CN115356477A - 一种链霉亲和素磁珠及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种链霉亲和素磁珠及其制备方法和应用。所述链霉亲和素磁珠的制备方法包括：利用甲苯磺酰基磁珠与链霉亲和素进行偶联，得到所述链霉亲和素磁珠，所述链霉亲和素磁珠的制备方法不使用交联剂。本发明采用甲苯磺酰基磁珠制备链霉亲和素磁珠，制备得到的链霉亲和素磁珠偶联效率高，活性强，且无需额外添加交联剂，有效简化工艺、降低成本，此外采用独特的老化缓冲液进行老化，控制老化时间，进一步提高产品的稳定性，在化学发光平台的使用过程中具有优异的性能，并且该工艺易于放大、利于控制。

Description

一种链霉亲和素磁珠及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种链霉亲和素磁珠及其制备方法和应用。

背景技术

链霉亲和素磁珠是生物检测领域应用最广泛的磁珠类型之一，链霉亲和素和生物素的特异性结合对于放大发光信号有很好的效果，因此在体外诊断市场中使用率极高，相比于直连抗体的羧基磁珠等需要针对不同项目分别优化试剂体系的产品，链霉亲和素磁珠省去了磁珠偶联抗体这一繁琐的优化步骤，直接作为检测试剂的组分之一使用，有效缩短了不同产品体系的开发周期。目前，制备出性能稳定、批间差异小、成本可控的量产型链霉亲和素磁珠是实现国产链霉亲和素磁珠广泛应用的重要手段。

链霉亲和素磁珠因与生物素标记配体，如生物素标记核酸、抗体或细胞表面蛋白等有高效地结合力，被广泛应用于生物研发及应用领域，然而链霉亲和素在与磁珠偶联时时常发生附着式地物理连接，不能稳定地与磁珠结合，特别是在后期应用时，经对磁珠反复冲洗，时常发生链霉亲和素从磁珠上剥离的现象。同时，链霉亲和素由于是一种活性物质，偶联磁珠时极易发生失活现象，导致后期链霉亲和素磁珠的低结合效率。因此，一种高效稳定地将链霉亲和素偶联到磁珠的方法亟待研发。

CN113214403A公开了一种高效链霉亲和素磁珠及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：步骤一、羧基磁珠的活化；步骤二、羧基磁珠与链霉亲和素的共价偶联；步骤三、物理式附着结合的链霉亲和素的剥离及检测；步骤四，链霉亲和素磁珠的淬灭及保存。该发明方法制得的链霉亲和素磁珠稳定性好，活性强，偶联效率高，与传统方法相比，偶联效率由58.2%提高到92.7%。该方法适用于羧基磁珠的偶联，但需要使用额外的交联剂，虽工艺合理但不易于放大生产。CN111560368A公开一种链霉亲和素修饰γ-Fe₂O₃磁珠的制备方法，其包括以下步骤：步骤一、制备纳米γ-Fe₂O₃磁珠；步骤二、用AEAPS修饰纳米粒子表面；步骤三、在纳米γ-Fe₂O₃磁珠表面连接链霉亲和素，其同样需使用交联剂。

综上所述，提供一种高效、稳定易于放大的制备链霉亲和素磁珠的方法，对于生物检测领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种链霉亲和素磁珠及其制备方法和应用，本发明采用甲苯磺酰基磁珠与链霉亲和素进行偶联以制备链霉亲和素磁珠，同时结合特定工艺过程，制备得到的链霉亲和素磁珠偶联效率高、活性强、稳定性高，且无需额外添加交联剂，有利于工艺控制。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种链霉亲和素磁珠的制备方法，所述链霉亲和素磁珠的制备方法包括：

利用甲苯磺酰基磁珠与链霉亲和素进行偶联，得到所述链霉亲和素磁珠，所述链霉亲和素磁珠的制备方法不使用交联剂。

本发明中，首次以甲苯磺酰基磁珠与链霉亲和素偶联制备链霉亲和素磁珠，无需额外添加交联剂，且制备得到的链霉亲和素磁珠偶联效率高。

本发明中，表面修饰有甲苯磺酰基的磁珠均适用于本发明，不作特殊限制，例如可选择苏州纳微生命科技有限公司生产的MagneStar^® MP3-Tosyl。

优选地，所述偶联的方法包括：

将甲苯磺酰基磁珠、链霉亲和素和偶联缓冲液A混合，再加入偶联缓冲液B，进行偶联反应。

优选地，所述偶联缓冲液A包括硼酸盐缓冲液。

本发明中，领域内通用硼酸盐缓冲液均适用于本发明，例如配方可以为0.05~0.15M（mol/L） Borate Buffer，pH 9.0~9.5。

优选地，所述偶联缓冲液B包括硫酸铵缓冲液。

本发明中，领域内通用硫酸铵缓冲液均适用于本发明，例如配方可以为1~3 M(NH₄)₂SO₄ Buffer，pH 8.6~9.5。

优选地，所述偶联反应的温度为30~50℃，包括但不限于31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、45℃、46℃、48℃或49℃，时间为16~18 h。

