CN113181883A - 一种小粒径琼脂糖羧基磁珠及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于磁性材料合成技术领域，以四氧化三铁粉末为原料，制作小粒径的琼脂糖磁珠，并通过环氧基交联反应和羧基化反应制得琼脂糖羧基磁珠，该磁珠粒径小，比表面积大，磁珠表面羧基基团载量更多。本发明所制备的磁珠在蛋白提取和蛋白纯化过程中具有广泛的经济价值。本发明所采用的制备方法在常温常压下实现，不需要大型压力设备，制备过程有机试剂的使用量和废弃物量比现有工艺少，所产生的经济效益更为突出。

Description

一种小粒径琼脂糖羧基磁珠及其制备方法
技术领域
本发明属于磁性材料合成技术领域，具体涉及一种小粒径琼脂糖羧基磁珠及其制备方法、应用。
背景技术
磁珠是一种包被有生物活性基团的功能化载体，可分散于基液中形成磁性液体材料，生物活性基团可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点。磁珠在外磁场的作用下可以定向移动和集中，撤去外磁场后，又可以恢复原来的结构与状态，从而使复杂的液固分离技术变得快捷简便。通过简单的洗脱即可得到纯度很高的靶向物质。
现有技术中使用的大多为25um及以上粒径的磁珠作为基体，进一步修饰环氧基团以及最终制备成大粒径羧基琼脂糖磁珠。
而球体粒径越大，同等质量的磁珠，其比表面积越小，表面可以修饰的基团也比小体积磁珠的少，最终也影响了材料的蛋白吸附速率和效果。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种小粒径琼脂糖羧基磁珠及其制备方法，该琼脂糖羧基磁珠粒径小，粒径在5-20um之间，比表面积大、表面基团装载量大、蛋白吸附速率和效果更佳，具有广泛的经济价值和推广意义。
本发明的第一目的是提供一种小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：
制备有机相：
在搅拌状态下，将Span-80溶解至液体石蜡中加热制备有机相；
制备水相:
配制琼脂糖水溶液，并在搅拌加热状态下加入四氧化三铁悬浊液，制备水相；
制备小粒径琼脂糖磁珠：
在搅拌状态下，将水相滴加入有机相中，其中，所述搅拌状态下的搅拌速度为500-600rpm，所述滴加时的滴加速度为3-5滴/s，所述有机相的温度为 80-85℃；
滴加完成后继续反应，之后自然降温，最后冰浴降温，制得小粒径琼脂糖磁珠。
环氧基交联反应：
将清洗后的所述的小粒径琼脂糖磁珠加入蒸馏水中，并加入氨水及氢氧化钠溶液，搅拌，然后向所述氨水及氢氧化钠溶液中加入环氧氯丙烷和DMSO 的混合溶液，设定反应条件并开始反应，反应结束后清洗制得富集有环氧基的小粒径琼脂糖环氧磁珠。
羧基化反应：
将对氨基苯磺酸溶解至碳酸钠水溶液中，调节pH值至10～11，之后加入 Magroes-4FF及所述的富集有环氧基的小粒径琼脂糖环氧磁珠，设定反应条件，反应结束后清洗干燥制得表面富集有羧基的小粒径琼脂糖羧基磁珠。
优选的，所述制备有机相中搅拌状态的速度为300-400rpm，Span-80和液体石蜡的质量体积比为1.0-1.5：11.0-12.0，制得的有机相的温度为80℃。
优选的，所述制备水相中搅拌加热状态的条件为搅拌速度为300rpm，搅拌时间为2h，搅拌温度为90℃。
优选的，所述制备水相中琼脂糖水溶液的质量百分比为0.07-1％，所述四氧化三铁悬浊液的溶质为四氧化三铁粉末，溶剂为吐温20水溶液，其中，四氧化三铁粉末和蒸馏水的质量体积比1：20，所述吐温20在蒸馏水中的体积分数为0.5‰。
