CN114950375A - 链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法和运用 - Google Patents

链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法和运用 Download PDF

Info

Publication number
CN114950375A
CN114950375A CN202210621242.7A CN202210621242A CN114950375A CN 114950375 A CN114950375 A CN 114950375A CN 202210621242 A CN202210621242 A CN 202210621242A CN 114950375 A CN114950375 A CN 114950375A
Authority
CN
China
Prior art keywords
agarose
streptavidin
magnetic beads
magnetic
sepharose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210621242.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114950375B (zh
Inventor
倪建娣
曾繁荣
郑曙剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Clongene Biotech Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Clongene Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Clongene Biotech Co ltd filed Critical Hangzhou Clongene Biotech Co ltd
Priority to CN202210621242.7A priority Critical patent/CN114950375B/zh
Publication of CN114950375A publication Critical patent/CN114950375A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114950375B publication Critical patent/CN114950375B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/24—Naturally occurring macromolecular compounds, e.g. humic acids or their derivatives
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28009—Magnetic properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
    • B01J20/28016—Particle form
    • B01J20/28021—Hollow particles, e.g. hollow spheres, microspheres or cenospheres
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
    • G01N2446/20—Magnetic particle immunoreagent carriers the magnetic material being present in the particle core
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
    • G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids
    • G01N2446/86—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids the coating being pre-functionalised for attaching immunoreagents, e.g. aminodextran
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Soft Magnetic Materials (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

本申请涉及生物检测领域，具体公开了链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法和运用，其中链霉亲和素琼脂糖磁珠通过如下步骤进行制备：S1、配置琼脂糖的水溶液，并将四氧化三铁磁珠加入到琼脂糖的水溶液中，充分混合至均匀，得到混合体系Ⅰ，S2、向烃类溶剂中，加入非离子表面活性剂Ⅰ，混合均匀后，加热至80～90℃，并将混合体系Ⅰ加入到上述体系中，继续混合均匀后降温至20～30℃，得到琼脂糖包覆磁珠体系；S3、对琼脂糖包覆磁珠体系进行对甲苯磺酰基修饰；S4、将对甲苯磺酰修饰的磁珠修饰链霉亲和素。通过上述方法制备得到的链霉亲和素琼脂糖磁珠，对杂质的吸附较小，有助于提高检测结果的灵敏度和准确度。

Description

链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法和运用
技术领域