本发明中，可根据实际情况控制加料顺序及方式，例如可先将链霉亲和素预溶解后加料。

优选地，所述偶联的方法包括以下步骤：

（1’）将甲苯磺酰基磁珠与偶联缓冲液A混合；

（2’）将链霉亲和素与偶联缓冲液A混合；

（3’）将步骤（2’）混合液与步骤（1’）混合液混合，然后加入偶联缓冲液B，进行偶联反应。

优选地，所述偶联后还包括剥离物理吸附的链霉亲和素的步骤和封闭及老化的步骤。

优选地，所述剥离物理吸附的链霉亲和素的步骤包括：

将甲苯磺酰基磁珠与链霉亲和素偶联后得到的磁珠与淬灭缓冲液混合，进行淬灭反应，剥离物理吸附的链霉亲和素。

优选地，所述淬灭缓冲液包括Tris缓冲液。

本发明中，领域内通用Tris缓冲液均适用于本发明，例如配方可以为含有5~20 mM（mmol/L）Tris和0.01~0.05% Triton X-100，pH 7.4~8.0。

优选地，所述淬灭反应的温度30~50℃，包括但不限于31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、45℃、46℃、48℃或49℃，时间为0.5~3 h，包括但不限于0.6 h、0.7 h、0.8 h、0.9 h、1.2 h、1.5 h、2 h、2.2 h、2.4 h、2.6 h、2.8 h或2.9 h。

优选地，所述封闭及老化的步骤包括：

将经过剥离物理吸附的链霉亲和素的磁珠与封闭缓冲液混合，进行封闭反应，将封闭后磁珠与老化缓冲液混合，进行老化反应。

优选地，所述封闭缓冲液包括含有BSA的Tris缓冲液。

本发明中，领域内通用含有牛血清白蛋白（BSA）的Tris缓冲液均适用于本发明，例如配方可以为含有5~20 mM Tris Bufffer和1~4% BSA，pH 7.4~8.0。

优选地，所述封闭反应的温度为30~50℃，包括但不限于31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、45℃、46℃、48℃或49℃，时间为4~6 h。

优选地，所述老化缓冲液包括硼酸盐缓冲液。

本发明中，领域内通用硼酸盐缓冲液均适用于本发明，例如配方可以为含有5~10mM Borate buffer和0.1~0.5% BSA，pH 9.0~10.0。

本发明中，创造性采用硼酸盐缓冲液作为老化液，能够进一步提高链霉亲和素磁珠的稳定性。

优选地，所述老化反应的温度为30~50℃，包括但不限于31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、45℃、46℃、48℃或49℃，时间为24~72h，包括但不限于25h、26h、27h、28h、29h、30h、35h、40 h、45 h、50 h、55 h、60 h、65 h、66 h、68 h、69 h、70 h或71 h。

本发明中，通过控制老化时间，能够进一步提高链霉亲和素磁珠的稳定性。

作为优选的技术方案，所述链霉亲和素磁珠的制备方法包括以下步骤：

（1）将甲苯磺酰基磁珠、链霉亲和素和硼酸盐缓冲液中混合，再加入硫酸铵缓冲液，进行偶联反应；

（2）将步骤（1）产物与Tris缓冲液混合，进行淬灭反应；

（3）将步骤（2）产物与含有BSA的Tris缓冲液混合，进行封闭反应，将封闭后磁珠与硼酸盐缓冲液混合，进行老化反应，得到所述链霉亲和素磁珠。

第二方面，本发明提供一种链霉亲和素磁珠，所述链霉亲和素磁珠由第一方面所述的链霉亲和素磁珠的制备方法制备得到。

第三方面，本发明提供第二方面所述的链霉亲和素磁珠在生物检测中的应用。

本发明中，所述生物检测包括使用链霉亲和素磁珠与生物素标记的待测物结合的过程。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性采用甲苯磺酰基磁珠制备链霉亲和素磁珠，制备得到的链霉亲和素磁珠偶联效率高，活性强，且无需额外添加交联剂，有效简化工艺、降低成本，此外采用独特的老化缓冲液进行老化，控制老化时间，进一步提高产品的稳定性，在化学发光平台的使用过程中具有优异的性能，并且该工艺易于放大、利于控制。

