CN113214403A

CN113214403A - 一种高效链霉亲和素磁珠及其制备方法

Info

Publication number: CN113214403A
Application number: CN202110448031.3A
Authority: CN
Inventors: 周勇; 宋阳阳
Original assignee: Chongqing Westen Frontier Biology Research Institute Co ltd
Current assignee: Chongqing Westen Frontier Biology Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2041-04-25
Also published as: CN113214403B

Abstract

本发明公开了一种高效链霉亲和素磁珠及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：步骤一、羧基磁珠的活化；步骤二、羧基磁珠与链霉亲和素的共价偶联；步骤三、物理式附着结合的链霉亲和素的剥离及检测；步骤四，链霉亲和素磁珠的淬灭及保存。本发明方法制得的链霉亲和素磁珠稳定性好，活性强，偶联效率高，与传统方法相比，偶联效率由58.2%提高到92.7%。

Description

一种高效链霉亲和素磁珠及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种高效链霉亲和素磁珠及其制备方法。

背景技术

链霉亲和素磁珠因与生物素标记配体，如生物素标记核酸、抗体或细胞表面蛋白等有高效地结合力，被广泛应用于生物研发及应用领域，然而链霉亲和素在与磁珠偶联时时常发生附着式地物理连接，不能稳定地与磁珠结合，特别是在后期应用时，经对磁珠地反复冲洗，时常发生链霉亲和素从磁珠上剥离的现象。同时，链霉亲和素由于是一种活性物质，偶联磁珠时极易发生失活现象，导致后期链霉亲和素磁珠的低结合效率。因此，一种高效稳定地将链霉亲和素偶联到磁珠的方法亟待研发。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，该方法制得的链霉亲和素磁珠稳定性好，偶联效率高，偶联效率高达92.7%。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，羧基磁珠的活化；

步骤二，羧基磁珠与链霉亲和素的共价偶联；

步骤三，物理式附着结合的链霉亲和素的剥离及检测；

步骤四，链霉亲和素磁珠的淬灭及保存。

进一步的，所述步骤一中羧基磁珠活化的方法如下：（1）取羧基磁珠原液于EP管中，置于磁力架上磁珠分选两分钟，去除保存液；（2）加入 0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠两次，磁珠分选去上清；（3）加入现配现用的5mg/mL NHS和5mg/mL BOP溶液37℃旋转孵育2小时，活化磁珠表面的羧基；（4）活化后磁珠分选2min，并加入0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠3次，去除活化剂。

进一步的，所述步骤二中羧基磁珠与链霉亲和素共价偶联的方法如下：（1）将步骤一活化后的羧基磁珠放于偶联缓冲液中,加入链霉亲和素，室温旋转孵育至少3小时，磁珠分选去上清；（2）加入0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠三次，加入500uL 0.01M 磷酸盐缓冲液重悬磁珠。

进一步的，所述步骤三中物理式附着结合的链霉亲和素的剥离及检测的方法如下：（1）将步骤二中得到的偶联过链霉亲和素的磁珠放入微量透析装置（截留分子量应大于70K）,透析液为0.01M 磷酸盐缓冲液，期间每4小时换透析液一次，磁力搅拌透析24h；（2）透析完成后，将透析装置放于离心管中，1500g离心1分钟；（3）收集离心液做Western blot，用HRP标记的生物素作为检测抗体，检测物理式附着结合的链霉亲和素是否从磁珠上完全剥离；（4）将剥离后的磁珠与链霉亲和素偶联缓冲液再次孵育，填补剥离后空缺的—COOH位点，孵育后再用0.01M 磷酸盐缓冲液进行三次磁珠分选清洗。

进一步的，所述步骤四中链霉亲和素磁珠的淬灭及保存的方法如下：（1）在步骤三获得的链霉亲和素磁珠中加入淬灭缓冲液，轻柔混合，在旋转器上孵育45分钟；（2）用磁力架收集磁珠，去除上清；（3）添加保存液进行保存；其中，淬灭缓冲液为0.638mL乙醇胺加10mL 磷酸盐缓冲液配制而得；保存液为 1g酪蛋白、2g蔗糖加入100mL 磷酸盐缓冲液配制而得。