优选的，所述制备小粒径琼脂糖磁珠中滴加完成后反应的条件为搅拌控温，其中，所述搅拌速度为800rpm，控温温度为85℃，反应时间为1h；自然降温时控制搅拌速度为250rpm，自然降温后的温度为40℃，所述冰浴降温后的温度为15℃。
优选的，所述环氧基交联中蒸馏水的体积为100mL；所述搅拌的搅拌速度为250rpm，搅拌时间为30min。
优选的，所述环氧基交联反应中氢氧化钠溶液的物质的量浓度为1M，小粒径琼脂糖磁珠和氨水的质量比为1:0.2，氨水和氢氧化钠溶液的体积比为1:1；环氧氯丙烷和DMSO的混合溶液中环氧氯丙烷和DMSO的体积比为2:5。
优选的，所述环氧基交联反应及羧基化反应的反应条件为反应温度为 40℃，反应时间为12-24h，反应搅拌速度为250rpm。
优选的，所述羧基化反应中碳酸钠水溶液的物质的量浓度为0.25M，对氨基苯磺酸和碳酸钠水溶液的质量体积比为1:200，所述溶解的方式为超声溶解，所述碳酸钠水溶液和Magroes-4FF的体积比为20:1。
本发明的另一目的是公开一种如上所述的小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法所制得的小粒径琼脂糖羧基磁珠，其特征在于，所述小粒径琼脂糖羧基磁珠的外表面接枝有大量的羧基。所述的小粒径琼脂糖羧基磁珠应用于蛋白提取和蛋白纯化。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明所采用的制备方法在常温常压下实现，不需要大型压力设备，制备过程有机试剂的使用量和废弃物量比现有工艺少。
2.本方法制备的琼脂糖羧基磁珠，粒径小，为5～20μm，比表面积大，磁珠表面羧基基团载量更多，所制备的磁珠吸附蛋白载量高，能广泛应用在蛋白纯化和蛋白提取上，提取效率高，所产生的经济效益更为突出。
附图说明
本上述说明仅是本发明方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
图1为小粒径琼脂糖羧基磁珠100倍电镜图。
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：
S11制备有机相:
称取30g Span-80，用350mL液体石蜡将其溶解并全部转移至三口瓶中，机械搅拌均匀，搅拌速度为300rpm，加热使瓶内温度80℃，制得有机相；
S12制备水相：
称取400mg琼脂糖投入到烧瓶中，并加入60mL蒸馏水，机械搅拌速度为300rpm，加热烧瓶至90℃，制得琼脂糖溶液；
另称取1g四氧化三铁粉末，加入20mL蒸馏水和10uL吐温20，匀速搅拌10min，混合均匀后将其转入到上述琼脂糖溶液中，并继续加热搅拌2h，制得水相：琼脂糖混合液；
S13制备小粒径琼脂糖磁珠：
将有机相搅拌速度调整为500rpm，用分液漏斗将上述琼脂糖混合液滴加入有机相中，滴加速度为4滴/s，并保持三口瓶内温度在80℃，滴加完毕后调整搅拌速度为800rpm，三口瓶内温度保持80℃下持续搅拌1h，自然降温，调节搅拌转速至250rpm，当三口瓶内部温度下降至40℃时，使用冰浴降温至15℃，制得粒径为小粒径琼脂糖磁珠；
S14环氧基交联反应:
量取10mL步骤S13中制得的小粒径琼脂糖磁珠，依次用无水乙醇和去离子水分别清洗3次，蒸馏水定容至100mL并转移到烧瓶中，加入2mL氨水、2mL 1M氢氧化钠溶液，搅拌30min，向烧瓶中加入200mL环氧氯丙烷和500mL DMSO的混合溶液，设定反应温度为40℃、反应时间为12h，反应结束后，依次用无水乙醇和去离子水分别清洗3次，制得表面富集有环氧基的小粒径琼脂糖环氧磁珠；
S15羧基化反应:
量取400mL 0.25M碳酸钠水溶液和2g对氨基苯磺酸，超声溶解，调节 pH值至11后加入20mL Magroes-4FF，混合均匀后加入步骤S2中得到的有环氧基的小粒径琼脂糖环氧磁珠，设定反应温度为40℃、反应时间为12h，反应结束后，用300mL去离子水清洗3次，干燥后得到表面富集有羧基的小粒径琼脂糖羧基磁珠。
实施例2
一种小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：
S21制备有机相:
称取30g Span-80，用350mL液体石蜡将其溶解并全部转移至三口瓶中，机械搅拌均匀，搅拌速度为300rpm，加热使瓶内温度80℃，制得有机相；
S22制备水相:
称取800mg琼脂糖投入到烧瓶中，并加入60mL蒸馏水，机械搅拌速度为300rpm，加热烧瓶至90℃，制得琼脂糖溶液；
另称取1g四氧化三铁粉末，加入20mL蒸馏水和10uL吐温20，匀速搅拌10min，混合均匀后将其转入到上述琼脂糖溶液中，并继续加热搅拌2h，制得水相：琼脂糖混合液；
S23制备小粒径琼脂糖磁珠：
将有机相搅拌速度调整为500rpm，用分液漏斗将上述琼脂糖混合液滴加入有机相中，滴加速度为3滴/s，并保持三口瓶内温度在85℃，滴加完毕后调整搅拌速度为800rpm，三口瓶内温度保持85℃下持续搅拌1h，自然降温，调节搅拌转速至250rpm，当三口瓶内部温度下降至40℃时，使用冰浴降温至 15℃，制得粒径为小粒径琼脂糖磁珠；
S24环氧基交联反应:
量取10mL步骤S23中制得的小粒径琼脂糖磁珠，依次用无水乙醇和去离子水分别清洗3次，蒸馏水定容至100mL并转移到烧瓶中，加入2mL氨水、2mL 1M氢氧化钠溶液，搅拌30min，向烧瓶中加入200mL环氧氯丙烷和500mL DMSO的混合溶液，设定反应温度为40℃、反应时间为12h，反应结束后，依次用无水乙醇和去离子水分别清洗3次，制得表面富集有环氧基的小粒径琼脂糖环氧磁珠；
S25羧基化反应:
量取400mL 0.25M碳酸钠水溶液和2g对氨基苯磺酸，超声溶解，调节 pH值至10后加入20mL Magroes-4FF，混合均匀后加入步骤S2中得到的有环氧基的小粒径琼脂糖环氧磁珠，设定反应温度为40℃、反应时间为24h，反应结束后，用300mL去离子水清洗3次，干燥后得到表面富集有羧基的小粒径琼脂糖羧基磁珠。
实施例3
一种小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：
S31制备有机相:
称取30g Span-80，用350mL液体石蜡将其溶解并全部转移至三口瓶中，机械搅拌均匀，搅拌速度为300rpm，加热使瓶内温度80℃，制得有机相；
S32制备水相：
称取2400mg琼脂糖投入到烧瓶中，并加入60mL蒸馏水，机械搅拌速度为300rpm，加热烧瓶至90℃，制得琼脂糖溶液；
另称取1g四氧化三铁粉末，加入20mL蒸馏水和10uL吐温20，匀速搅拌10min，混合均匀后将其转入到上述琼脂糖溶液中，并继续加热搅拌2h，制得水相：琼脂糖混合液；
S33制备小粒径琼脂糖磁珠：
将有机相搅拌速度调整为500rpm，用分液漏斗将上述琼脂糖混合液滴加入有机相中，滴加速度为5滴/s，并保持三口瓶内温度在85℃，滴加完毕后调整搅拌速度为800rpm，三口瓶内温度保持85℃下持续搅拌1h，自然降温，调节搅拌转速至250rpm，当三口瓶内部温度下降至40℃时，使用冰浴降温至 15℃，制得粒径为小粒径琼脂糖磁珠；
S34环氧基交联反应:
量取10mL步骤S33中制得的小粒径琼脂糖磁珠，依次用无水乙醇和去离子水分别清洗3次，蒸馏水定容至100mL并转移到烧瓶中，加入2mL氨水、2mL 1M氢氧化钠溶液，搅拌30min，向烧瓶中加入200mL环氧氯丙烷和500mL DMSO的混合溶液，设定反应温度为40℃、反应时间为18h，反应结束后，依次用无水乙醇和去离子水分别清洗3次，制得表面富集有环氧基的小粒径琼脂糖环氧磁珠；