本申请涉及链霉亲和素琼脂糖磁珠领域，更具体地说，它涉及链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法和运用。
背景技术
链霉亲和素磁珠一般通过将链霉亲和素和四氧化三铁纳米颗粒进行共价结合制备得到，在免疫反应中，通过链霉亲和素对靶点分子的偶联效果，实现对靶点分子的捕获和分离，在医学检测领域具有重要的意义。
在链霉亲和素磁珠的制备过程中，采用琼脂糖对磁珠进行包覆，再将包覆后的磁珠与链霉亲和素进行结合是一种常用的操作方法。琼脂糖具有较好的生物相容性，对链霉亲和素具有较强的固定作用，且形成的纳米颗粒在水中分散性较好。
尽管链霉亲和素琼脂糖磁珠具有诸多优点，但是由于琼脂糖磁珠本身具有类似海绵的结构，其除了链霉亲和素以外，自身也具有较好的吸附性，容易吸附体系中的大分子蛋白等杂质，进而造成测定结果不准确，容易产生假阳性或假阴性。
发明内容
为了减少链霉亲和素琼脂糖磁珠对于其他蛋白质杂质等物料的吸附，提高检测精度，本申请提供链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法。
首先，本申请提供了链霉亲和素琼脂糖磁珠的制备方法，包括如下步骤：
S1、配置琼脂糖的水溶液，并将四氧化三铁磁珠加入到琼脂糖的水溶液中，充分混合至均匀，得到混合体系Ⅰ，其中，琼脂糖和四氧化三铁的质量比（5～6）∶1；
S2、向烃类溶剂中，加入非离子表面活性剂Ⅰ，混合均匀后，加热至80～90℃，并将混合体系Ⅰ加入到上述体系中，继续混合均匀后降温至20～30℃，得到琼脂糖包覆磁珠体系；其中，烃类溶剂、非离子表面活性剂和混合体系Ⅰ中四氧化三铁磁珠的用量比为200mL∶（8～10）g∶（18～24）mg；
S3、对琼脂糖包覆磁珠体系进行对甲苯磺酰基修饰，得到对甲基苯磺酰修饰的磁珠；
S4、将对甲苯磺酰修饰的磁珠修饰链霉亲和素，得到链霉亲和素琼脂糖磁珠。
在上述技术方案中，首先，采用了烃类溶剂，烃类溶剂一般为在反应条件下为液态的单链饱和烃类化合物，如正庚烷、正辛烷或更高碳链长度的液体石蜡等，或具有环状结构的饱和烃化合物，如环己烷等。上述烃类溶剂由于极性较低，且内部无极性基团，因此在制备过程中，琼脂糖和非离子表面活性剂的组分不易自身成团，而是会吸附在四氧化三铁磁珠的表面，形成均匀的包覆层。同时，在上述制备过程中，选用非离子表面活性剂，制备完毕后，即使有部分非离子表面活性剂吸附在磁珠的表面或残留于琼脂糖结构的内部空隙中，链霉亲和素琼脂糖磁珠整体也不会带有
在包覆层之外，出于纳米颗粒的表面效应，烃类分子会形成溶剂包覆层，由于整体并没有电荷，在后续通过磁吸分离时，烃类分子可以留存于纳米颗粒的缝隙之中，由于其分子链整体较为柔软，可以在纳米颗粒之间起到阻隔的作用，使得琼脂糖层不易粘结在一起，提高最终制得的链霉亲和素琼脂糖磁珠的分散性。同时，上述组分也可以吸附在琼脂糖的缝隙中，由于其分子链较为柔软，且极性较弱，因此形成的琼脂糖层中不易产生介孔，且烃类溶剂在琼脂糖内吸附后，不易脱除，因此也有助于减少琼脂糖本身的吸附性，进而使得制备得到的链霉亲和素琼脂糖磁珠本身对于杂质的吸附减少，有助于进一步提高上述链霉亲和素琼脂糖磁珠在运用于测定的准确度和灵敏度，减少假阴性和假阳性的现象发生。
可选的，在步骤S2中，将混合体系Ⅰ在5～10min内均匀加入到烃类溶剂和非离子表面活性剂的体系中，在加入过程中，保持200～300rpm的速度进行搅拌，滴加完毕后继续搅拌30～50min。
在上述方案中，将混合体系Ⅰ缓慢加入到烃类溶剂、明胶和非离子表面活性剂的混合体系中，并保持搅拌，整体结构更加均匀，磁珠和琼脂糖形成的混合体系Ⅰ在加入到上述体系中后，可以在表面活性剂的作用下形成更加均匀的球状结构，且在滴加过程中，控制较长的滴加时间更容易形成均匀的球形。
可选的，在步骤S2中，还加入明胶，明胶相较于烃类溶剂的加入量为0.04～0.05g/100mL。
在上述技术方案中，加入少量的明胶，可以使明胶极少量地填充在链霉亲和素琼脂糖磁珠的琼脂糖层中，一方面提高琼脂糖层的强度，使后续分离过程中，不易发生琼脂糖层的粘连，提高了链霉亲和素琼脂糖磁珠的分散性，另一方面也减少琼脂糖层对其他物质的吸附能力，降低链霉亲和素琼脂糖磁珠受杂质影响而生成的噪音。
可选的，在步骤S2中，还加入环氧化合物，所述环氧化合物相较于烃类溶剂的加入量为5～10mmol/L。
加入环氧化合物有助于提高琼脂糖内部的交联度，琼脂糖的交联度提高后，一方面琼脂糖层的强度提高，另一方面部分大分子体系更加不容易残留在琼脂糖层之中，进而进一步提高测定的准确度。
可选的，所述烃类溶剂为正辛烷和液体石蜡的组合，所述正辛烷和液体石蜡的体积比为（0.5～1）∶1。
单链烷烃具有更加柔软的分子结构，整体可以在琼脂糖层中，形成复杂的缠绕形态，可以更好地填充于琼脂糖层的内部，使得杂质分子（如蛋白质等）更难被琼脂糖层吸附。
上述技术方案中采用了正辛烷和液体石蜡的组合，其中液体石蜡为较高碳链的烷烃，二者在形成均匀体系的情况下，通过不同长度碳链的组合，可以实现溶剂化层的稳定性，同时也便于通过后续磁吸后将多余的溶剂洗脱，减少溶剂包覆于链霉亲和素磁珠的表面，使得磁珠可以更好地与链霉亲和素进行偶联。
可选的，四氧化三铁磁珠的具体制备方法如下：
将二价铁离子化合物和三价铁离子化合物溶解于水中，二价铁离子的浓度为0.22～0.26mol/L，加热至70～80℃，在保持150～200rpm搅拌的情况下，在5～10min内滴加氢氧化钠水溶液，氢氧化钠水溶液中氢氧化钠的总物质的量为二价铁离子的物质的量的1.6～2倍，滴加完毕后继续反应1～2h，随后按照加入非离子表面活性剂Ⅱ，继续反应1～2h，反应完毕后提纯得到四氧化三铁磁珠。
上述技术方案中，制备得到的四氧化三铁磁珠具有较好的均匀性，粒径较为平稳，最终制得的链霉亲和素磁珠在2000～3000nm范围内，不易团聚。
可选的，在步骤S3中，具体操作方法如下：
将步骤S2中制备得到的琼脂糖包覆磁珠体系分散于有机溶剂中，在碱性条件下，控制温度为0～5℃，混合均匀后，将对甲苯磺酰氯加入到上述体系中，并室温反应完成。
