CN107828880A - 用于检测mthfr基因分型的lamp引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

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黄少亚
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Abstract

本发明涉及一种用于检测MTHFR基因分型的LAMP引物组。所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB、正向内引物FIP、反向内引物BIP‑C和反向内引物BIP‑T组成。本发明还涉及一种用于检测MTHFR基因分型的LAMP检测试剂盒及LAMP检测方法。所述LAMP检测试剂盒包括所述LAMP引物组。本发明提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测快速、准确性高、灵敏度高和成本低的优点。

Description

用于检测MTHFR基因分型的LAMP引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别的，涉及一种用于检测MTHFR基因分型的LAMP引物组、LAMP检测试剂盒及LAMP检测方法。
背景技术
亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenete-trahydmfolate reductase，MTHFR)是叶酸代谢过程中的关键酶，在体内有重要的生物学作用，可催化还原型辅酶I(NADPH)相关的5，10-二甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸的不可逆还原反应。MTHFR对于DNA的合成、活化及修复有着极为重要的调控作用。MTHFR基因的缺陷可导致机体多个基础生化过程的紊乱，并进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。MTHFR基因的缺陷对孕妇人群可导致神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊娠期高血压疾病、自发性流产等。
至今，已发现MTHFR近20个基因突变位点，其中部分多态位点的错义突变是导致酶活性降低、缺失及热稳定性改变的主要机制。目前，研究报道较多的是与人类疾病关系密切的多态位点C677T，产生Ala 222Val错义突变，主要引起酶活性和热稳定性的改变。其中TT突变纯合型酶活性仅为CC野生型的30％，而CT突变杂合型酶活性仅为CC野生型的60％，使体内5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-MTHF)水平升高、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)水平随之下降，进而影响叶酸正常代谢。
多项研究结果显示，C677T多态性与叶酸及同型半胱氨酸代谢紊乱、血栓形成倾向、心脑血管病风险增高、孤独症及新生儿缺陷等疾病具有显著相关性。此外，MTHFR C677T基因多态性还与5-FU、甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)等的疗效或毒副作用相关。因此，对MTHFR C677T基因多态性进行检测，可以提高临床治疗的针对性和可预见性。
目前，MTHFR基因分型检测的方法主要有PCR-直接测序法和荧光PCR法，两种方法都需要昂贵的仪器设备且检测周期长、成本较高。环式等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)技术的特征是针对目标DNA链上的6个区段设计4个(或6个)不同的引物，再利用链置换反应在一定温度下(60～65℃)经一个步骤即可完成反应。LAMP具有高度的特异性，且扩增效率极高，可在15～60min内实现109～1010倍的扩增。对LAMP扩增结果的检测，仅需添加染料，通过肉眼观察颜色变化来判定结果，也可以通过简易的荧光或浊度检测平台，观察有无扩增曲线来判定。由于LAMP具有等温扩增、不需要特定PCR仪器、反应时间短等优点，已广泛用于病原微生物、食品安全检测领域，但是将其用于人的基因分型检测尚少有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测MTHFR基因分型的LAMP引物组、LAMP检测试剂盒及LAMP检测方法，具有操作简单、检测快速、准确性高及灵敏度高的优点。
本发明提供一种用于检测MTHFR基因分型的LAMP引物组，所述MTHFR基因分型的多态性位点为MTHFR C677T，所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB、正向内引物FIP、反向内引物BIP-C和反向内引物BIP-T组成，各引物的序列如下：