进一步的，所述偶联缓冲液的配制如下：取链霉亲和素、BOP试剂加入硼酸盐缓冲液，其中硼酸盐缓冲液是由10% 0.05 M 的 Na₂B₄O₇溶液和90% 0.2 M 的H₃BO₃ 溶液配制而成，最终pH 值为 7.4，灭菌后4℃保存备用。

本发明的有益效果在于：

本发明方法制得的链霉亲和素磁珠稳定性好，活性强，偶联效率高，与传统方法相比，偶联效率由58.2%提高到92.7%。本发明通过对物理式附着结合的链霉亲和素进行剥离，使得磁珠表面-COOH位点得到极大利用，增加了磁珠表面紧密结合链霉亲和素的偶联效率。本发明偶联缓冲液中采用新一代BOP（卡特缩合剂）取代传统的EDC（碳二亚胺）做为链霉亲和素-NH2与磁珠-COOH偶联成肽键的缩合剂，使得接肽效率远远增加，增加了链霉亲和素与磁珠的偶联效率；同时BOP显著减少消旋风险的产生，大大提高了链霉亲和素的稳定性，使得链霉亲和素与生物素有更好的结合活性。

附图说明

图1 链霉亲和素偶联效率测定结果图。

图2链霉亲和磁珠与辣根过氧化物酶（HRP）标记的生物素点杂交结果图。

具体实施方式

为了充分了解本发明的目的、特征及效果，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围不局限于下面的实施例。

下述实施例中使用的主要试剂：羧基磁珠PM3-020 (上海奥润微纳新材料科技有限公司)；链霉亲和素（SIGMA，美国）；50K MWCO微量透析装置（Merck，德国）；BOP试剂（APExBIO，美国）。

一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，其包括以下步骤：

1.羧基磁珠的活化

（1）取磁珠原液轻柔晃动混匀，吸取 15ul 羧基磁珠原液于1.5ml EP管中，加入1ml 0.01M磷酸盐缓冲液温柔摇晃清洗，置于磁力架上回收，此步骤重复三次，磁珠分选去上清。

（2）加入新配置的200uL 5mg/mL NHS和新配置的200uL 5mg/mL EDC溶液37℃旋转孵育2小时，活化后磁珠分选2min，并加入1mL 0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠3次，去除活化剂。

羧基磁珠与链霉亲和素的共价偶联

（1）将羧基磁珠放于偶联缓冲液中，室温旋转孵育至少3小时，磁珠分选去上清。偶联缓冲液配制如下：将100uL 1mg/mL链霉亲和素和10uL 100mg/mL的BOP溶液加入390uL硼酸盐缓冲液中，配制成 500ul 链霉亲和素偶联缓冲液。其中硼酸盐缓冲液是由10% 0.05 M的 Na₂B₄O₇溶液和90% 0.2 M 的H₃BO₃溶液配制而成，最终pH 值为 7.4，灭菌后4℃保存备用。

（2）加入1mL 0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠三次，加入500uL 0.01M 磷酸盐缓冲液重悬磁珠。

物理式附着结合的链霉亲和素的剥离及检测

（1）将偶联过链霉亲和素的磁珠放入微量透析装置中进行透析。透析液为500mL0.01M 磷酸盐缓冲液中，期间每4小时换透析液一次，磁力搅拌24h。

（2）透析完成后，将透析装置放于1.5mL离心管中，1500g离心1分钟。

（3）取20uL收集的离心液做Western blot，用HRP标记的生物素作为检测抗体，检测附着式链霉亲和素是否从磁珠上完全剥离。

（4）将剥离后的磁珠与500uL链霉亲和素偶联缓冲液再次孵育，填补附着式链霉亲和素去除后空缺的—COOH位点，孵育后再用1mL 0.01M 磷酸盐缓冲液进行三次磁珠分选清洗。

链霉亲和素磁珠的淬灭及保存

（1）磁珠分选清洗后，将磁珠加入500uL淬灭缓冲液，轻柔混合，在旋转器上孵育45分钟。其中，淬灭缓冲液为0.638mL乙醇胺加10mL 磷酸盐缓冲液配制而得。

（2）用磁力架收集磁珠，去除上清。

（3）向磁珠加入500uL保存液进行保存。保存液为 1g酪蛋白、2g蔗糖加入100mL 磷酸盐缓冲液配制而得。

实施例1 链霉亲和素偶联效率的测定

将1mg本方法制备的链霉亲和素磁珠作为实验组，记为样本1；1mg传统方法制备的链霉亲和素磁珠作为对照组，记为样本2。分别将样本1、2与40ug的链霉亲和素的进行偶联反应。经试剂盒测定偶联后上清液中的剩余链霉亲和素含量，间接计算磁珠上链酶亲和素偶联效率。