在上述过程中，对甲苯磺酰基可以均匀地修饰在磁珠的表面，同时有助于保持制备过程中琼脂糖包覆磁珠的均匀性和稳定性。
可选的，在步骤S3中，对甲苯磺酰氯在20～40min内加入到上述体系中，对甲苯磺酰氯与琼脂糖包覆磁珠体系中琼脂糖包覆磁珠的质量比为（5～8）∶1。
通过上述方案制备得到的链霉亲和素琼脂糖磁珠可以较好地吸附链霉亲和素，制备得到的链霉亲和素琼脂糖磁珠具有更好的灵敏度。
另外，本申请还涉及链霉亲和素琼脂糖磁珠，通过上述制备方法制备得到。
上述链霉亲和素琼脂糖磁珠在使用过程中，不易吸附体系中的蛋白质等杂质，有助于提高测定的灵敏度，减少假阴性或假阳性的现象发生。
本申请还涉及上述链霉亲和素琼脂糖磁珠的运用，可以运用于各类特异性抗原检测方法。
综上所述，本申请具备如下至少一种有益效果：
1.在本申请中，通过将琼脂糖水溶液和四氧化三铁磁珠先进行混合，再加入到表面活性剂和烃类溶剂的体系中，上述方法制得的链霉亲和素琼脂糖磁珠的琼脂糖孔隙中会填充有一定量的烃类溶剂，使得制备得到的链霉亲和素磁珠本身对于杂质的吸附性较弱，因此有助于提高测定的准确度。
2.在本申请中，烃类溶剂选用直链烷烃，并进一步选用正辛烷和液体石蜡的组合，使得制备得到的链霉亲和素磁珠更加均匀稳定，更不容易吸附蛋白质等杂质。
3.在本申请进一步设置中，通过添加明胶、环氧化合物体系，在琼脂糖结构内部可以形成更加完成的交联程度，减少琼脂糖层的孔隙率，进而进一步减少对蛋白质等杂质的吸附，提高体系的检测准确度。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
制备例1，四氧化三铁磁珠，其制备方法如下：
四口圆底烧瓶中，氮气保护下，5.0gFeCl2·4H2O和13.5gFeCl3·6H2O加入（换算为二价铁离子浓度为0.25mol/L，三价铁离子浓度0.5mol/L），再加入100mL纯化水，转速为200rpm的机械搅拌下，加热至80℃。向其中缓慢加入8mL5mol/L的NaOH（含NaOH 0.04mol）水溶液，保温搅拌1h，再慢加入2mL油酸（表面活性剂Ⅱ），保温搅拌1h，降至室温。用磁铁分离上层液体，用3×100mL无水乙醇洗涤黑色固体颗粒，再用5×100mL纯化水洗涤，得到四氧化三铁磁珠。
将所得到的磁珠加入纯化水定容至200mL，振荡均匀，取1mL磁珠于干燥箱中80℃干燥至恒重，称重为18.0mg。
制备例2，四氧化三铁磁珠，其制备方法如下：
四口圆底烧瓶中，氮气保护下，4.4gFeCl2·4H2O和11.9gFeCl3·6H2O加入（换算为二价铁离子浓度为0.22mol/L，三价铁离子浓度0.44mol/L），再加入100mL纯化水，转速为150rpm的机械搅拌下，加热至700℃。向其中缓慢加入7ml 5mol/L的NaOH水溶液，保温搅拌1h，再慢加入2mL油酸（表面活性剂Ⅱ），保温搅拌1h，降至室温。用磁铁分离上层液体，用3×100mL无水乙醇洗涤黑色固体颗粒，再用5×100mL纯化水洗涤，得到四氧化三铁磁珠。
将所得到的磁珠加入纯化水至200mL，振荡均匀，取1mL磁珠于干燥箱中80℃干燥至恒重，称重为17.7mg。
制备例3，四氧化三铁磁珠，其制备方法如下：
四口圆底烧瓶中，氮气保护下，5.2gFeCl2·4H2O和14.0gFeCl3·6H2O加入（换算为二价铁离子浓度为0.26mol/L，三价铁离子浓度0.52mol/L），再加入100mL纯化水，转速为200rpm的机械搅拌下，加热至80℃。向其中缓慢加入10.4mL5mol/L的NaOH水溶液，保温搅拌1h，再慢加入2mL油酸（表面活性剂Ⅱ），保温搅拌1h，降至室温。用磁铁分离上层液体，用3×100mL无水乙醇洗涤黑色固体颗粒，再用5×100mL纯化水洗涤，得到四氧化三铁磁珠。
将所得到的磁珠加入纯化水至200mL，振荡均匀，取1mL磁珠于干燥箱中80℃干燥至恒重，称重为18.2mg。
实施例1，链霉亲和素琼脂糖磁珠，其制备方法具体包括如下步骤：
S1、将900mg琼脂糖溶于30mL纯化水，加热煮沸使其完全溶解，然后加入10mL制备例1中制备的得到的四氧化三铁磁珠（水分散体系），以200rpm搅拌2min，得到混合体系Ⅰ，混合体系Ⅰ储存于室温下。
S2、四口圆底烧瓶中，将8.0gSpan80加入到120mL液体石蜡和80mL正辛烷中，转速为200rpm的机械搅拌下，加热至80℃。将混合体系Ⅰ通过恒压滴管慢滴入，滴加时间为5min，保温搅拌30min，降至室温。用磁铁分离上层液体，用2×30mL石油醚、3×30mL乙醇洗涤黑色固体颗粒，再用5×100mL纯化水洗涤，洗涤后加入纯化水定容至10mL，振荡均匀，得到琼脂糖包覆磁珠体系。取1mL琼脂糖包覆磁珠体系于干燥箱中80℃干燥至恒重，称重为15.1mg。
S3、单口圆底烧瓶中，加入8mL琼脂糖包裹的羟基磁珠，用磁铁分离上层液体，用2×20mL丙酮洗涤，磁力搅拌下，加入8mL丙酮和0.3mL质量分数为50%氢氧化钠水溶液，室温搅拌0.5h，降至0℃，600mg对甲苯磺酰氯分四次加入，每次间隔5min，加完升至室温搅拌1h。用磁铁分离上层液体，用4×30mL丙酮、4×30mL纯化水洗涤黑色固体颗粒，得到甲基苯磺酰修饰的磁珠。将对甲苯磺酰基修饰磁珠加入纯化水定容至10mL，振荡均匀，取1mL于干燥箱中80℃干燥至恒重，称重为9mg。
S4、称取0.1mg链霉亲和素溶于100mL0.1MpH为9.5的硼酸钠缓冲液中，配置得到链霉亲和素溶液。单口圆底烧瓶中，加入8mL对对甲苯磺酰基修饰磁珠（水分散体系），用磁铁分离上层液体，用3×20mL0.1MpH为9.5的硼酸钠缓冲液洗涤，加入5mL0.1MpH为9.5的硼酸钠缓冲液，磁力搅拌下，取上述链霉亲和素溶液2mL加入，室温搅拌15h。用磁铁分离上层液体，用3×20mL0.1M pＨ为7.4的PBS溶液（其中含有质量分数为0.1%的BSA）洗涤，再加入8mL0.1M pＨ为7.4的PBS溶液（其中含有质量分数为0.1%的BSA），室温搅拌1h。用磁铁分离上层液体，用3×20mL0.1M pＨ为7.4的PBS溶液（其中含有质量分数为0.1%的BSA）洗涤，得到链霉亲和素琼脂糖磁珠。
