国专利中公开了：一种颗粒性角膜营养不良II型核酸检测试剂盒，包括引物GCD124-PF1、引物GCD124-PR1、内参引物M-26F、内参引物M-26R、探针GCD124-W1、探针GCD124-M1、内参探针M-01D，扩增预混液、探针引物预混液和阴、阳性质控，该试剂盒，可采用多个不同的荧光对多个不同的探针进行标记，能够同时对GCD-II型的野生型和突变型进行检测；经过核酸提取和纯化后的检测过程不超过2小时。

但现有技术的检测试剂盒的灵敏度和稳定性都欠佳，有进一步优化的空间。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了角膜营养不良的PCR检测试剂盒

一方面，本发明提供了一种检测角膜营养不良的PCR检测试剂盒。

所述的试剂盒中包括PCR引物和探针，所述的引物和探针选自SEQ ID NO.1-10；其中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8为引物，SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10为探针，所述的探针5'端有VIC或6-FAM修饰，所述的探针3'端有MGB修饰。

具体地，所述的试剂盒中的引物和探针如下：

Primer名称	序列(5'to 3')	5'端修饰	3'端修饰
				TGFBI-rs121909210/11-F	SEQ ID NO.1	-	-
TGFBI-rs121909210/11-R	SEQ ID NO.2	-	-
				TGFBI-rs121909210-Probe1CT	SEQ ID NO.3	5`VIC	3`MGB
TGFBI-rs121909210-Probe1WT	SEQ ID NO.4	5`6-FAM	3`MGB
				TGFBI-rs121909211-Probe2GA	SEQ ID NO.5	5`VIC	3`MGB
TGFBI-rs121909211-Probe2WT	SEQ ID NO.6	5`6-FAM	3`MGB
				TGFBI-rs121909208/09-F	SEQ ID NO.7	-	-
TGFBI-rs121909208/09-R	SEQ ID NO.8	-	-
				TGFBI-rs121909209-Probe5GA	SEQ ID NO.9	5`VIC	3`MGB
TGFBI-rs121909209-Probe5WT	SEQ ID NO.10	5`6-FAM	3`MGB

所述的引物和探针用于检测以下位点：

rsid

chr

pos_hg19

pos_hg38

variation

variant_type

gene

rs121909208

5

135392469

136056780

C>T

snv

TGFBI

rs121909209

5

135392470

136056781

G>A

snv

TGFBI

rs121909210

5

135382095

136046406

C>A,T

snv

TGFBI

rs121909211

5

135382096

136046407

G>A,T

snv

TGFBI

优选地，所述的PCR扩增体系中还包括0.5-0.8g/L的氯乙酸。

优选地，所述的PCR扩增体系中还包括0.5-0.7g/L、0.5-0.6g/L、0.6-0.8g/L、0.6-0.7g/L、0.7-0.8g/L的氯乙酸。

所述的试剂盒中还包括其他PCR反应所需试剂。

优选地，所述的试剂为DNA聚合酶、促进酶反应的金属离子、dNTPs、缓冲液中的一种或多种。

优选地，所述的试剂盒中还包括检测内参基因的引物，所述的引物可以通过常规设计得到。

所述的内参基因为β-actin。

所述的角膜营养不良包括但不限于：角膜上皮基底膜营养不良、颗粒状营养不良或Fuchs角膜内皮营养不良。

另一方面，本发明还提供了检测基因突变的引物和探针在制备角膜营养不良PCR检测试剂盒中的应用。

所述的试剂盒中包括PCR引物和探针，所述的引物和探针为SEQ ID NO.1-10；其中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8为引物，SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10为探针，所述的探针5'端有VIC或6-FAM修饰，所述的探针3'端有MGB修饰。