结果见图1，样本1结合效率为92.7%，样本2结合效率为58.2%，结果表明，与传统方法相比，本发明方法制得的链霉亲和素磁珠偶联效率更高。

实施例2 链霉亲和磁珠与辣根过氧化物酶（HRP）标记的生物素点杂交

将1mg本方法制备的链霉亲和素磁珠作为实验组，记为样本1；1mg传统方法制备的链霉亲和素磁珠作为对照组，记为样本2。分别将样本1、2与40ug的链霉亲和素的进行偶联反应。并将偶联好的链霉亲和素磁珠与等量的辣根过氧化物酶（HRP）标记的生物素进行点杂交，从杂交印记曝光的亮度得知磁珠上链霉亲和素的偶联效率。

结果见图2，样本1曝光后印迹明显，样本2曝光后印迹模糊，因此可知本发明方法制得的链霉亲和素磁珠偶联更多有效地链霉亲和素。

Claims

1.一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一，羧基磁珠的活化；

步骤二，羧基磁珠与链霉亲和素的共价偶联；

步骤三，物理式附着结合的链霉亲和素的剥离及检测；

步骤四，链霉亲和素磁珠的淬灭及保存。

2.如权利要求1所述的一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述步骤一中羧基磁珠活化的方法如下：（1）取羧基磁珠原液于EP管中，置于磁力架上磁珠分选两分钟，去除保存液；（2）加入 0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠两次，磁珠分选去上清；（3）加入现配现用的5mg/mL NHS和5mg/mL BOP溶液37℃旋转孵育2小时，活化磁珠表面的羧基；（4）活化后磁珠分选2min，并加入0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠3次，去除活化剂。

3.如权利要求1所述的一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述步骤二中羧基磁珠与链霉亲和素共价偶联的方法如下：（1）将步骤一活化后的羧基磁珠放于偶联缓冲液中,加入链霉亲和素，室温旋转孵育至少3小时，磁珠分选去上清；（2）加入0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠三次，加入500uL 0.01M 磷酸盐缓冲液重悬磁珠。

4.如权利要求1所述的一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述步骤三中物理式附着结合的链霉亲和素的剥离及检测的方法如下：（1）将步骤二中得到的偶联过链霉亲和素的磁珠放入微量透析装置,所述透析装置截留分子量大于70K，透析液为0.01M磷酸盐缓冲液，期间每4小时换透析液一次，磁力搅拌透析24h；（2）透析完成后，将透析装置放于离心管中，1500g离心1分钟；（3）收集离心液做Western blot，用HRP标记的生物素作为检测抗体，检测物理式附着结合的链霉亲和素是否从磁珠上完全剥离；（4）将剥离后的磁珠与链霉亲和素偶联缓冲液再次孵育，填补剥离后空缺的—COOH位点，孵育后再用0.01M 磷酸盐缓冲液进行三次磁珠分选清洗。

5.如权利要求1所述的一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述步骤四中链霉亲和素磁珠的淬灭及保存的方法如下：（1）在步骤三获得的链霉亲和素磁珠中加入淬灭缓冲液，轻柔混合，在旋转器上孵育45分钟；（2）用磁力架收集磁珠，去除上清；（3）添加保存液进行保存；其中，淬灭缓冲液为0.638mL乙醇胺加10mL 磷酸盐缓冲液配制而得；保存液为 1g酪蛋白、2g蔗糖加入100mL 磷酸盐缓冲液配制而得。

6.如权利要求3所述的一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述偶联缓冲液的配制如下：取链霉亲和素、BOP试剂加入硼酸盐缓冲液，其中硼酸盐缓冲液是由10%0.05 M 的 Na₂B₄O₇溶液和90% 0.2 M 的H₃BO₃ 溶液配制而成，最终pH 值为 7.4，灭菌后4℃保存备用。

7.一种高效链霉亲和素磁珠，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法制备得到。