将所得到的链霉亲和素琼脂糖磁珠加入0.1M pＨ为7.4的PBS溶液（其中含有质量分数为0.1%的BSA）至10mL，振荡均匀，取1mL磁珠于干燥箱中80℃干燥至恒重，称重为6mg。其余链霉亲和素磁珠保存在4℃冰箱中，待用。
实施例2，链霉亲和素琼脂糖磁珠，其制备方法具体包括如下步骤：
S1、将1425mg琼脂糖溶于20mL纯化水，加热煮沸使其完全溶解，然后加入13.2mL制备例1中制备的得到的四氧化三铁磁珠（水分散体系），以200rpm搅拌2min，得到混合体系Ⅰ，混合体系Ⅰ储存于室温下。
S2、四口圆底烧瓶中，将10.0gSpan80加入到120mL液体石蜡和80mL正辛烷中，转速为200rpm的机械搅拌下，加热至90℃。将混合体系Ⅰ通过恒压滴管慢滴入，滴加时间为10min，保温搅拌50min，降至室温。用磁铁分离上层液体，用2×30mL石油醚、3×30mL乙醇洗涤黑色固体颗粒，再用5×100mL纯化水洗涤，洗涤后加入纯化水定容至10mL，振荡均匀，得到琼脂糖包覆磁珠体系。取1mL琼脂糖包覆磁珠体系于干燥箱中80℃干燥至恒重，称重为15.1mg。
S3、单口圆底烧瓶中，加入8mL琼脂糖包裹的羟基磁珠，用磁铁分离上层液体，用2×20mL丙酮洗涤，磁力搅拌下，加入8mL丙酮和0.3mL质量分数为50%氢氧化钠水溶液，室温搅拌0.5h，降至5℃，960mg对甲苯磺酰氯分八次加入，每次间隔5min，加完升至室温搅拌1h。用磁铁分离上层液体，用4×30mL丙酮、4×30mL纯化水洗涤黑色固体颗粒，得到甲基苯磺酰修饰的磁珠。将对甲苯磺酰基修饰磁珠加入纯化水定容至10mL，振荡均匀，取1mL于干燥箱中80℃干燥至恒重，称重为9.3mg。
S4、称取0.1mg链霉亲和素溶于100mL0.1MpH为9.5的硼酸钠缓冲液中，配置得到链霉亲和素溶液。单口圆底烧瓶中，加入8mL对对甲苯磺酰基修饰磁珠（水分散体系），用磁铁分离上层液体，用3×20mL0.1MpH为9.5的硼酸钠缓冲液洗涤，加入5mL0.1MpH为9.5的硼酸钠缓冲液，磁力搅拌下，取上述链霉亲和素溶液2mL加入，室温搅拌15h。用磁铁分离上层液体，用3×20mL0.1M pＨ为7.4的PBS溶液（其中含有质量分数为0.1%的BSA）洗涤，再加入8mL0.1M pＨ为7.4的PBS溶液（其中含有质量分数为0.1%的BSA），室温搅拌1h。用磁铁分离上层液体，用3×20mL0.1M pＨ为7.4的PBS溶液（其中含有质量分数为0.1%的BSA）洗涤，得到链霉亲和素琼脂糖磁珠。
将所得到的链霉亲和素琼脂糖磁珠加入0.1M pＨ为7.4的PBS溶液（其中含有质量分数为0.1%的BSA）至10mL，振荡均匀，取1mL磁珠于干燥箱中80℃干燥至恒重，称重为6mg。其余链霉亲和素磁珠保存在4℃冰箱中，待用。
实施例3，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，在步骤S1中，加入的四氧化三铁磁珠为制备例2中的四氧化三铁磁珠，四氧化三铁磁珠的净重量保持不变，体积按比例折合计算为10.2mL。
实施例4，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，在步骤S1中，加入的四氧化三铁磁珠为制备例3中的磁珠，四氧化三铁磁珠的净重量保持不变，体积按比例折合计算为9.9mL。
实施例5，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，对烃类溶剂进行替换，用体积的环己烷替代正辛烷。
实施例6，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，对烃类溶剂进行替换，用等体积的正辛烷替代液体石蜡。
实施例7，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，在步骤S2中，烃类溶剂替换为67mL正辛醇和133mL液体石蜡。
实施例8，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，在步骤S2中，烃类溶剂替换为100mL正辛醇和100mL液体石蜡。
实施例9，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，在步骤S2中，还加入了80mg明胶。
实施例10，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，在步骤S2中，还加入了100mg明胶。
实施例11，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例9的区别在于，在步骤S2中，还加入了58mg环氧丙烷。
实施例12，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例9的区别在于，在步骤S2中，还加入了116mg环氧丙烷。
实施例13，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，步骤S2中，直接将混合体系Ⅰ、和非离子表面活性剂直接加入到烃类溶剂中，随后以200rpm的速率搅拌30min。
针对上述实施例，设置对比例如下：
对比例1，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，烃类溶剂等体积地替换为乙醇。
对比例2，链霉亲和素琼脂糖磁珠，与实施例1的区别在于，烃类溶剂等体积地替换为DMSO。
对上述链霉亲和素琼脂糖磁珠，将其分散于0.1M pH为7.4的PBS溶液中，并通过SEM进行观测。