具体地，所述的引物和探针如下：

所述的引物和探针用于检测以下位点：

rsid

chr

pos_hg19

pos_hg38

variation

variant_type

gene

rs121909208

5

135392469

136056780

C>T

snv

TGFBI

rs121909209

5

135392470

136056781

G>A

snv

TGFBI

rs121909210

5

135382095

136046406

C>A,T

snv

TGFBI

rs121909211

5

135382096

136046407

G>A,T

snv

TGFBI

优选地，所述的PCR扩增体系中还包括0.5-0.8g/L的氯乙酸。

所述的试剂盒中还包括其他用于PCR扩增的试剂。

在一些实施例中，所述的试剂盒中还包括用于检测内参基因的引物。

优选地，所述的内参基因为β-actin。

再一方面，本发明提供了前述试剂盒的使用方法。

所述的试剂盒用于检测角膜营养不良时包括以下步骤：

提取DNA，使用前述试剂盒进行PCR扩增，荧光检测。

优选地，所述的PCR扩增体系为：

10×Buffer	2.5μL
		Taq	0.5μL
引物探针组合物	1μL
		模板DNA	5μL
dNTPs(10mM)	0.5μL
		氯乙酸(5g/L)	2.5μL
水	补足25μL

本发明的有益效果：

本发明通过设计检测引物和探针组合物，优化检测条件，提高了对角膜营养不良的检测效果，在临床上具有使用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1一种角膜营养不良检测试剂盒

包括以下组分：

(1)下表所示的引物

所述的引物和探针用于检测以下位点：

rsid

chr

pos_hg19

pos_hg38

variation

variant_type

gene

rs121909208

5

135392469

136056780

C>T

snv

TGFBI

rs121909209

5

135392470

136056781

G>A

snv

TGFBI

rs121909210

5

135382095

136046406

C>A,T

snv

TGFBI

rs121909211

5

135382096

136046407

G>A,T

snv

TGFBI

(2)阳性质控品：检测位点均发生变异的DNA；

阴性质控品：检测位点均未发生变异的DNA；

(3)dNTPs；

(4)热启动Taq酶：翌圣，10717ES72；

(5)10×Buffer；

(6)氯乙酸。

实施例2一种角膜营养不良的检测方法

本实施例通过实施例1提供的试剂盒进行检测，具体包括以下步骤：

1.样本提取

1.1.应用核酸提取试剂盒进行样本提取，提取的DNA应立即检测，否则应置于-20℃保存，保存时间不应超过6个月且避免反复冻融；提取的DNA浓度应不小于1ng/μL，且A260/A280应在1.8-2.0之间。

1.2.试剂盒阳性质控品和阴性质控品无需提取，直接使用即可。

2.试剂准备

将氯乙酸配制为5g/L浓度的溶液。

将引物探针组合物分别配制为500μM浓度后等比例混合，混合后各引物探针的浓度为50μM。

3.加样(样品准备区)

按照以下体系加样。

模板DNA分别为阴性质控品、待检样本DNA、阳性质控品各5μL，总体系25μL/管，盖紧管盖，瞬时离心，移至扩增区进行PCR检测。

4.PCR扩增(扩增区)

将完成加样的PCR反应管放入荧光PCR仪内，总体系设为25μL。检测平台的设置如下。

4.1.ABI7500

4.1.1.新建TARGET1、TARGET2检测靶标，分配至所有位点检测孔；

4.1.2.检测靶标设置

检测靶标	TARGET1	TARGET2
			荧光基团	FAM	VIC
淬灭基团	None	None

4.1.3设置循环参数

5.结果分析

5.1.ABI7500

5.1.1.将扩增曲线图谱类型设为线性。

5.1.2.依次选择TARGET1、TARGET2检测靶标进行基线和阂值设置，其中基线设为6-8或根据实际情况手动调整，阂值设为该检测靶标的所有检测孔△Rn(纵坐标)最大显示值的10％，设置完毕后分析，依次得到各检测靶标Ct值；使用β-actin作为内参基因。

