CN104450885A - 一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒 - Google Patents

一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒 Download PDF

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CN104450885A CN201410587167.2A CN201410587167A CN104450885A CN 104450885 A CN104450885 A CN 104450885A CN 201410587167 A CN201410587167 A CN 201410587167A CN 104450885 A CN104450885 A CN 104450885A
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Abstract

本发明涉及一种检测神经纤维瘤病相关基因突变样品制备试剂盒。具体的涉及一种应用大规模平行测序平台技术检测经纤维瘤病NF1相关基因的产品，该试剂盒包括：A.独特设计并制备捕获探针，针对基因NF1全部外显子片段；B.设计独特带有标签序列的接头；C.通用引物对探针序列进行PCR扩增；D.设计独特的混合后目的片段的捕获操作。这个方法和试剂盒制备的大规模平行测序平台样品通量大、效率高、操作简便，极大地降低了测序检验成本。

Description

一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的体外诊断试剂盒，是一种应用于新一代测序平台技术的一种神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒。
技术背景
神经纤维瘤病(Neurofibromatosis 1，NF1)由抑癌基因NF1突变所致，以多发性咖啡牛奶斑、腋窝或腹股沟斑点、多发性皮肤纤维瘤和虹膜Lisch结节为特征，较为严重的少见临床表现还包括簇状神经纤维瘤、视神经或其他中枢神经系统胶质瘤、恶性周围神经鞘瘤、脊柱侧凸、胫骨发育不良和血管病变。
2.遗传模式及流行病学
NF1呈常染色体显性遗传，外显率高，患者在儿童期后基本上全部表现出临床症状。NF1基因突变率高，约50％的患者由NF1基因新发突变所致。该病是最常见的常染色体显性遗传病之一，发病率约1/3000[1-2]。
3.临床表现
NF1的临床表现极具多样性。许多患者可能仅表现为皮肤症状和Lisch结节，严重并发症的发生率将随年龄的增长而增加，并且许多临床症状的显现时间具有特征性。
几乎所有患者均有多发性咖啡牛奶斑，通常出生时即存在。约50％的患者可见簇状神经纤维瘤，大部分发生于体内，易被临床忽视，症状性的簇状神经纤维瘤可引起畸形、累及功能甚至危及生命。视神经胶质瘤可导致失明和Lisch结节，症状性视神经胶质瘤通常在6岁前即表现为视力丧失或眼球突出。患者最严重的骨骼并发症主要有脊柱侧凸、脊柱发育不良、假性关节病和过度生长等。其他临床表现还包括血管病变、高血压、颅内肿瘤、恶性周围神经鞘肿瘤等。至少50％的个体存在学习障碍。
参考文献：
[1]Lammert M，Friedman JM，Kluwe L，et al.Prevalence of neurofibromatosis 1 in German children atelementary school enrollment.Arch Dermatol.2005；141：71-74.
[2]Evans DG，Howard E，Giblin C，et al.Birth incidence and prevalence of tumor-prone syndromes：estimatesfrom a UK family genetic register service.Am J Med Genet A.2010；152A(2)：327-332.