S35羧基化反应:
量取600mL 0.25M碳酸钠水溶液和3g对氨基苯磺酸，超声溶解，调节 pH值至11后加入30mL Magroes-4FF，混合均匀后加入步骤S2中得到的有环氧基的小粒径琼脂糖环氧磁珠，设定反应温度为40℃、反应时间为24h，反应结束后，用300mL去离子水清洗3次，干燥后得到表面富集有羧基的小粒径琼脂糖羧基磁珠。
为证明本发明所公开的小粒径琼脂糖羧基磁珠的表面富集有羧基，采用如下所述的测试方法测试。
测试方法：
羧基的定量：根据Boehm滴定法，在电子分析天平上平行称取3份磁性材料样品，每份约0.2g，真实重量为W(g)，分别置于三个300ml的锥形瓶中做平行试验。加入体积V3(约100ml)浓度为M1的NaHCO3溶液，在机械搅拌器上搅拌反应20小时。锥形瓶口用滤纸密封确保反应生成的CO2气体顺利排出。然后用吸铁石将磁性材料与上清液分离，取体积为V2的上清液于50ml 锥形瓶中，滴入3滴石蕊指示剂，搅拌均匀，用标准浓度的盐酸溶液滴定。滴定操作时用手摇晃上清液，用pH计测量溶液的pH值变化，指示滴定终点，同时观察石蕊指示剂的颜色变化(紫色变为红色)。每次记录pH计读数时等 pH值稳定在1分钟内的变化小于0.01pH。到达滴定终点时消耗标准浓度盐酸的体积为V1(ml)。
羧基百分含量的计算
NaHCO3溶液浓度M1(摩尔浓度)的计算
M1＝M0×V0/20
上清液中NaHCO3浓度M2(摩尔浓度)的计算
M2＝M0×V1/V2
磁性材料表面的羧基百分含量：
P-COOH＝(M1-M2)×V3/W
＝(M0×V0/20-M0×V1/V2)×V3/W
＝M0×(V0/20-V1/V2)×V3/W(mol/g)
表一小粒径琼脂糖羧基磁珠表面羧基含量检测结果
Figure BDA0003055857330000091
本测试方法测试了两批不同批次的如上实施例所述制备的小粒径琼脂糖羧基磁珠的表面羧基含量。如表一结果所示，材料表面富集有丰富的羧基基团，无多余环氧基团裸露，且本工艺富集的羧基数值高、稳定性好。
本发明采用高温油相法，以四氧化三铁粉末为原料，以滴加的方式，通过控制合适的搅拌速度和滴加速度，避免了瞬间爆炸式成核，制备出了小粒径琼脂糖磁珠，如附图1所示，其粒径为5～20μm，所制备的小粒径琼脂糖磁珠尺寸分布均匀，内部缺陷少。
而且，本发明通过在弱碱性条件下，选择带有氨基的且能通过反应后最终表现为羧基形式的单体试剂氨基苯磺酸，其所带的氨基与S4中得到的磁珠表面的环氧基进行结合，反应结束后表面为羧基，最终修饰成了小粒径琼脂糖羧基磁珠，该磁珠粒径小，比表面积大，羧基基团载量更多；所制备的磁珠由于其表面存在大量羧基，其能够吸附蛋白载量高，能广泛应用在蛋白纯化和蛋白提取上，提取效率高，具有广泛的经济效益。
此外，本发明所采用的制备方法在常温常压下就能实现，不需要大型压力设备，制备过程有机试剂的使用量和废弃物量比现有工艺更少，更加环保。
以上，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书所示和以上而顺畅地实施本发明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备有机相：
在搅拌状态下，将Span-80溶解至液体石蜡中加热制备有机相；
制备水相：
配制琼脂糖水溶液，并在搅拌加热状态下加入四氧化三铁悬浊液，制备水相；
制备小粒径琼脂糖磁珠：
在搅拌状态下，将水相滴加入有机相中，其中，所述搅拌状态下的搅拌速度为500-600rpm，所述滴加时的滴加速度为3-5滴/s，所述有机相的温度为80-85℃；
滴加完成后继续反应，之后自然降温，最后冰浴降温，制得小粒径琼脂糖磁珠；
环氧基交联反应：
将清洗后的所述的小粒径琼脂糖磁珠加入蒸馏水中，并加入氨水及氢氧化钠溶液，搅拌，然后向所述氨水及氢氧化钠溶液中加入环氧氯丙烷和DMSO的混合溶液，并开始反应，反应结束后清洗制得富集有环氧基的小粒径琼脂糖环氧磁珠；
羧基化反应：
将对氨基苯磺酸溶解至碳酸钠水溶液中，调节pH值至10～11，之后加入Magroes-4FF及所述的富集有环氧基的小粒径琼脂糖环氧磁珠并开始反应，反应结束后清洗干燥制得表面富集有羧基的小粒径琼脂糖羧基磁珠。
2.根据权利要求1所述的小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，其特征在于，所述制备有机相中搅拌状态的速度为300-400rpm，Span-80和液体石蜡的质量体积比为1.0-1.5：11.0-12.0，制得的有机相的温度为80℃。
3.根据权利要求1所述的小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，其特征在于，所述制备水相中搅拌加热状态的条件为搅拌速度为300rpm，搅拌时间为2h，搅拌温度为90℃。
4.根据权利要求1所述的小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，其特征在于，所述制备水相中琼脂糖水溶液的质量百分比为0.07-1％，所述四氧化三铁悬浊液的溶质为四氧化三铁粉末，溶剂为吐温20水溶液，其中，四氧化三铁粉末和蒸馏水的质量体积比1：20，所述吐温20在蒸馏水中的体积分数为0.5‰。
5.根据权利要求1所述的小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，其特征在于，所述制备小粒径琼脂糖磁珠中滴加完成后反应的条件为搅拌控温，其中，所述搅拌速度为800rpm，控温温度为85℃，反应时间为1h；自然降温时控制搅拌速度为250rpm，自然降温后的温度为40℃，所述冰浴降温后的温度为15℃。
6.根据权利要求1所述的小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，其特征在于，所述环氧基交联中蒸馏水的体积为100mL；所述搅拌的搅拌速度为250rpm，搅拌时间为30min。
7.根据权利要求1所述的小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，其特征在于，所述环氧基交联反应中氢氧化钠溶液的物质的量浓度为1M，小粒径琼脂糖磁珠和氨水的质量比为1:0.2，氨水和氢氧化钠溶液的体积比为1:1；环氧氯丙烷和DMSO的混合溶液中环氧氯丙烷和DMSO的体积比为2:5。
8.根据权利要求1所述的小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，其特征在于，所述环氧基交联反应及羧基化反应的反应条件为反应温度为40℃，反应时间为12-24h，反应搅拌速度为250rpm。
9.根据权利要求1所述的小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法，其特征在于，所述羧基化反应中碳酸钠水溶液的物质的量浓度为0.25M，对氨基苯磺酸和碳酸钠水溶液的质量体积比为1:200，所述溶解的方式为超声溶解，所述碳酸钠水溶液和Magroes-4FF的体积比为20:1。
10.一种如权利要求1-9中任意一项所述的一种小粒径琼脂糖羧基磁珠的制备方法所制得的小粒径琼脂糖羧基磁珠，其特征在于，所述小粒径琼脂糖羧基磁珠的外表面接枝羧基。
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