5.1.3.计算靶标△Ct值：△Ct＝Ct靶标-Ct内参，当检测靶标无Ct值时，取其Ct值为45计算△Ct值。

5.1.4.根据△Ct值参照质控品进行基因型判定。

6.质量控制

6.1.阴性质控品：各检测靶标扩增曲线无指数增长期或Ct＞35。

6.2.阳性质控品：各检测靶标扩增曲线有指数增长期且Ct≤35。

6.3.以上两项须在同一次检验中同时满足，否则当次检验视为无效，需重新检测。

实施例3试剂盒效果验证

对13例角膜营养不良患者和120例健康志愿者使用实施例1的试剂盒通过实施例2的方法进行检测，结果表明，实施例1提供的试剂盒：

阴性符合率为100％；阳性符合率为100％。

实施例4试剂盒检测限

对实施例1的试剂盒进行检测限测定，将提取的DNA稀释至不同浓度，然后使用实施例1的试剂盒参照实施例2的方法进行检测，结果表明，本申请的试剂盒最低检测限为0.1ng/μL。

实施例5试剂盒精密度

使用实施例1的试剂盒参照实施例2的方法检测0.1ng/μL企业参考品10次，Ct值变异系数CV为1.3％，符合≤5％的行业标准。

实施例6干扰物质

使用实施例1的试剂盒参照实施例2的方法分别对0.1ng/μL和1ng/μL的样本进行检测，分别设置乙醇终浓度1％、NaCl终浓度10mM为干扰条件，结果表明，干扰物质(乙醇终浓度1％、NaCl终浓度10mM)不影响试剂盒检测结果。

实施例7氯乙酸浓度对试剂盒检测限和精密度的影响

参照实施例2设置实验，调整氯乙酸终浓度，检测试剂盒检测限、精密度和干扰物质影响，结果如下：

氯乙酸在体系中的浓度	检测限	精密度	干扰物质影响
				0.6g/L	0.1ng/μL	1.6％	无影响
0.8g/L	0.1ng/μL	2.2％	无影响

对比例

参照实施例1提供的试剂盒和实施例2提供的检测方法设置对比例，区别如下：

对比例	与实施例1和实施例2的区别
		对比例1	PCR反应体系不添加氯乙酸
对比例2	氯乙酸终浓度1.5g/L

检测对比例1和对比例2的检测限、精密度和干扰物质(乙醇终浓度1％、NaCI终浓度10mM)影响，结果如下：

对比例	检测限(ng/μL)	精密度	干扰物质影响
				对比例1	1	4.7％	无影响
对比例2	-	-	Ct值大于40

以上结果表明，过高或者过低的氯乙酸对于反应体系的作用不尽相同，需要控制其体系中的浓度以使反应正常进行。

Claims

1.一种检测角膜营养不良的PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR引物和探针，所述的引物和探针选自SEQ ID NO.1-10；其中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8为引物，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10为探针，所述的探针5'端有VIC或6-FAM修饰，所述的探针3'端有MGB修饰。

2.根据权利要求1所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增体系中还包括0.5-0.8g/L的氯乙酸。

3.根据权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增体系中还包括0.5g/L的氯乙酸。

4.根据权利要求3所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括其他PCR反应所需试剂。

5.根据权利要求4所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂为DNA聚合酶、促进酶反应的金属离子、dNTPs、缓冲液中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括检测内参基因的引物。

7.根据权利要求6所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的内参基因为β-actin。

8.检测基因突变的引物和探针在制备角膜营养不良PCR检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的引物和探针为SEQ ID NO.1-10；其中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8为引物，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10为探针，所述的探针5'端有VIC或6-FAM修饰，所述的探针3'端有MGB修饰。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒中还包括氯乙酸作为扩增试剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的所述的氯乙酸使用浓度为0.5-0.8g/L。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒中还包括其他用于PCR扩增的试剂。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的试剂为DNA聚合酶、促进酶反应的金属离子、dNTPs、缓冲液中的一种或多种。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒中还包括用于检测内参基因的引物。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的内参基因为β-actin。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的角膜营养不良为角膜上皮基底膜营养不良、颗粒状营养不良或Fuchs角膜内皮营养不良。