附图说明

图1为甲苯磺酰基磁珠MagneStar^® MP3-Tosyl的扫描电镜图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种通过甲苯磺酰基磁珠制备链霉亲和素磁珠的方法，包括如下步骤：

（1）将甲苯磺酰基磁珠（MagneStar^® MP3-Tosyl，苏州纳微生命科技有限公司，扫描电镜图如图1所示）通过血液混匀仪进行充分的混匀，混匀后通过移液枪移取5 mL磁珠原液至10 mL圆底离心管中，通过磁吸分离除去上清液，加入2 mL硼酸盐缓冲液（0.1 MBorate Buffer，pH 9.5）进行振摇混匀，再次磁吸分离除去上清液，加入2 mL硼酸盐缓冲液完成溶剂置换；

（2）将3 mg链霉亲和素粉末溶解于硼酸盐缓冲液中；

（3）将溶解后的链霉亲和素溶液加入步骤（1）所得溶液中，通过振荡混匀，然后加入2 mL硫酸铵缓冲液（1 M (NH₄)₂SO₄ Buffer，pH 8.6），于40℃进行偶联反应，反应时间17h；

（4）取上述偶联反应产物，磁吸分离除去上清液，加入5 mLTris缓冲液（含有20 mMTris Buffer和0.01% Triton X-100，pH 7.4）对磁珠进行淬灭，同时剥离物理吸附的链霉亲和素，反应温度40℃，反应时间1 h；

（5）取上述经过链霉亲和素的剥离后磁珠，磁吸分离除去上清液，加入5 mL含有BSA的Tris缓冲液（含有20 mM Tris和4% BSA，pH 7.4）对磁珠进行封闭，反应温度40℃，反应时间5 h；

（6）反应结束之后再次磁吸分离除去上清液，通过5 mL硼酸盐缓冲液对磁珠进行老化，反应温度40℃，反应时间30 h；

（7）老化结束后，使用10 mL保存缓冲液（含有1×PBS、0.1% BSA和0.05% Proclin-300，pH 7.4）对磁珠进行3次清洗，最后保存在10 mL保存缓冲液中。

实施例2

本实施例提供一种通过甲苯磺酰基磁珠制备链霉亲和素磁珠的方法，包括如下步骤：

（1）将甲苯磺酰基磁珠（MagneStar® MP3-Tosyl，苏州纳微生命科技有限公司）通过血液混匀仪进行充分的混匀，混匀后通过移液枪移取5 mL磁珠原液至10 mL圆底离心管中，通过磁吸分离除去上清液，加入2 mL硼酸盐缓冲液（0.1 M Borate Buffer，pH 9.5）进行振摇混匀，再次磁吸分离除去上清液，加入2 mL硼酸盐缓冲液完成溶剂置换；

（2）将3 mg链霉亲和素粉末溶解于硼酸盐缓冲液中；

（3）将溶解后的链霉亲和素溶液加入步骤（1）所得溶液中，通过振荡混匀，然后加入2mL硫酸铵缓冲液（3 M (NH4)₂SO₄ Buffer，pH 8.6），于30℃进行偶联反应，反应时间16h；

（4）取上述偶联反应产物，磁吸分离除去上清液，加入5 mL Tris缓冲液（含有20mM Tris Buffer和0.01% Triton X-100，pH 7.4）对磁珠进行淬灭，同时剥离物理吸附的链霉亲和素，反应温度50℃，反应时间0.5 h；

（5）取上述经过链霉亲和素的剥离后磁珠，磁吸分离除去上清液，加入5 mL含有BSA的Tris缓冲液（含有20 mM Tris和4% BSA，pH 7.4）对磁珠进行封闭，反应温度30℃，反应时间4 h；

（6）反应结束之后再次磁吸分离除去上清液，通过5 mL硼酸盐缓冲液对磁珠进行老化，反应温度50℃，反应时间24 h；

（7）老化结束后，使用10 mL保存缓冲液（1×PBS、0.1% BSA和0.05% Proclin-300，pH 7.4）对磁珠进行3次清洗，最后保存在10 mL保存缓冲液中。