实施例14，实施例1中链霉亲和素琼脂糖磁珠的运用，将其运用于总前列腺特异性抗原检测试剂盒，具体如下：
将实施例1中的用磁珠稀释液（0.01M 磷酸盐缓冲液（pH=7.4±0.2）+0.5%BSA+0.15%Casein Na++0.1%海藻糖+0.2%Proclin 300）稀释至1.45mg/mL，配成磁珠工作液。
往反应杯中加入20μL样本、100μL生物素标记的tPSA抗体溶液、100μL吖啶酯标记的tPSA抗体溶液，在37℃下孵育10min，获得反应混合液；
向反应混合液中加入20μL磁珠工作液，在37℃下孵育6min；随后在磁场的作用下，将磁珠吸附到反应杯的内壁上，除去反应杯内的溶液；
往反应杯中加入清洗液重悬磁珠，然后再在磁场的作用下，将磁珠吸附到反应杯的内壁上，除去反应杯内的溶液，利用清洗液重复洗涤磁珠3次，除去未结合的反应物质；
其中，清洗液为0.02M Tris-HCl缓冲溶液，并向其中添加浓度为NaCl和Tween-20,其中，NaCl的浓度为0.15M，Tween-20的质量分数为1%。配置完毕后，清洗液的pH为7.4。
加入激发液A和激发液B，然后检测发光值（RLU）。
其中，激发液A为0.1M 硝酸和0.25%过氧化氢的水溶液，激发液B为含有0.25M 氢氧化钠和0.5mt% TritonX-100的水溶液。
其中，样本为不同浓度的总前列腺特异性抗原标准品，其中每个浓度平行检测两次，求其平均发光值，
以实施例14为例，得到的具体数据如表1所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
通过上述数据绘制标准曲线，以Log（Conc）为纵轴，以Log(RLU)为横轴，以线性回归后得到的公式如下
y=1.0056x+4.5225
R2=0.9997
上述结果证明，采用实施例14中的试剂盒进行测定，具有较好的线性拟合效果。
实验2、对用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值（相对发光值），计算其平均值（M）和标准差（SD），得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。结果显示最低检测限小于0.1ng/mL，符合该产品的技术要求。以实施例14为例，具体检测结果如表2所示。
Figure 474896DEST_PATH_IMAGE002
实施例15～26，分别为实施例2～13中链霉亲和素琼脂糖磁珠的运用，与实施例14的区别在于，分别选用了实施例2～13中的链霉亲和素琼脂糖磁珠配置磁珠工作液。
对比例3～4，分别为对比例1～2中链霉亲和素琼脂糖磁珠的运用，与实施例14的区别在于，分别选用了对比例1～2中的链霉亲和素琼脂糖磁珠配置磁珠工作液。
实施例14～26中，进行线性检测和最低检出限检测，得到结果如表3所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
通过上述实验数据可知，实施例1～13中的链霉亲和素琼脂糖磁珠，在运用于总前列腺特异性抗原检测试剂盒时，均具有较好的灵敏度和线性回归特性。
另外，对实施例14～26和对比例3～4中的试剂盒进行如下实验，已验证其对于抗干扰能力进行验证，具体如下。
对每个实施例，分别配置空白样本和1ng/mL浓度的样本，标记为样本1和样本2，同时在样本1和样本2中分别以10ng/mLBSA，分别标记为样本3和样本4，对每个样本测定5次，取平均值，计算样本3发光值/样本1发光值的数值和样本4发光值/样本2发光值的数值，得到结果如表4所示。
Figure 297096DEST_PATH_IMAGE004
通过上述实验数据可知，采用醇类溶剂和DMSO（典型的高沸点非质子溶剂）进行反应，在结果上均体现出了不良的抗干扰效果，使得制备得到的链霉亲和素琼脂糖磁珠容易被小鼠血清中的各种蛋白质所干扰，导致背景发光偏高。
在选用烃类溶剂的诸多实施例中，实施例1和实施例5～6进行对比，采用了正辛烷和液体石蜡的组合，取得了更好的实验效果。正辛烷、液体石蜡可以有效提高制备得到的磁珠对于部分有影响的杂质的抵抗能力，使得在样本未经初步预处理的情况下，依旧可以保持较好的灵敏度。
在实施例9～12中，还加入了明胶和环氧化合物，有助于进一步提高链霉亲和素琼脂糖磁珠的抗干扰能力，对于测定结果的灵敏度和准确度均有明显的提升。尤其是在接近检出限的位置，有更加明显的提升效果。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.链霉亲和素琼脂糖磁珠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、配置琼脂糖的水溶液，并将四氧化三铁磁珠加入到琼脂糖的水溶液中，充分混合至均匀，得到混合体系Ⅰ，其中，琼脂糖和四氧化三铁的质量比（5～6）∶1；
S2、向烃类溶剂中，加入非离子表面活性剂Ⅰ，混合均匀后，加热至80～90℃，并将混合体系Ⅰ加入到上述体系中，继续混合均匀后降温至20～30℃，得到琼脂糖包覆磁珠体系；其中，烃类溶剂、非离子表面活性剂和混合体系Ⅰ中四氧化三铁磁珠的用量比为200mL∶（8～10）g∶（18～24）mg；
S3、对琼脂糖包覆磁珠体系进行对甲苯磺酰基修饰，得到对甲基苯磺酰修饰的磁珠；
S4、将对甲苯磺酰修饰的磁珠修饰链霉亲和素，得到链霉亲和素琼脂糖磁珠。
2.根据权利要求1所述的链霉亲和素琼脂糖磁珠的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，将混合体系Ⅰ在5～10min内均匀加入到烃类溶剂和非离子表面活性剂的体系中，在加入过程中，保持200～300rpm的速度进行搅拌，滴加完毕后继续搅拌30～50min。
3.根据权利要求2所述的链霉亲和素琼脂糖磁珠的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，还加入明胶，明胶相较于烃类溶剂的加入量为0.04～0.05g/100mL。