正向外引物F3：5’-ACTCTCTCTGCCCAGTCC-3’；
反向外引物B3：5’-CGGAAGAATGTGTCAGCCTC-3’；
正向环引物LF：5’-CTGGCCTCCACCTGTTCA-3’；
反向环引物LB：5’-CTGACCTGAAGCACTTGAAGG-3’；
正向内引物FIP：
5’-GCCTTTGGGGTAACCTGCCAATGTCTCTTCATCCCTCGCCT-3’；
反向内引物BIP-C：
5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGCGTGATGATGAAATCAG-3’；
反向内引物BIP-T：
5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’。
本发明还提供一种用于检测MTHFR基因分型的LAMP检测试剂盒，所述MTHFR基因分型的多态性位点为MTHFR C677T，包括用于检测MTHFR C677T基因位点为C情况的第一LAMP检测液和用于检测MTHFR C677T基因位点为T情况的第二LAMP检测液，其中：
所述第一LAMP检测液包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB、正向内引物FIP和反向内引物BIP-C，各引物的序列如下：
正向外引物F3：5’-ACTCTCTCTGCCCAGTCC-3’；
反向外引物B3：5’-CGGAAGAATGTGTCAGCCTC-3’；
正向环引物LF：5’-CTGGCCTCCACCTGTTCA-3’；
反向环引物LB：5’-CTGACCTGAAGCACTTGAAGG-3’；
正向内引物FIP：
5’-GCCTTTGGGGTAACCTGCCAATGTCTCTTCATCCCTCGCCT-3’；
反向内引物BIP-C：
5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGCGTGATGATGAAATCAG-3’；
所述第二LAMP检测液包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB、正向内引物FIP和反向内引物BIP-T，各引物的序列如下：
正向外引物F3：5’-ACTCTCTCTGCCCAGTCC-3’；
反向外引物B3：5’-CGGAAGAATGTGTCAGCCTC-3’；
正向环引物LF：5’-CTGGCCTCCACCTGTTCA-3’；
反向环引物LB：5’-CTGACCTGAAGCACTTGAAGG-3’；
正向内引物FIP：
5’-GCCTTTGGGGTAACCTGCCAATGTCTCTTCATCCCTCGCCT-3’；
反向内引物BIP-T：
5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’。
在本发明提供的LAMP检测试剂盒一较佳实施例中，所述第一LAMP检测液的成份终浓度为：0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、0.4μM正向环引物LF、0.4μM反向环引物LB、0.6～1.2μM正向内引物FIP和0.6～1.2μM反向内引物BIP-C；所述第二LAMP检测液的成份终浓度为：0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、0.4μM正向环引物LF、0.4μM反向环引物LB、0.6～1.2μM正向内引物FIP和0.6～1.2μM反向内引物BIP-T。
在本发明提供的LAMP检测试剂盒一较佳实施例中，所述第一LAMP检测液和所述第二LAMP检测液均还包括4UDNA聚合酶、50000×SYBR Green I和1×Lamp Master Mix。
本发明还提供一种检测MTHFR基因分型的LAMP检测方法，所述MTHFR基因分型的多态性位点为MTHFR C677T，包括如下步骤：
步骤一：取待检测样本抽提的DNA为模板；
步骤二：利用如上所述的LAMP检测试剂盒中的第一LAMP检测液和第二LAMP检测液分别对DNA模板进行LAMP扩增；
步骤三：结果判定：结合DNA模板分别与第一LAMP检测液和第二LAMP检测液的扩增反应结果来得到待检测样本MTHFR C677T基因位点的基因型。
在本发明提供的所述LAMP检测方法一较佳实施例中，所述步骤二中LAMP扩增条件为：62℃恒温孵育30-60min。
相较于现有技术，本发明提供的用于检测MTHFR基因分型的LAMP引物组、LAMP检测试剂盒及LAMP检测方法的有益效果在于：
一、本发明以LAMP技术为基本原理，针对MTHFR C677T基因位点设计了7条引物，并由7条引物中的6条配制含BIP-C引物的第一LAMP检测液和含BIP-T引物的第二LAMP检测液，利用第一LAMP检测液和第二LAMP检测液同时对待检样本DNA模板进行扩增，结合两者扩增反应结果来得到待检测样本MTHFR C677T基因位点的基因型，操作简便快速，反应只需一步，可在30-60min内完成。
二、与现有的MTHFR C677T基因位点分型检测的PCR-直接测序法和荧光PCR法相比，所需仪器设备简单，不需要专门的荧光PCR仪就能完成反应，间接降低检测成本，更易推广应用。
三、第一LAMP检测液和第二LAMP检测液中均包括有SYBR Green I染料，即在反应前就已加入SYBR Green I染料，无需开盖检测，有效避免了假阳性的结果。
附图说明
图1为MTHFR C677T基因位点CC型样本的LAMP检测结果图；
图2为MTHFR C677T基因位点TT型样本的LAMP检测结果图；
图3为MTHFR C677T基因位点CT型样本的LAMP检测结果图；
图4为梯度稀释MTHFR C677T基因位点CT型标准品的LAMP检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：LAMP检测试剂盒的制备
一、检测MTHFR基因分型的LAMP引物组的设计与合成
针对人基因组中MTHFR C677T基因位点附近区域(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，使用Primer Explore 5.0软件设计由七条引物组成的LAMP引物组。
该LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB、正向内引物FIP、正向内引物FIP-A和反向内引物BIP组成，具体地，各引物的序列如表一所示：
表一、第一引物组和第二引物组各引物序列
二、检测MTHFR基因分型的第一LAMP检测液和第二LAMP检测液组成
所述第一LAMP检测液包括：0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、0.4μM正向环引物LF、0.4μM反向环引物LB、0.6～1.2μM正向内引物FIP、0.6～1.2μM反向内引物BIP-C、4U的DNA聚合酶、50000×的SYBR Green I、1×的Lamp Master Mix和适量去离子水。
所述第二LAMP检测液包括：0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、0.4μM正向环引物LF、0.4μM反向环引物LB、0.6～1.2μM正向内引物FIP、0.6～1.2μM反向内引物BIP-T、4U的DNA聚合酶、50000×的SYBR Green I、1×的Lamp Master Mix和适量去离子水。
实施例2：利用上述试剂盒检测MTHFR基因分型的LAMP检测方法
一、取待检测样本抽提的DNA作为模板；
二、利用实施例1所述的LAMP检测试剂盒对DNA模板进行LAMP扩增；
提供所述LAMP检测试剂盒，取出第一LAMP检测液和第二LAMP检测液；
从LAMP检测试剂盒中取出所需数量LAMP检测液连管(LAMP检测管数＝2×样本数)；
取第一LAMP检测液和第二LAMP检测液分别与1-5μL的DNA模板混匀配制LAMP扩增反应体系A和LAMP扩增反应体系B，反应体系为25μL，不足部分用灭菌纯化水补齐，具体详见表二和表三。
表二、LAMP扩增反应体系A组成
原料名称 终浓度
正向外引物F3 0.2μM
反向外引物B3 0.2μM
正向环引物LF 0.4μM
反向环引物LB 0.4μM
正向内引物FIP 0.6～1.2μM
反向内引物BIP-C 0.6～1.2μM
DNA聚合酶 4U
SYBR Green I 50000×
Lamp Master Mix 1×
DNA模板 1-5μL
去离子水 适量
总体积 25μL
表三、LAMP扩增反应体系B组成
将配有LAMP扩增反应体系A和LAMP扩增反应体系B的反应管置于荧光检测仪上以62℃恒温孵育30-60min，每60s采集荧光。
三、结果判定：结合DNA模板分别与第一LAMP检测液和第二LAMP检测液的扩增反应结果来得到待检测样本MTHFR C677T基因位点的基因型。具体地：
在配有LAMP扩增反应体系A的反应管内有扩增信号且配有LAMP扩增反应体系B的反应管内无扩增信号时，待检测样本MTHFR C677T基因位点为CC型；在配有LAMP扩增反应体系B的反应管内有扩增信号且配有LAMP扩增反应体系A的反应管内无扩增信号时，待检测样本MTHFR C677T基因位点为TT型；在配有LAMP扩增反应体系A的反应管内和配有LAMP扩增反应体系B的反应管内均有扩增信号时，待检测样本MTHFR C677T基因位点为CT型。
实施例3：准确性验证
提供3例MTHFR C677T基因位点CC型(样本1、样本2和样本3)、3例MTHFR C677T基因位点TT型(样本4、样本5和样本6)和3例MTHFR C677T基因位点CT型(样本7、样本8和样本9)的人基因组DNA作为模板，应用实施例2提供的LAMP检测方法对已知基因型的9个DNA模板进行检测，检测结果详见图1至图3，其中：