实施例3

本实施例提供一种通过甲苯磺酰基磁珠制备链霉亲和素磁珠的方法，包括如下步骤：

（1）将甲苯磺酰基磁珠（MagneStar® MP3-Tosyl，苏州纳微生命科技有限公司）通过血液混匀仪进行充分的混匀，混匀后通过移液枪移取5 mL磁珠原液至10 mL圆底离心管中，通过磁吸分离除去上清液，加入2 mL硼酸盐缓冲液（0.15 M Borate Buffer，pH 9.0）进行振摇混匀，再次磁吸分离除去上清液，加入2 mL硼酸盐缓冲液完成溶剂置换；

（2）将3 mg链霉亲和素粉末溶解于硼酸盐缓冲液中；

（3）将溶解后的链霉亲和素溶液加入步骤（1）所得溶液中，通过振荡混匀，然后加入2 mL硫酸铵缓冲液（1.5 M (NH4)₂SO₄ Buffer，pH 8.6），于50℃进行偶联反应，反应时间18 h；

（4）取上述偶联反应产物，磁吸分离除去上清液，加入5 mLTris缓冲液（含有5 mMTris Buffer和0.03% Triton X-100，pH 8.0）对磁珠进行淬灭，同时剥离物理吸附的链霉亲和素，反应温度30℃，反应时间3 h；

（5）取上述经过链霉亲和素的剥离后磁珠，磁吸分离除去上清液，加入5 mL含有BSA的Tris缓冲液（含有20 mM Tris和1% BSA，pH 7.4）对磁珠进行封闭，反应温度50℃，反应时间6 h；

（6）反应结束之后再次磁吸分离除去上清液，通过5 mL硼酸盐缓冲液对磁珠进行老化，反应温度30℃，反应时间72 h；

（7）老化结束后，使用10 mL保存缓冲液（含有1×PBS、0.1% BSA和0.05% Proclin-300，pH 7.4）对磁珠进行3次清洗，最后保存在10 mL保存缓冲液中。

实施例4

本实施例提供一种通过甲苯磺酰基磁珠制备链霉亲和素磁珠的方法，与实施例1相比，区别仅在于步骤（6）中老化液替换为等量PBS缓冲液，其余相同。

实施例5

本实施例提供一种通过甲苯磺酰基磁珠制备链霉亲和素磁珠的方法，与实施例1相比，区别仅在于步骤（6）中老化反应时间为20 h，其余相同。

对比例1

本对比例提供一种传统的采用羧基磁珠制备链霉亲和素磁珠的方法，包括以下步骤：

（1）取磁珠原液轻柔晃动混匀，吸取 1 mL羧基磁珠原液于1.5 mL EP管中，加入1mL 15 mM MES缓冲液吹打混匀，置于磁力架上磁吸分离除去上清液，此步骤重复三次；

（2）加入新配置的200 μL 5 mg/mL Sulfo-NHS和新配置的200 μL 5 mg/mL EDC溶液25℃旋转孵育2 h，活化后磁珠置于磁力架上磁吸分离除去上清液，并加入1 mL 15 mMMES缓冲液清洗磁珠1次；

（3）取3 mL 1 mg/mL链霉亲和素溶液加入活化后的羧基磁珠中，25℃旋转孵育2h，反应后磁珠置于磁力架上磁吸分离除去上清液；

（4）加入1 mL 1×PBS缓冲液清洗磁珠三次，最后将磁珠重悬于1 mL 1×PBS缓冲液中。

测试例1

本测试例分析实施例1、4、5及对比例1制备的链霉亲和素磁珠的稳定性，具体方法包括以下步骤：

通过化学发光平台FT4项目（AP平台）验证磁珠的稳定性，结果如表1所示。

表1

结果如表1所示，在FT4竞争法中本发明的链霉亲和素磁珠在灵敏度及信噪比上都较优，且37℃老化测试的结果表明稳定性较其他方法有明显的优势，使用特定老化液以及控制老化时间能够进一步提高磁珠的稳定性，表明本发明的链霉亲和素磁珠的制备方法能够制备在化学发光平台的使用过程中具有优异的性能。