4.根据权利要求3所述的链霉亲和素琼脂糖磁珠的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，还加入环氧化合物，所述环氧化合物相较于烃类溶剂的加入量为5～10mmol/L。
5.根据权利要求1所述的链霉亲和素琼脂糖磁珠的制备方法，其特征在于，所述烃类溶剂为正辛烷和液体石蜡的组合，所述正辛烷和液体石蜡的体积比为（0.5～1）∶1。
6.根据权利要求1所述的链霉亲和素琼脂糖磁珠的制备方法，其特征在于，四氧化三铁磁珠的具体制备方法如下：
将二价铁离子化合物和三价铁离子化合物溶解于水中，二价铁离子的浓度为0.22～0.26mol/L，加热至70～80℃，在保持150～200rpm搅拌的情况下，在5～10min内滴加氢氧化钠水溶液，氢氧化钠水溶液中氢氧化钠的总物质的量为二价铁离子的物质的量的1.6～2倍，滴加完毕后继续反应1～2h，随后按照加入非离子表面活性剂Ⅱ，继续反应1～2h，反应完毕后提纯得到四氧化三铁磁珠。
7.根据权利要求1所述的链霉亲和素琼脂糖磁珠的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，具体操作方法如下：
将步骤S2中制备得到的琼脂糖包覆磁珠体系分散于有机溶剂中，在碱性条件下，控制温度为0～5℃，混合均匀后，将对甲苯磺酰氯加入到上述体系中，并室温反应完成。
8.根据权利要求7所述的链霉亲和素琼脂糖磁珠的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，对甲苯磺酰氯在20～40min内加入到上述体系中，对甲苯磺酰氯与琼脂糖包覆磁珠体系中琼脂糖包覆磁珠的质量比为（5～8）∶1。
9.链霉亲和素琼脂糖磁珠，其特征在于，通过如权利要求1～9中任意一项所述的链霉亲和素琼脂糖磁珠的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的链霉亲和素琼脂糖磁珠的运用，其特征在于，运用于特异性抗原检测方法。
CN202210621242.7A 2022-06-02 2022-06-02 链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法和运用 Active CN114950375B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210621242.7A CN114950375B (zh) 2022-06-02 2022-06-02 链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法和运用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210621242.7A CN114950375B (zh) 2022-06-02 2022-06-02 链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法和运用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114950375A true CN114950375A (zh) 2022-08-30
CN114950375B CN114950375B (zh) 2024-04-30

Family

ID=82960492

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210621242.7A Active CN114950375B (zh) 2022-06-02 2022-06-02 链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法和运用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114950375B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115356477A (zh) * 2022-10-20 2022-11-18 苏州纳微生命科技有限公司 一种链霉亲和素磁珠及其制备方法和应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19800294A1 (de) * 1998-01-07 1999-07-08 Mueller Schulte Detlef Dr Induktiv aufheizbare magnetische Polymerpartikel sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben
CN1476908A (zh) * 2003-07-15 2004-02-25 南开大学 球形氨基酸吸附剂及其制备方法
US20130011862A1 (en) * 2008-09-26 2013-01-10 Biotica, Bioquimica Analitica, S.L. Rapid process for detection of microorganisms with magnetic particles
CN103980519A (zh) * 2014-05-27 2014-08-13 哈尔滨工业大学 一种磁性琼脂糖微球的制备方法
CN105536725A (zh) * 2016-01-20 2016-05-04 苏州英芮诚生化科技有限公司 高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法