图1为MTHFR C677T基因位点CC型样本的LAMP检测结果图，图1中①、②、③分别为样本1、样本2和样本3用第一LAMP检测液扩增的扩增结果，结果有明显扩增曲线；④、⑤、⑥分别为样本1、样本2和样本3用第二LAMP检测液扩增的扩增结果，结果无扩增信号；
图2为3例MTHFR C677T基因位点TT型样本的LAMP检测结果图，图2中①、②、③分别为样本4、样本5和样本6用第二LAMP检测液扩增的扩增结果，结果有明显扩增曲线；④、⑤、⑥分别为样本4、样本5和样本6用第一LAMP检测液扩增的扩增结果，结果无扩增信号；
图3为MTHFR C677T基因位点CT型样本的LAMP检测结果图，图3中样本7、样本8和样本9用第一LAMP检测液和用第二LAMP检测液扩增均有明显扩增曲线。
从图1至图3可知，扩增曲线符合判定结果。
实施例4：灵敏度分析
选择1例已知为MTHFR C677T基因位点CT型DNA样本，用分光光度计测浓度后，稀释到100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL，应用实施例二所述的LAMP检测方对对上述稀释DNA模板进行检测，以评价LAMP检测方法的检测灵敏度。结果显示，当加入的DNA模板为100ng、10ng和1ng的CT型DNA样本时，配有第一LAMP检测液和用第二LAMP检测液的反应管均有明显扩增信号；当加入的DNA模板为0.1ng的CT型DNA样本时，配有第一LAMP检测液和用第二LAMP检测液的反应管扩增信号较弱；当加入的DNA模板为0.01ng的CT型DNA样本时，配有第一LAMP检测液和用第二LAMP检测液的反应管无扩增信号，扩增反应曲线详见图4，其中①～④分别为100ng、10ng、1ng、0.1ng的CT型DNA样本的扩增结果，⑤为0.01ng的CT型DNA样本和空白对照的扩增结果。
综上所述本发明提供的LAMP检测方法，其灵敏度为1ng。
本发明提供的用于检测MTHFR基因分型的LAMP引物组、LAMP检测试剂盒及LAMP检测方法的有益效果在于：
一、本发明以LAMP技术为基本原理，针对MTHFR C677T基因位点设计了7条引物，并由7条引物中的6条配制含BIP-C引物的第一LAMP检测液和含BIP-T引物的第二LAMP检测液，利用第一LAMP检测液和第二LAMP检测液同时对待检样本DNA模板进行扩增，结合两者扩增反应结果来得到待检测样本MTHFR C677T基因位点的基因型，操作简便快速，反应只需一步，可在30-60min内完成。
二、与现有的MTHFR C677T基因位点分型检测的PCR-直接测序法和荧光PCR法相比，所需仪器设备简单，不需要专门的荧光PCR仪就能完成反应，间接降低检测成本，更易推广应用。
三、第一LAMP检测液和第二LAMP检测液中均包括有SYBR Green I染料，即在反应前就已加入SYBR Green I染料，无需开盖检测，有效避免了假阳性的结果。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 长沙三济生物科技有限公司
<120> 用于检测MTHFR基因分型的LAMP引物组、试剂盒及方法
<130> 2017
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actctctctg cccagtcc 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggaagaatg tgtcagcctc 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctggcctcca cctgttca 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgacctgaa gcacttgaag g 21
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcctttgggg taacctgcca atgtctcttc atccctcgcc t 41
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgaagcagg gagctttgag gctgcgtgat gatgaaatca g 41
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgaagcagg gagctttgag gctgcgtgat gatgaaattg a 41

Claims (6)

1.一种用于检测MTHFR基因分型的LAMP引物组，其特征在于，所述MTHFR基因分型的多态性位点为MTHFR C677T，所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB、正向内引物FIP、反向内引物BIP-C和反向内引物BIP-T组成，各引物的序列如下：