测试例2

本测试例分析实施例1~5及对比例1制备的链霉亲和素磁珠的偶联效率，具体方法包括以下步骤：

通过BCA法测试偶联反应后的上清液中链霉亲和素浓度进行计算，链霉亲和素磁珠偶联效率=（链霉亲和素投料量-上清液中链霉亲和素浓度×上清液体积）/链霉亲和素投料量，结果如表2所示。

表2

由表2可知，本发明的链霉亲和素磁珠的制备方法链霉亲和素磁珠偶联效率高，且通过使用特定的老化液能够进一步提高偶联效率。

测试例3

本测试例将实施例1制备的链霉亲和素磁珠与国外竞品（Dynabeads-M280-Streptavidin）在化学发光平台的性能进行对比，包括如下步骤：

生物素化的抗人FT4抗体与样本中的FT4及AP标记的FT4类似物进行竞争性的结合，其后SA磁珠对生物素化的抗体进行抓取。

结果如表3所示，在FT4竞争法中本发明的链霉亲和素磁珠与竞品在灵敏度及信噪比上都非常接近，且各个校准品点的测试结果也具有一致性，表明本发明的链霉亲和素磁珠的制备方法能够制备在化学发光平台的使用过程中具有优异的性能。

表3

综上所述，本发明创造性采用甲苯磺酰基磁珠制备链霉亲和素磁珠，制备得到的链霉亲和素磁珠偶联效率高，活性强，且无需额外添加交联剂，有效简化工艺、降低成本，此外采用独特的老化缓冲液进行老化，控制老化时间，进一步提高产品的稳定性，在化学发光平台的使用过程中具有优异的性能，并且该工艺易于放大、利于控制。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述链霉亲和素磁珠的制备方法包括：

利用甲苯磺酰基磁珠与链霉亲和素进行偶联，得到所述链霉亲和素磁珠；

所述链霉亲和素磁珠的制备方法不使用交联剂。

2.根据权利要求1所述的链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述偶联的方法包括：

将甲苯磺酰基磁珠、链霉亲和素和偶联缓冲液A混合，再加入偶联缓冲液B，进行偶联反应；

所述偶联缓冲液A包括硼酸盐缓冲液；

所述偶联缓冲液B包括硫酸铵缓冲液；

所述偶联反应的温度为30~50℃，时间为16~18 h。

3.根据权利要求2所述的链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述偶联的方法包括以下步骤：

（1’）将甲苯磺酰基磁珠与偶联缓冲液A混合；

（2’）将链霉亲和素与偶联缓冲液A混合；

（3’）将步骤（2’）混合液与步骤（1’）混合液混合，然后加入偶联缓冲液B，进行偶联反应。

4.根据权利要求1所述的链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述偶联后还包括剥离物理吸附的链霉亲和素的步骤和封闭及老化的步骤。

5.根据权利要求4所述的链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述剥离物理吸附的链霉亲和素的步骤包括：

将甲苯磺酰基磁珠与链霉亲和素偶联后得到的磁珠与淬灭缓冲液混合，进行淬灭反应；

所述淬灭缓冲液包括Tris缓冲液；

所述淬灭反应的温度30~50℃，时间为0.5~3 h。

6.根据权利要求4所述的链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述封闭及老化的步骤包括：

将经过剥离物理吸附的链霉亲和素的磁珠与封闭缓冲液混合，进行封闭反应，将封闭后磁珠与老化缓冲液混合，进行老化反应；

所述封闭缓冲液包括含有BSA的Tris缓冲液；

所述封闭反应的温度为30~50℃，时间为4~6 h。

7.根据权利要求6所述的链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述老化缓冲液包括硼酸盐缓冲液；

所述老化反应的温度为30~50℃，时间为24~72 h。

8.根据权利要求1-7任一项所述的链霉亲和素磁珠的制备方法，其特征在于，所述链霉亲和素磁珠的制备方法包括以下步骤：

（1）将甲苯磺酰基磁珠、链霉亲和素和硼酸盐缓冲液中混合，再加入硫酸铵缓冲液，进行偶联反应；

（2）将步骤（1）产物与Tris缓冲液混合，进行淬灭反应；

（3）将步骤（2）产物与含有BSA的Tris缓冲液混合，进行封闭反应，将封闭后磁珠与硼酸盐缓冲液混合，进行老化反应，得到所述链霉亲和素磁珠。

9.一种链霉亲和素磁珠，其特征在于，所述链霉亲和素磁珠由权利要求1-8任一项所述的链霉亲和素磁珠的制备方法制备得到。

10.权利要求9所述的链霉亲和素磁珠在生物检测中的应用。

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