对于神经纤维瘤病的鉴别诊断传统的方法主要依靠生化检查和影像学检查。这些手段存在很大的缺点：
1.检查种类多；
2.灵敏度和特异度低；
3.易受药物和精神状况等因素的影响；
4.检测时间要求苛刻；
基因诊断的优势在于：
1.方便，安全，快捷：仅抽取2-4毫升血；
2.任何时间都可以检查；
3.不限制饮食，服药，任何身体状况都可以检测；
4.相比反复，多项传统检查，更为经济；
5.发病前，疾病极早期诊断的唯一方式；
6.源头确诊，一次检测，终身受益。
这一切都揭示了基因诊断在临床上有巨大的应用前景。
近年，大规模DNA平行测序平台(massively parallel DNA sequencingplatform)已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。
但是直接使用大规模DNA平行测序平台检测的成本目前仍然令个人难以承受。本发明可以同时把多个甚至几十病人的神经纤维瘤病相关基因精确的选择性捕获，然后用于大规模测序平台，可以极大地降低基因诊断的成本，使之广泛应用于临床成为可能。
发明内容
本发明的目的是，提供一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的目标捕获再测序的试剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本低。
为实现上述目的，本发明采用捕获目的NF1基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。本发明采用的技术方案是：一种新的目标捕获再测序方法，包括以下步骤：
A.设计并制备用于捕获神经纤维瘤病相关基因突变的探针。并将这些探针结合在磁珠、薄膜或者玻片上。探针序列见序列表。
B.将待测基因DNA样品分别片段化至200-400bp，然后将末端补平，加入的ATP使片段两端引入粘性末端。
C.分别加入Illumina公司DNA Sample Prep Kit中设计好的一端带有标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与的一对接头连接，形成新的片段。
D.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对Illumina公司Index Kit-PCR primers通用引物，对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR扩增反应；
E.将步骤d所得全部样品的PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交，然后经过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。
F.将待测片段通过illumina公司Miseq测序仪的标准方案进行大规模平行测序。
G.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。
为实现上述技术方案，步骤A所述的捕获探针是脱氧核糖核酸(DNA)，或是核糖核酸(RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针为120bp的与目标互补的片段组成。探针可以是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。链霉素磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、钕铁硼永磁材料、橡胶磁，但不仅限于这些材质。
其中，步骤A所述的捕获探针，包括覆盖基因NF1全部编码外显子片段和两端50bp范围内的序列。这些探针以叠瓦式设计，片段长度为50bp-180bp，最优为75bp；片段长度为60bp-200bp，最优为80bp；片段长度为65bp-220bp，最优为85bp；片段长度为70bp-240bp，最优为90bp；探针之间重叠部分为5-20bp，最优为8bp；目标区碱基的探针覆盖度为1×至10×，最优为3×。
本发明的主要优点在于：
1.本发明可以在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部神经纤维瘤病相关基因的检测；全部序列直接测出，准确率可以达到99.99％。
2.本发明的试剂盒可以一次完成1-48个样品的平行捕获，提高了捕获效率，极大地降低了样品准备的成本。
3.本发明的试剂盒可以一次完成1-1152个样品的全部神经纤维瘤病相关基因，近4000条序列的平行检测，充分利用设备的高通量特性，极大降低了每个样品的测序成本。
4.本发明的试剂盒可以一次反应同时分辨错义、插入和缺失突变。大大增加了临床检出率和准确性。
5.本发明的检测方法步骤简单，减少重复操作的环节，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定引物，提高了检测准确率和稳定性。
6.本发明所提供的检测方法所需时间大大少于sanger法的测序技术.
实例：在完成同样的检测量(100人份的检测量)，sanger法需要2个人工同时工作一周。我们的方法只需要一个人在一天内完成全部的检测量。
7.检测的准确度大大优于基因芯片技术，更符合临床检测要求。基因芯片只能检测碱基错义突变，而插入和缺失突变无法同时检测。我们的方法可以同时检测错义、插入、缺失和可变剪切的基因突变。
附图说明
图示为目标区域序列和探针。
具体实施方式
下面用实施例仅是对本发明实际应用的举例描述，本发明的实际应用不仅限于以下实施例：
实施例一、
一、探针设计：
按表合成链霉素标记的探针。探针溶液采用agilent公司的SureSelect缓冲系统体系。
二、基因组提取：
采用Qiagen FlexiGene DNA Kit(Code No：51204)进行提取待测96份样本的基因组，OD260/280值达到1.8-2.0，各取1-3μg做为起始模板。
三、测序前样品制备
1.目的基因片段化：
取定量过的270份基因组DNA，稀释至20-35ng/μL。取130μL，用超声破碎仪分别进行片段化。
2.AMpure XP片段化选择
1.取96孔板，加入80-100μL磁珠后，再加入样品DNA，移液器反复吹打混匀；
2.混合液26℃放置5min；
3.将96孔板静置在磁板上3min；
4.小心移取全部上清至新的孔中，小心不要碰到磁环；
5.再在移至新孔的上清中加入100-150μL磁珠，移液器反复吹打，充分混匀；
6.混合液26℃放置5min；
7.将96孔板静置在磁板上3min，小心移去上清；
8.加入70％乙醇200μL，静置30s，小心移去上清；
9.重复步骤8操作一次；
10.将96孔板从磁板上取下，敞口放置，使乙醇充分挥发；
11.加入40μL 10mM pH＝8.0 Tris-HCl，移液器反复吹打混匀；
12.将96孔板静置在磁板上1min，至溶液变清；
13.小心移取上清至新的PCR管内，得到纯化后的基因组DNA。
3.末端平齐和纯化
1.取96孔板，按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态。
试剂 每个反应用量(μL)
DNA sample 19
10x Blunting Buffer 2.5
1mM dNTP Mix 2.5
Blunt Enzyme Mix 0.5
Nuclease-Free Water 0.5
总反应体系 25
2.于PCR仪中(热盖50℃)，12℃孵育20min，然后37℃孵育15min；
3.取96孔板，先加入充分混匀的磁珠45μL，再加入样品，移液器吹打混匀；
4.混合液26℃，静置5min；
5.将96孔板放置在磁板上，静置3min，弃上清；
6.加入70％乙醇200μL，静置30s，弃上清；
7.重复步骤6，再洗一遍；
8.将96孔板从磁板上取下，敞口放置，使乙醇充分挥发；
9.加入40μL 10mM pH＝8.0 Tris-HCl，移液器吹打10次混匀；
10.将96孔板放置在磁板上，静置1min；小心移取上清至干净的PCR管内备用。
4.接头连接和纯化
1.Oligo分别用pH＝7.560mM Tris-HCl(含150mM NaCl)，稀释至400μM；按下表所示，配制接头工作液：
2.等摩尔混合每个接头的两条oligo，混匀后，打开PCR仪，设置好程序为95℃孵育2min，降温至20℃，每秒降温0.1度，程序完成后，放置冰上，分装，-20℃冻存；
3.取PCR管，按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态；
试剂 每个反应用量(μL)
DNA sample 15
2x Quick ligation Reaction Buffer 25
Adapter oligo mix AP(200uM) 2
PE-AP(200uM) 2
Quick T4 DNA ligase 1.2
Nuclease-free Water 4.8
总体积 50
4.放于Thermo comfort内25℃孵育15min；
5.取96孔板，先加入充分混匀的磁珠90μL，再加入样品，移液器吹打混匀；
6.混合液26℃，静置5min；
7.将96孔板放置在磁板上，静置3min，弃上清；
8.加入70％乙醇200μL，静置30s，弃上清；
9.重复步骤8，再洗一遍；
10.将96孔板从磁板上取下，敞口放置，使乙醇充分挥发；
11.加入40μL 10mM pH＝8.0 Tris-HCl，移液器吹打10次混匀；
12.将96孔板放置在磁板上，静置1min，小心移取上清至干净的PCR管内备用。
5.缺口修补和纯化
1.取PCR管，按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态。
组分 体积(μL)
连接接头后的gDNA 40
10x ThermoPol Reaction Buffer 5
10mM dNTP mix 1
Bst DNA Polymerase，Large Fragment 2.5
Nuclease-free Water 1.5
总体积 50
2.PCR仪上(热盖50℃)37℃孵育15min；
3.取96孔板，先加入充分混匀的磁珠90μL，再加入样品，移液器吹打10次混匀；
4.混合液26℃，静置5min；
5.将96孔板放置在磁板上，静置3min，弃上清；
6.加入70％乙醇200μL，静置30s，弃上清；
7.重复步骤6再洗一遍；
8.将96孔板从磁板上取下，敞口放置，使乙醇充分挥发；
9.加入40μL 10mM pH＝8.0 Tris-HCl，移液器吹打10次混匀；
10.将96孔板放置在磁板上，静置1min，小心移取上清至干净的PCR管内备用；
11.取2μL用Qubit 2.0进行定量。
6.文库扩增(Herculase II Fusion DNA Polymerases)
1.在超净台中配制PCR反应体系，取PCR管，按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态，配好体系后，用移液器轻轻混匀；
2.PCR扩增条件
7.磁珠纯化PCR产物
1.取96孔板，先加入充分混匀的磁珠90μL，再加入样品，移液器吹打10次混匀；
2.混合液26℃，静置5min；
3.将96孔板放置在磁板上，静置3min，弃上清；
4.加入70％乙醇200μL，静置30s，弃上清；
5.重复步骤4，再洗一遍；
6.将96孔板从磁板上取下，敞口放置，使乙醇充分挥发；
7.加入40μL 10mM pH＝8.0 Tris-HCl，移液器吹打10次混匀；
8.将96孔板放置在磁板上，静置1min；小心移取上清至干净的PCR管内备用；
9.取2μL用Qubit 2.0定量，取1μL用Agilent 2200检测。
四、采用设计探针捕获目的片段
(一)文库杂交
1、采用agilent公司的Sureselect系统的缓冲液，配制杂交缓冲液：
Reagent Volume for 1 capture(μL)
Sureselect hyb#1 25
Sureselect hyb#2 1
Sureselect hyb#3 10
Sureselect hyb#4 13
Total 49
2、配制捕获混合液：
1.将PCR板(PCR板1)放在冰上，预冷；
2.按照SureSelect RNase Block∶Nuclease-free Water＝1∶9的比例配制需要的RNase Block稀释液，冰上放置，待用；
3.按反应数量，每样品孔加入5μL稀释的SureSelect RNase Block(本部分步骤2配制)；
4.步骤3的每个样本孔中，加入2μL的SureSelect Capture Library，并用移液枪混匀；
5.冰上放置，备用。
3、用agilent公司的Sureselect系统配制Sureselect Block Mix：
Reagent Volume for 1 reaction(μL)
Sureselect Indexing Block#1 2.5
Sureselect Block#2 2.5
Blocker for PE/SE 0.6
Total 5.6
4、准备目标富集的样品文库：
1.在PCR板2上的B排，加入3.4μL准备好的样品文库(浓度为147ng/μL)；
2.在PCR板2的B排，加入5.6μL的SureSelect Block Mix混合液，并用移液枪上下混匀；
3.密封PCR板2的B排，并将其放在PCR仪上；
4.按下表进行加热(105℃热盖)
步骤 温度 时间
Step1 95℃ 5min
Step2 65℃ hold
5.保持PCR板2在65℃，在A排加入40μL的Hybridization Buffer，封口，孵育至少5min后再进行下一步的实验；
6.将PCR板1的SureSelect Capture Library Mix加入到PCR板2中：
(1)在PCR板2的C排，加入7μL的Capture Library Mix(PCR板需保持65℃)；
(2)密封盖子；
(3)65℃孵育2min；
7.从A排取13μL的Hybridization Buffer，加入到C排的SureSelect Capture Library Mix中(PCR板需保持65℃)；
8.将B排中准备的样品文库混合液全部加入到C排的杂交液中，用移液枪轻轻混匀8-10次(PCR板需保持65℃)；
9.用新的胶膜将PCR板密封；
10.在PCR仪上(热盖105℃)，将杂交混合液65℃孵育24h。
(二)准备磁珠
1.在1.5ml离心管中，加入50μL的Streptavidin T1磁珠；
2.磁珠洗脱：
(1)加200μL的SureSelect Binding Buffer；
(2)漩涡混合器上混匀5s；
(3)将离心管放在磁力架上；
(4)移去上清；
(5)再重复步骤(1)到(4)两次，共洗脱3次；
3.加入200μL的SureSelect Binding Buffer重新悬挂磁珠。
(三)用SureSelecte系统进行选择性杂交捕获
1.温育24h后，确定并记录杂交体积；
2.保持PCR板在PCR仪上65℃，将杂交混合液直接加入到磁珠溶液中，颠倒混匀3-5次；
3.将杂交-捕获和磁珠的混合液放置在混合器上，室温温育30min；
4.短暂的离心；
5.放置在磁力架上，静置5min，移去上清；
6.加入500μL的SureSelect Wash Buffer#1，漩涡混合5s；
7.室温温育，共15min，但需每隔5min漩涡混匀5s；
8.短暂的离心；
9.放置在磁力架上，静置5min，移去上清；
10.洗涤磁珠：
(1)加500μL在65℃预热的SureSelect Wash Buffer#2，漩涡混匀5s；
(2)在65℃温育10min，每隔3min混匀一下；
(3)短暂离心；
(4)放在磁力架上，静置5min，移去上清；
(5)再重复步骤(1)到(4)两次，共洗脱3次；
11.加50μL的SureSelect Elution Buffer，漩涡混匀5s；
12.室温温育10min，每隔3min混匀一下；
13.短暂离心；
14.放磁力架上，静置5min；
15.将上清转移到新的1.5ml离心管(得到捕获的DNA文库)；
16.加50μL的SureSelect Neutralization Buffer到捕获的DNA文库中，并短暂漩涡混匀。
(四)用AMPure磁珠纯化样品
1.加180μL磁珠到1.5ml离心管，再加100μL捕获的DNA文库，漩涡混匀；
2.混合液26℃，温育5min；
3.将离心管放置在磁力架上，静置10min，弃上清；
4.加入70％乙醇500μL，静置1min，弃上清；
5.重复步骤4，再洗一遍；
6.将离心管放在37℃，温育5min，使乙醇充分挥发；
7.加入30μL的Nuclease-free Water，漩涡混匀，室温孵育2min；
8.将离心管放置在磁力架上，静置3min；
9.小心移取上清至新的1.5ml离心管内备用。
(五)捕获样品扩增
在超净工作台中，取PCR管，按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态；
试剂 每个反应用量(μL)
Captured DNA 14
Nuclease-free water 22.5
5X Herculase II Run Buffer(clear cap) 10
100mM dNTP Mix(green cap) 0.5
Herculase II Fusion DNA Polymerase(red cap) 1
PosHyb-PEF 1
PosHyb-PER 1
总反应体系 50
配好体系后，用移液枪轻轻混匀；
◆PCR扩增条件
(六)AMPure磁珠纯化PCR产物
1.加90μL磁珠到1.5ml离心管，再加50μL扩增的PCR产物，漩涡混匀；
2.混合液26℃，温育5min；
3.将离心管放置在磁力架上，静置10min，弃上清；
4.加入70％乙醇500μL，静置1min，弃上清；
5.重复步骤4，再洗一遍；
6.将离心管放在37℃，温育5min，使乙醇充分挥发；
7.加入30μL的Nuclease-free Water，漩涡混匀，室温孵育2min；
8.将离心管放置在磁力架上，静置3min；
9.小心移取上清至新的1.5ml离心管内备用；
10.取1μL用Agilent 2200检测；
11.取2ul用Qubit 2.0定量。
五、上机测序：
96个样品在illumina公司的Miseq进行上机测序。
六、数据分析：
数据结果通过CLC Genomics Workbench 7.0进行生物信息学分析。
七、结果：
通过1次测序，2天完成270个样品所有2个目的基因170条序列的测序工作，测序总数达到459006条。用ABI3730xl进行2个基因的平行对照，突变检出率为65％。而本方案的测序突变检出率达到88％，检验准确率100％。

Claims (11)

1.一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒，其包括：捕获目的NF1基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。
2.根据权利要求1所述“一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒”，全部探针在3’采用生物素修饰。
3.根据权利要求1所述“一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒”这种探针是寡聚核糖核酸(RNA)，或寡聚脱氧核糖核酸(DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以包括生物素、荧光或者同位素等修饰后的DNA或者RNA。
4.根据权利要求1所述“一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒”的探针是结合在磁珠上的，或结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。
5.根据权利要求1所述“一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒”的探针针对目标区域以高密度叠瓦式设计，探针序列与NF1为互补序列。
6.根据权利要求1所述“一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒”探针长度在50-180bp，最优为75bp。
7.根据权利要求1所述“一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒”探针长度在60-200bp，最优为80bp。
8.根据权利要求1所述“一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒”探针长度在65-2200bp，最优为85bp。
9.根据权利要求1所述“一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒”探针长度在70-240bp，最优为90bp。
10.根据权利要求1所述“一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒”探针重叠部分适宜范围为5bp-20bp，最优为8bp。
11.根据权利要求1所述“一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒”链霉素磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、钕铁硼永磁材料、橡胶磁，但不仅限于这些材质。
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Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755399A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 杭州艾诺医学检验所有限公司 一种i型神经纤维瘤病致病基因突变及基于此基因突变的病因学诊断试剂
CN107937508A (zh) * 2017-11-20 2018-04-20 中国医学科学院阜外医院 一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒
WO2018186680A1 (ko) * 2017-04-05 2018-10-11 울산대학교 산학협력단 게놈 dna 기반의 장 pcr 프라이머 세트를 포함하는 신경섬유종증 진단용 조성물
CN109988824A (zh) * 2019-04-30 2019-07-09 明码（上海）生物科技有限公司 一种检测nf1基因外显子基因突变的引物及方法、试剂盒
CN110387400A (zh) * 2018-04-19 2019-10-29 上海迪赢生物科技有限公司 一种同时捕获基因组目标区域正反义双链的平行液相杂交捕获方法
CN112195286A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv26的探针及其试剂盒
CN112195281A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv56的探针及其试剂盒
CN112195279A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv59的探针及其试剂盒
CN112195284A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv73的探针及其试剂盒
CN112195282A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv35的探针及其试剂盒
CN112195280A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv39的探针及其试剂盒
CN112195283A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv31的探针及其试剂盒
CN112195285A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv53的探针及其试剂盒
CN112266981A (zh) * 2020-11-12 2021-01-26 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv68的探针及其试剂盒
CN112266982A (zh) * 2020-11-12 2021-01-26 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv45的探针及其试剂盒
CN112301165A (zh) * 2020-11-12 2021-02-02 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv82的探针及其试剂盒
CN112301166A (zh) * 2020-11-12 2021-02-02 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv51的探针及其试剂盒
CN112301164A (zh) * 2020-11-12 2021-02-02 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv66的探针及其试剂盒
CN112522439A (zh) * 2020-11-12 2021-03-19 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测5种人乳头瘤病毒hpv分型和整合的探针组及其试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103290137A (zh) * 2013-06-26 2013-09-11 北京迈基诺基因科技有限责任公司 一种肿瘤易感基因的筛查方法
CN103517991A (zh) * 2010-10-27 2014-01-15 昆特拜克股份公司 通过包括嵌入物分子的探针捕获目标dna和rna

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103517991A (zh) * 2010-10-27 2014-01-15 昆特拜克股份公司 通过包括嵌入物分子的探针捕获目标dna和rna
CN103290137A (zh) * 2013-06-26 2013-09-11 北京迈基诺基因科技有限责任公司 一种肿瘤易感基因的筛查方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ILLUMINA: "TruSeqTM Exome Enrichment Kit", 《ILLUMINA，DATA SHEET: SEQUENCING》, 22 August 2011 (2011-08-22) *
J GREGORY CAPORASO等: "Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms", 《THE ISME JOURNAL》, 8 March 2012 (2012-03-08) *
孙中武等: "神经纤维瘤病Ⅰ型基因突变研究进展", 《中华医学遗传学杂志》, no. 05, 12 October 1998 (1998-10-12) *

Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755399A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 杭州艾诺医学检验所有限公司 一种i型神经纤维瘤病致病基因突变及基于此基因突变的病因学诊断试剂
CN106755399B (zh) * 2016-12-21 2019-11-15 杭州艾诺医学检验所有限公司 一种i型神经纤维瘤病致病突变基因及基于此突变基因的病因学诊断试剂
WO2018186680A1 (ko) * 2017-04-05 2018-10-11 울산대학교 산학협력단 게놈 dna 기반의 장 pcr 프라이머 세트를 포함하는 신경섬유종증 진단용 조성물
CN107937508A (zh) * 2017-11-20 2018-04-20 中国医学科学院阜外医院 一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒
CN110387400A (zh) * 2018-04-19 2019-10-29 上海迪赢生物科技有限公司 一种同时捕获基因组目标区域正反义双链的平行液相杂交捕获方法
CN110387400B (zh) * 2018-04-19 2023-03-21 上海迪赢生物科技有限公司 一种同时捕获基因组目标区域正反义双链的平行液相杂交捕获方法
CN109988824A (zh) * 2019-04-30 2019-07-09 明码（上海）生物科技有限公司 一种检测nf1基因外显子基因突变的引物及方法、试剂盒
CN112195283A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv31的探针及其试剂盒
CN112301165A (zh) * 2020-11-12 2021-02-02 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv82的探针及其试剂盒
CN112195284A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv73的探针及其试剂盒
CN112195282A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv35的探针及其试剂盒
CN112195280A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv39的探针及其试剂盒
CN112195281A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv56的探针及其试剂盒
CN112195285A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv53的探针及其试剂盒
CN112266981A (zh) * 2020-11-12 2021-01-26 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv68的探针及其试剂盒
CN112266982A (zh) * 2020-11-12 2021-01-26 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv45的探针及其试剂盒
CN112195279A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv59的探针及其试剂盒
CN112301166A (zh) * 2020-11-12 2021-02-02 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv51的探针及其试剂盒
CN112301164A (zh) * 2020-11-12 2021-02-02 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv66的探针及其试剂盒
CN112522439A (zh) * 2020-11-12 2021-03-19 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测5种人乳头瘤病毒hpv分型和整合的探针组及其试剂盒
CN112195286A (zh) * 2020-11-12 2021-01-08 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv26的探针及其试剂盒
CN112522439B (zh) * 2020-11-12 2024-01-30 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测5种人乳头瘤病毒hpv分型和整合的探针组及其试剂盒
CN112195280B (zh) * 2020-11-12 2024-01-30 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv39的探针及其试剂盒
CN112195286B (zh) * 2020-11-12 2024-04-19 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv26的探针及其试剂盒

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