CN104232754A - 一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒 - Google Patents
一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒相关基因突变样品制备试剂盒。具体的涉及一种应用大规模平行测序平台技术检测一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒相关基因的产品,该试剂盒包括::A.独特设计并制备捕获探针,针对基因CYP11B1全部外显子片段;B.设计独特带有标签序列的接头;C.通用引物对探针序列进行PCR扩增;D.设计独特的混合后目的片段的捕获操作。这个方法和试剂盒制备的大规模平行测序平台样品通量大、效率高、操作简便,极大地降低了测序检验成本。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及医学诊断和生物技术,涉及一种检测11β-羟化酶缺乏症(11β-hydroxylase deficiency)基因突变的体外诊断试剂盒,一种应用于新一代测序平台技术的CYP11B1基因突变的试剂盒。
技术背景
11β-羟化酶缺乏症(11β-hydroxylase deficiency)是一类由CYP11B1基因突变引起的常染色体隐性遗传病。该病于1955年首次被报道,占先天性肾上腺皮质增生的5%-8%,为引起先天性肾上腺皮质增生的第二大类病因,患者常表现为低肾素性高血压、低血钾及高雄激素血症所致的男性性早熟和女性假两性畸形。
据报道,11-OHD在新生儿中的发病率为1/20万-1/10万。但也有报道称,该病在摩洛哥移民到以色列的犹太人群后裔中的发病率高达1/7000-1/5000[1]。
11β-羟化酶缺乏症临床表现可分为经典型和非经典型。其中经典型表现为:
1.高血压:约见于2/3的该病患者,多为轻至中度高血压,是由于11-去氧皮质酮(DOC)过多造成水钠潴留、血容量增加所致。
2.第二性征发育异常:女性患者可表现为不同程度的男性化,出现阴蒂肥大、不同程度的阴唇融合,还可出现多毛和(或)痤疮。而男性患者表现为非GnRH依赖性性早熟,阴茎过早发育,睾丸无增大。
3.其他:患者还可表现为皮肤色素沉着、骨骺过早成熟及闭合。
轻型又可包括迟发型和隐型。病情较轻,出生时外生殖器发育正常,也无相关症状。在青春期前后或成年期出现雄激素增多症状,一般无高血压 [1]。
对于11β-羟化酶缺乏症的鉴别诊断传统的方法主要依靠生化检查和经验判断检查。
1.经典型临床表现。
2.实验室检查血浆和尿各项指标高于同龄正常儿童95百分位数值的3倍以上。
3.轻型患者依据实验室指标诊断。
这些手段存在很大的缺点:
1.检查种类多;
2.灵敏度和特异度低;
3.易受药物和精神状况等因素的影响;
4.检测时间要求苛刻;
基因诊断的优势在于:
1.方便,安全,快捷:仅抽取2-4毫升血;
2.任何时间都可以检查;
3.不限制饮食,服药,任何身体状况都可以检测;
4.相比反复,多项传统检查,更为经济;
5.发病前,疾病极早期诊断的唯一方式;
6.源头确诊,一次检测,终身受益。
这一切都揭示了基因诊断在临床上有巨大的应用前景。
近年,大规模DNA平行测序平台(massively parallel DNA sequencing platform)已经发展为主流的基因测序技术,这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一、千分之一,而且检测的稳定性和准确性已经大大提高,目前市场上的主要技术平台已经能够达到99.99%的准确性。特别是这项技术的高通量特性,使得以前花费半年或者一年以上时间进行的复杂遗传疾病的基因检测成为可能。如11β-羟化酶缺乏症的CYP11B1基因,涉及7000多个碱基全序列检测。本发明可以同时检测几十个甚至上百个病人的检测,非常使用于地区性的检测中心使用。
参考文献:
[1]A,Leiberman E,Cohen T.High frequency of congenital adrenal hyperplasia(classic 11beta-hydroxylase deficiency)among Jews from Morocco.Am J Med Genet.1992;42(6):827-34.
[2]Chalmers LJ,Casas L,New MI,et al.Prolongation of growth by treatment of11-hydroxylase deficiency with depot-leuprolide,growth hormone,and hydrocortisone.J Pediatr Endocrinol Metab,2006,19:1251-1255.