WO2018000381A2 (zh) * 2016-06-30 2018-01-04 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 改性心磷脂包被的纳米磁珠及其制备方法
CN110146692A (zh) * 2019-05-28 2019-08-20 迪瑞医疗科技股份有限公司 一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系及检测试剂盒
CN110240704A (zh) * 2019-05-28 2019-09-17 西安交通大学 基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用
CN112191231A (zh) * 2020-09-25 2021-01-08 深圳市圳力液体分离科技有限公司 水凝胶包覆吸附剂材料及制备方法和应用
CN113181883A (zh) * 2021-05-08 2021-07-30 苏州英芮诚生化科技有限公司 一种小粒径琼脂糖羧基磁珠及其制备方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19800294A1 (de) * 1998-01-07 1999-07-08 Mueller Schulte Detlef Dr Induktiv aufheizbare magnetische Polymerpartikel sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben
CN1476908A (zh) * 2003-07-15 2004-02-25 南开大学 球形氨基酸吸附剂及其制备方法
US20130011862A1 (en) * 2008-09-26 2013-01-10 Biotica, Bioquimica Analitica, S.L. Rapid process for detection of microorganisms with magnetic particles
CN103980519A (zh) * 2014-05-27 2014-08-13 哈尔滨工业大学 一种磁性琼脂糖微球的制备方法
CN105536725A (zh) * 2016-01-20 2016-05-04 苏州英芮诚生化科技有限公司 高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法
WO2018000381A2 (zh) * 2016-06-30 2018-01-04 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 改性心磷脂包被的纳米磁珠及其制备方法
CN110146692A (zh) * 2019-05-28 2019-08-20 迪瑞医疗科技股份有限公司 一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系及检测试剂盒
CN110240704A (zh) * 2019-05-28 2019-09-17 西安交通大学 基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用
CN112191231A (zh) * 2020-09-25 2021-01-08 深圳市圳力液体分离科技有限公司 水凝胶包覆吸附剂材料及制备方法和应用
CN113181883A (zh) * 2021-05-08 2021-07-30 苏州英芮诚生化科技有限公司 一种小粒径琼脂糖羧基磁珠及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RYOICHI ISHIMATSU ET AL.: ""Enzyme-linked immunosorbent assay based on light absorption of enzymatically generated aniline oligomer: Flow injection analysis for 3-phenoxybenzoic acid with anti-3-phenoxybenzoic acid monoclonal antibody"", 《TALANTA》, vol. 218, pages 121102 *
杨楠: ""磁性高分子微球的制备、表征及应用研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, no. 6, pages 079 - 32 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115356477A (zh) * 2022-10-20 2022-11-18 苏州纳微生命科技有限公司 一种链霉亲和素磁珠及其制备方法和应用
CN115356477B (zh) * 2022-10-20 2023-02-10 苏州纳微生命科技有限公司 一种链霉亲和素磁珠及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114950375B (zh) 2024-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Salimi et al. Highly selective magnetic affinity purification of histidine-tagged proteins by Ni 2+ carrying monodisperse composite microspheres
CN109261128B (zh) 一种硼酸型磁性COFs材料、制备方法及其应用