正向外引物F3：5’-ACTCTCTCTGCCCAGTCC-3’；
反向外引物B3：5’-CGGAAGAATGTGTCAGCCTC-3’；
正向环引物LF：5’-CTGGCCTCCACCTGTTCA-3’；
反向环引物LB：5’-CTGACCTGAAGCACTTGAAGG-3’；
正向内引物FIP：5’-GCCTTTGGGGTAACCTGCCAATGTCTCTTCATCCCTCGCCT-3’；
反向内引物BIP-C：5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGCGTGATGATGAAATCAG-3’；
反向内引物BIP-T：5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’。
2.一种用于检测MTHFR基因分型的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述MTHFR基因分型的多态性位点为MTHFR C677T，所述试剂盒包括第一LAMP检测液和第二LAMP检测液，其中：
所述第一LAMP检测液包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB、正向内引物FIP和反向内引物BIP-C，各引物的序列如下：
正向外引物F3：5’-ACTCTCTCTGCCCAGTCC-3’；
反向外引物B3：5’-CGGAAGAATGTGTCAGCCTC-3’；
正向环引物LF：5’-CTGGCCTCCACCTGTTCA-3’；
反向环引物LB：5’-CTGACCTGAAGCACTTGAAGG-3’；
正向内引物FIP：5’-GCCTTTGGGGTAACCTGCCAATGTCTCTTCATCCCTCGCCT-3’；
反向内引物BIP-C：5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGCGTGATGATGAAATCAG-3’；
所述第二LAMP检测液包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB、正向内引物FIP和反向内引物BIP-T，各引物的序列如下：
正向外引物F3：5’-ACTCTCTCTGCCCAGTCC-3’；
反向外引物B3：5’-CGGAAGAATGTGTCAGCCTC-3’；
正向环引物LF：5’-CTGGCCTCCACCTGTTCA-3’；
反向环引物LB：5’-CTGACCTGAAGCACTTGAAGG-3’；
正向内引物FIP：5’-GCCTTTGGGGTAACCTGCCAATGTCTCTTCATCCCTCGCCT-3’；
反向内引物BIP-T：5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’。
3.根据权利要求2所述的用于检测MTHFR基因分型的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述第一LAMP检测液的成份终浓度为：0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、0.4μM正向环引物LF、0.4μM反向环引物LB、0.6～1.2μM正向内引物FIP和0.6～1.2μM反向内引物BIP-C；所述第二LAMP检测液的成份终浓度为：0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、0.4μM正向环引物LF、0.4μM反向环引物LB、0.6～1.2μM正向内引物FIP和0.6～1.2μM反向内引物BIP-T。
4.根据权利要求3所述的用于检测MTHFR基因分型的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述第一LAMP检测液和所述第二LAMP检测液均还包括4UDNA聚合酶、50000×SYBR Green I和1×Lamp Master Mix。
5.一种检测MTHFR基因分型的LAMP检测方法，所述MTHFR基因分型的多态性位点为MTHFR C677T，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：取待检测样本抽提的DNA为模板；
步骤二：利用如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒中的第一LAMP检测液和第二LAMP检测液分别对DNA模板进行LAMP扩增；
步骤三：结果判定：结合DNA模板分别与第一LAMP检测液和第二LAMP检测液的扩增反应结果来得到待检测样本MTHFRC677T基因位点的基因型。
6.根据权利要求5所述的一种检测MTHFR基因分型的LAMP检测方法，其特征在于，所述步骤二中LAMP扩增条件为：62℃恒温孵育30-60min。
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