发明内容
本发明的目的是,提供一种检测11β-羟化酶缺乏症(11β-hydroxylase deficiency)基因突变的目标捕获再测序的试剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量,操作简便、成本低。
为实现上述目的,本发明采用捕获目的CYP11B1基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针;用于扩增待测片段的通用引物;测序接头序列;缓冲液dNTP高保真聚合酶;链霉素磁珠。本发明采用的技术方案是:一种新的目标捕获再测序方法,包括以下步骤:
A.设计并制备用于捕获11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的探针。并将这些探针结合在磁珠、薄膜或者玻片上。探针序列见序列表。
B.将待测基因DNA样品分别片段化至200-400bp,然后将末端补平,加入的ATP使片段两端引入粘性末端。
C.分别加入Illumina公司DNA Sample Prep Kit中设计好的一端带有标签序列的接头序列片段,加入连接酶,使每个片段都与的一对接头连接,形成新的片段。
D.调节反应温度激活DNA聚合酶,用一对Illumina公司Index Kit-PCR primers通用引物,对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR扩增反应;
E.将步骤d所得全部样品的PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交,然后经过多次洗脱纯化反应,得到待测片段。
F.将待测片段通过illumina公司Miseq测序仪的标准方案进行大规模平行测序。
G.将得到的测序结果同标准数据库进行比较,得到诊断结果。
为实现上述技术方案,步骤A所述的捕获探针是脱氧核糖核酸(DNA),或是核糖核酸(RNA)组成,但不仅限于DNA和RNA。探针为120bp的与目标互补的片段组成。探针可以是结合在磁珠上的,也可以结合在载玻片上,但不仅限于这些介质。链霉素磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、钕铁硼永磁材料、橡胶磁,但不仅限于这些材质。
其中,步骤A所述的捕获探针,包括覆盖基因CYP11B1全部编码外显子片段和两端50bp范围内的序列。这些探针以叠瓦式设计,片段长度为50bp-180bp,最优为75bp;片段长度为60bp-200bp,最优为80bp;片段长度为65bp-220bp,最优为85bp;片段长度为70bp-240bp,最优为90bp;探针之间重叠部分为5-20bp,最优为8bp;目标区碱基的探针覆盖度为1×至10×,最优为3×。
本发明的主要优点在于:
1.本发明可以在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部11β-羟化酶缺乏症相关基因的检测;全部序列直接测出,准确率可以达到99.99%。
2.本发明的试剂盒可以一次完成1-48个样品的平行捕获,提高了捕获效率,极大地降低了样品准备的成本。
3.本发明的试剂盒可以一次完成1-1152个样品的全部11β-羟化酶缺乏症相关基因,近4000条序列的平行检测,充分利用设备的高通量特性,极大降低了每个样品的测序成本。
4.本发明的试剂盒可以一次反应同时分辨错义、插入和缺失突变。大大增加了临床检出率和准确性。
5.本发明的检测方法步骤简单,减少重复操作的环节,因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定引物,提高了检测准确率和稳定性。
6.本发明所提供的检测方法所需时间大大少于sanger法的测序技术.
实例:在完成同样的检测量(100人份的检测量),sanger法需要2个人工同时工作一周。我们的方法只需要一个人在一天内完成全部的检测量。
7.检测的准确度大大优于基因芯片技术,更符合临床检测要求。基因芯片只能检测碱基错义突变,而插入和缺失突变无法同时检测。我们的方法可以同时检测错义、插入、缺失和可变剪切的基因突变。
附图说明
图1为目标区域序列和探针。A是腺嘌呤;T是胸腺嘧啶;C是胞嘧啶;G是鸟嘌呤
图2为目标区域序列。
图3为探针。
具体实施方式
下面用实施例仅是对本发明实际应用的举例描述,本发明的实际应用不仅限于以下实施例:
实施例一、
一、探针设计:
按表合成链霉素标记的探针。探针溶液采用agilent公司的SureSelect缓冲系统体系。
二、基因组提取:
采用Qiagen FlexiGene DNA Kit(Code No:51204)进行提取待测96份样本的基因组,OD260/280值达到1.8-2.0,各取1-3g做为起始模板。
三、测序前样品制备
1.目的基因片段化:
取定量过的270份基因组DNA,稀释至20-35ng/L。取130L,用超声破碎仪分别进行片段化。
2.AMpure XP片段化选择
1.取96孔板,加入80-100L磁珠后,再加入样品DNA,移液器反复吹打混匀;
2.混合液26℃放置5min;
3.将96孔板静置在磁板上3min;
4.小心移取全部上清至新的孔中,小心不要碰到磁环;
5.再在移至新孔的上清中加入100-150L磁珠,移液器反复吹打,充分混匀;
6.混合液26℃放置5min;
7.将96孔板静置在磁板上3min,小心移去上清;
8.加入70%乙醇200L,静置30s,小心移去上清;
9.重复步骤8操作一次;
10.将96孔板从磁板上取下,敞口放置,使乙醇充分挥发;
11.加入40L 10mM pH=8.0Tris-HCl,移液器反复吹打混匀;
12.将96孔板静置在磁板上1min,至溶液变清;
13.小心移取上清至新的PCR管内,得到纯化后的基因组DNA。
3.末端平齐和纯化
1.取96孔板,按下表所示,在冰盒上加入各种试剂,保持冰浴状态。
试剂 | 每个反应用量(L) |
DNA sample | 19 |
10x Blunting Buffer | 2.5 |
1 mM dNTP Mix | 2.5 |
Blunt Enzyme Mix | 0.5 |
Nuclease-Free Water | 0.5 |
总反应体系 | 25 |
2.于PCR仪中(热盖50℃),12℃孵育20min,然后37℃孵育15min;
3.取96孔板,先加入充分混匀的磁珠45L,再加入样品,移液器吹打混匀;
4.混合液26℃,静置5min;
5.将96孔板放置在磁板上,静置3min,弃上清;
6.加入70%乙醇200L,静置30s,弃上清;
7.重复步骤6,再洗一遍;
8.将96孔板从磁板上取下,敞口放置,使乙醇充分挥发;
9.加入40L 10mM pH=8.0Tris-HCl,移液器吹打10次混匀;
10.将96孔板放置在磁板上,静置1min;小心移取上清至干净的PCR管内备用。
4.接头连接和纯化
1.Oligo分别用pH=7.5 60mM Tris-HCl(含150mM NaCl),稀释至400M;按下表所示,配制接头工作液:
2.等摩尔混合每个接头的两条oligo,混匀后,打开PCR仪,设置好程序为95℃孵育2min,降温至20℃,每秒降温0.1度,程序完成后,放置冰上,分装,-20℃冻存;
3.取PCR管,按下表所示,在冰盒上加入各种试剂,保持冰浴状态;
试剂 | 每个反应用量(L) |
DNA sample | 15 |
2x Quick ligation Reaction Buffer | 25 |
Adapter oligo mix AP(200uM) | 2 |
PE-AP(200uM) | 2 |
Quick T4 DNA ligase | 1.2 |
Nuclease-free Water | 4.8 |
总体积 | 50 |
4.放于Thermo comfort内25℃孵育15min;
5.取96孔板,先加入充分混匀的磁珠90L,再加入样品,移液器吹打混匀;
6.混合液26℃,静置5min;
7.将96孔板放置在磁板上,静置3min,弃上清;
8.加入70%乙醇200L,静置30s,弃上清;
9.重复步骤8,再洗一遍;
10.将96孔板从磁板上取下,敞口放置,使乙醇充分挥发;
11.加入40L 10mM pH=8.0Tris-HCl,移液器吹打10次混匀;
12.将96孔板放置在磁板上,静置1min,小心移取上清至干净的PCR管内备用。
5.缺口修补和纯化
1.取PCR管,按下表所示,在冰盒上加入各种试剂,保持冰浴状态。
组分 | 体积(L) |
连接接头后的gDNA | 40 |
10x ThermoPol Reaction Buffer | 5 |
10mM dNTP mix | 1 |
Bst DNA Polymerase,Large Fragment | 2.5 |
Nuclease-free Water | 1.5 |
总体积 | 50 |
2.PCR仪上(热盖50℃)37℃孵育15min;
3.取96孔板,先加入充分混匀的磁珠90L,再加入样品,移液器吹打10次混匀;
4.混合液26℃,静置5min;
5.将96孔板放置在磁板上,静置3min,弃上清;
6.加入70%乙醇200L,静置30s,弃上清;
7.重复步骤6再洗一遍;
8.将96孔板从磁板上取下,敞口放置,使乙醇充分挥发;
9.加入40L 10mM pH=8.0Tris-HCl,移液器吹打10次混匀;
10.将96孔板放置在磁板上,静置1min,小心移取上清至干净的PCR管内备用;
11.取2L用Qubit 2.0进行定量。
6.文库扩增(Herculase II Fusion DNA Polymerases)
1.在超净台中配制PCR反应体系,取PCR管,按下表所示,在冰盒上加入各种试剂,保持冰浴状态,配好体系后,用移液器轻轻混匀;
2.PCR扩增条件
7.磁珠纯化PCR产物
1.取96孔板,先加入充分混匀的磁珠90L,再加入样品,移液器吹打10次混匀;
2.混合液26℃,静置5min;
3.将96孔板放置在磁板上,静置3min,弃上清;
4.加入70%乙醇200L,静置30s,弃上清;
5.重复步骤4,再洗一遍;
6.将96孔板从磁板上取下,敞口放置,使乙醇充分挥发;
7.加入40L 10mM pH=8.0Tris-HCl,移液器吹打10次混匀;
8.将96孔板放置在磁板上,静置1min;小心移取上清至干净的PCR管内备用;
9.取2L用Qubit 2.0定量,取1L用Agilent 2200检测。
四、采用设计探针捕获目的片段
(一)文库杂交
1、采用agilent公司的Sureselect系统的缓冲液,配制杂交缓冲液:
Reagent | Volume for 1 capture(L) |
Sureselect hyb#1 | 25 |
Sureselect hyb#2 | 1 |
Sureselect hyb#3 | 10 |
Sureselect hyb#4 | 13 |
Total | 49 |
2、配制捕获混合液:
1.将PCR板(PCR板1)放在冰上,预冷;
2.按照SureSelect RNase Block∶Nuclease-free Water=1∶9的比例配制需要的RNase Block稀释液,冰上放置,待用;
3.按反应数量,每样品孔加入5L稀释的SureSelect RNase Block(本部分步骤2配制);
4.步骤3的每个样本孔中,加入2L的SureSelect Capture Library,并用移液枪混匀;
5.冰上放置,备用。
3、用agilent公司的Sureselect系统配制Sureselect Block Mix:
Reagent | Volume for 1 reaction(L) |
Sureselect Indexing Block#1 | 2.5 |
Sureselect Block#2 | 2.5 |
Blocker for PE/SE | 0.6 |
Total | 5.6 |
4、准备目标富集的样品文库:
1.在PCR板2上的B排,加入3.4L准备好的样品文库(浓度为147ng/L);
2.在PCR板2的B排,加入5.6L的SureSelect Block Mix混合液,并用移液枪上下混匀;
3.密封PCR板2的B排,并将其放在PCR仪上;
4.按下表进行加热(105℃热盖)
5.保持PCR板2在65℃,在A排加入40L的Hybridization Buffer,封口,孵育至少5min后再进行下一步的实验;
6.将PCR板1的SureSelect Capture Library Mix加入到PCR板2中:
(1)在PCR板2的C排,加入7L的Capture Library Mix(PCR板需保持65℃);
(2)密封盖子;
(3)65℃孵育2min;
7.从A排取13L的Hybridization Buffer,加入到C排的SureSelect Capture Library Mix中(PCR板需保持65℃);
8.将B排中准备的样品文库混合液全部加入到C排的杂交液中,用移液枪轻轻混匀8-10次(PCR板需保持65℃);
9.用新的胶膜将PCR板密封;
10.在PCR仪上(热盖105℃),将杂交混合液65℃孵育24h。
(二)准备磁珠
1.在1.5ml离心管中,加入50L的Streptavidin T1磁珠;
2.磁珠洗脱:
(1)加200L的SureSelect Binding Buffer;
(2)漩涡混合器上混匀5s;
(3)将离心管放在磁力架上;
(4)移去上清;
(5)再重复步骤(1)到(4)两次,共洗脱3次;
3.加入200L的SureSelect Binding Buffer重新悬挂磁珠。
(三)用SureSelecte系统进行选择性杂交捕获
1.温育24h后,确定并记录杂交体积;
2.保持PCR板在PCR仪上65℃,将杂交混合液直接加入到磁珠溶液中,颠倒混匀3-5次;
3.将杂交-捕获和磁珠的混合液放置在混合器上,室温温育30min;
4.短暂的离心;
5.放置在磁力架上,静置5min,移去上清;
6.加入500L的SureSelect Wash Buffer#1,漩涡混合5s;
7.室温温育,共15min,但需每隔5min漩涡混匀5s;
8.短暂的离心;
9.放置在磁力架上,静置5min,移去上清;
10.洗涤磁珠:
(1)加500L在65℃预热的SureSelect Wash Buffer#2,漩涡混匀5s;
(2)在65℃温育10min,每隔3min混匀一下;
(3)短暂离心;
(4)放在磁力架上,静置5min,移去上清;
(5)再重复步骤(1)到(4)两次,共洗脱3次;
11.加50L的SureSelect Elution Buffer,漩涡混匀5s;
12.室温温育10min,每隔3min混匀一下;
13.短暂离心;
14.放磁力架上,静置5min;
15.将上清转移到新的1.5ml离心管(得到捕获的DNA文库);
16.加50L的SureSelect Neutralization Buffer到捕获的DNA文库中,并短暂漩涡混匀。
(四)用AMPure磁珠纯化样品
1.加180L磁珠到1.5ml离心管,再加100L捕获的DNA文库,漩涡混匀;
2.混合液26℃,温育5min;
3.将离心管放置在磁力架上,静置10min,弃上清;
4.加入70%乙醇500L,静置1min,弃上清;
5.重复步骤4,再洗一遍;
6.将离心管放在37℃,温育5min,使乙醇充分挥发;
7.加入30L的Nuclease-free Water,漩涡混匀,室温孵育2min;
8.将离心管放置在磁力架上,静置3min;
9.小心移取上清至新的1.5ml离心管内备用。
(五)捕获样品扩增
在超净工作台中,取PCR管,按下表所示,在冰盒上加入各种试剂,保持冰浴状态;
试剂 | 每个反应用量(L) |
Captured DNA | 14 |
Nuclease-free water | 22.5 |
5X Herculase II Run Buffer(clear cap) | 10 |
100 mM dNTP Mix(green cap) | 0.5 |
Herculase II Fusion DNA Polymerase(red cap) | 1 |
PosHyb-PEF | 1 |
PosHyb-PER | 1 |
总反应体系 | 50 |
配好体系后,用移液枪轻轻混匀;
◆PCR扩增条件
(六)AMPure磁珠纯化PCR产物
1.加90L磁珠到1.5ml离心管,再加50L扩增的PCR产物,漩涡混匀;
2.混合液26℃,温育5min;
3.将离心管放置在磁力架上,静置10min,弃上清;
4.加入70%乙醇500L,静置1min,弃上清;
5.重复步骤4,再洗一遍;
6.将离心管放在37℃,温育5min,使乙醇充分挥发;
7.加入30L的Nuclease-free Water,漩涡混匀,室温孵育2min;
8.将离心管放置在磁力架上,静置3min;
9.小心移取上清至新的1.5ml离心管内备用;
10.取1L用Agilent 2200检测;
11.取2ul用Qubit 2.0定量。
五、上机测序:
96个样品在illumina公司的Miseq进行上机测序。
六、数据分析:
数据结果通过CLC Genomics Workbench 7.0进行生物信息学分析。
七、结果:
通过1次测序,2天完成270个样品所有1个目的基因170条序列的测序工作,测序总数达到459006条。用ABI3730xl进行2个基因的平行对照,突变检出率为65%。而本方案的测序突变检出率达到88%,检验准确率100%。
Claims (11)
1.一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒,其包括:捕获目的CYP11B1基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针;用于扩增待测片段的通用引物;测序接头序列;缓冲液dNTP;高保真聚合酶;链霉素磁珠。
2.根据权利要求1所述“一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒”,全部探针在3’采用生物素修饰。
3.根据权利要求1所述“一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒”这种探针是寡聚核糖核酸(RNA),或寡聚脱氧核糖核酸(DNA),但是不仅限于RNA和DNA,可以包括生物素、荧光或者同位素等修饰后的DNA或者RNA。
4.根据权利要求1所述“一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒”的探针是结合在磁珠上的,或结合在载玻片上,但不仅限于这些介质。
5.根据权利要求1所述“一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒”的探针针对目标区域以高密度叠瓦式设计,探针序列与CYP11B1为互补序列。
6.根据权利要求1所述“一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒”探针长度在50-180bp,最优为75bp。
7.根据权利要求1所述“一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒”探针长度在60-200bp,最优为80bp。
8.根据权利要求1所述“一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒”探针长度在65-2200bp,最优为85bp。
9.根据权利要求1所述“一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒”探针长度在70-240bp,最优为90bp。
10.根据权利要求1所述“一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒”探针重叠部分适宜范围为5bp-20bp,最优为8bp。
11.根据权利要求1所述“一种检测11β-羟化酶缺乏症相关基因突变的试剂盒”链霉素磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、钕铁硼永磁材料、橡胶磁,但不仅限于这些材质。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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