Huang et al. Ionic liquid-coated Fe 3 O 4/APTES/graphene oxide nanocomposites: Synthesis, characterization and evaluation in protein extraction processes
CN110961085B (zh) 一种利用co2为乳液模板制备偕胺肟功能化中空多孔聚合物微球的方法
Capriotti et al. New Ti-IMAC magnetic polymeric nanoparticles for phosphopeptide enrichment from complex real samples
US11458448B2 (en) Magnetic strong base anion exchange resin with high mechanical strength, and preparation method thereof
CN114950375A (zh) 链霉亲和素琼脂糖磁珠及其制备方法和运用
Xu et al. Simultaneous adsorption of Li (I) and Rb (I) by dual crown ethers modified magnetic ion imprinting polymers
Wang et al. Novel core–shell Cerium (IV)-immobilized magnetic polymeric microspheres for selective enrichment and rapid separation of phosphopeptides
CN106916301A (zh) 高载铁量聚多巴胺纳米粒子的制备方法
Wu et al. Cationic β-cyclodextrin-modified hybrid magnetic microspheres as chiral selectors for selective chiral absorption of dansyl amino acids
Zhou et al. Magnetic nanoparticles for the affinity adsorption of maltose binding protein (MBP) fusion enzymes
Gao et al. Engineering a MOF–magnetic graphene oxide nanocomposite for enantioselective capture
Jiang et al. The fabrication of a thiol-modified chitosan magnetic graphene oxide nanocomposite and its adsorption performance towards the illegal drug clenbuterol in pork samples
Egunova et al. Magnetic solid-phase extraction and fluorimetric determination of some fluoroquinolones
CN111040472B (zh) 改性纳米二氧化硅及其改性方法、防腐涂料和涂层
Li et al. Amphiphilic silica nanoparticles as pseudostationary phase for capillary electrophoresis separation
Huang et al. Enantioselective absorption of enantiomers with maleic anhydride-β-cyclodextrin modified magnetic microspheres
Jiang et al. Glycocyamine functionalized magnetic layered double hydroxides with multiple affinity sites for trace phosphopeptides enrichment
Li et al. Facile synthesis of ionic liquid functionalized silica-capped CdTe quantum dots for selective recognition and detection of hemoproteins
KR20060061494A (ko) 핵산(ｄｎａ/ｒｎａ) 분리정제용 기능성 실리카자성나노입자 및 그 제조방법
Zhou et al. Novel Cu2+-based immobilized metal affinity magnetic nanoparticles for fast magnetic solid-phase extraction of trace Sudan dyes in food samples
Meng et al. The use of aggregation-induced emission probe doped silica nanoparticles for the immunoassay of human epididymis protein 4
Yıldırım et al. Synthesis and characterization of amino functional poly (acrylamide) coated Fe3O4 nanoparticles and investigation of their potential usage in DNA isolation
CN116440874A (zh) 一种基于核酸适配体功能化磁性疏水聚合物的交链孢酚吸附剂及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant