CN114113414A - 用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球、制备方法、试剂盒及提取方法 - Google Patents
用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球、制备方法、试剂盒及提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球、制备方法、试剂盒及提取方法。本发明所研发的试剂盒基于分散固相萃取技术，将吸附材料分散液移取至分散固相萃取瓶中，并与尿液样品溶液混合，涡旋混匀提取，通过优化提取时间和吸附材料亲水基体与功能单体的比例等参数，能保证提取过程中吸附剂与样品溶液充分接触，进而实现目标分析物的充分吸附，本发明提高了尿液样品处理效果，简化了提取三苯代谢物的操作步骤，具有十分重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域，尤其涉及一种用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球、制备方法、试剂盒及提取方法。
背景技术
苯、甲苯和二甲苯(下文简称为三苯)是最具代表性的苯系物，常温下易气化，可通过呼吸和皮肤接触方式进入体内，进而对人体健康构成严重的危害。三苯通过呼吸或皮肤接触方式进入人体后，极易被代谢成其它物质，因此，生物基质中三苯的含量较难检测到，需要通过检测生物样品中特定的生物标志物或代谢物加以评估。尿中反-反式粘糠酸(tt-MA)和苯巯基尿酸(S-PMA)是苯在机体内具有较强特异性和较高敏感性的代谢物，是比较理想的苯接触生物标志物；8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是活性氧自由基损伤细胞核DNA的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物，8-OHdG为常用的职业接触苯效应生物标志物。因此，同时监测尿中tt-MA，S-PMA和8-OHdG的含量能较全面评估人体接触苯的健康风险。苄基巯基尿酸(S-BMA)和马尿酸(HA)是甲苯在人体内的代谢物，可通过监测尿液中S-BMA和HA的含量用以评估人体接触甲苯的健康风险。同样地，尿中3种甲基马尿酸(2-甲基马尿酸(2-MHA)、3-甲基马尿酸(3-MHA)和4-甲基马尿酸(4-MHA))作为二甲苯在人体内的代谢物，可用于评估接触二甲苯的健康风险。
三苯的混合物是常见工业原料，职业工人接触到多种苯系物的情形时有发生，通过对单一某个苯系物代谢物的指标监测难以全面评估人体接触苯系物的健康风险。因此，同时测定尿液样品中8种代谢物(tt-MA、S-PMA、8-OHdG、S-BMA、HA、2-MHA、3-MHA和4-MHA)的含量对于全面评估职业工人接触三苯化合物的健康风险有着重要的科学价值和现实意义。然而，尿液样品中存在着大量无机盐和干扰三苯代谢物检测的杂质，需要选择合适的样品前处理技术才能准确测定。
目前，已有文献和专利报道了尿液样品中三苯代谢物的检测方法，如CN109342633A公开了一种尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法，该方法基于液液萃取法，难以除去尿液样品中大量的无机盐，处理净化效果不佳，将会影响检测结果的准确度与重现性，且高浓度无机盐的存在对于液相色谱-质谱仪的损伤较大。又如万玲利等的论文(《职业与健康》，2021，37(8)：1033-1043)建立了基于固相萃取柱净化-超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术检测尿液样品中三苯6种代谢物，该论文分别对比了HLB、C18、WAX、MAX和Silica五种固相萃取小柱的净化效果，证明HLB固相萃取小柱效果最佳，但按照论文提供的前处理条件试验发现三苯代谢物的回收率远不及论文中的数据。可能的原因与不足如下：(1)固相萃取柱内吸附剂填充紧密，在尿液样品处理过程中，难以保证样品溶液与柱内吸附剂充分接触，阻碍了目标分析物与吸附剂之间的吸附作用，从而影响了净化效果与准确度；(2)前处理条件的优化不够细致、净化模式选择不当，如论文中采用MAX固相萃取小柱净化时未考虑待测化合物表面存在羧基等易电离成阴离子的结构特点，在弱碱性条件可实现阴离子交换作用力进行吸附与净化以提高方法回收率；(3)商品化的固相萃取柱内吸附剂的配方固化，不能针对某类特定化合物进行个性化设计，从而影响了提取净化效果，如在处理尿液样品中既要考虑目标分析物的结构特点，又要考虑吸附剂与尿液样品基质的相容性，只有兼顾这两方面的因素才能实现高效提取与净化。
此外，采用现有文献与专利方法还存在如下问题：(1)固相萃取净化过程繁琐，处理步骤多、处理时间长、处理成本高；(2)采用HLB等固相萃取方法存在专属性差，商品化吸附剂组分固化，难以满足特定化合物净化与检测的个性化需求；(3)采用分散固相萃取净化方式可改善吸附剂与目标分析物的充分接触，但在实际样品处理过程中采用简单的离心难以实现固液相的充分分离，在吸取上清液过程中往往会导致底部的吸附剂弹起而使溶液浑浊，影响实验过程的顺利进行；(4)目前检测方法最多只针对三苯的6种代谢物，未能将更多文献已报道的代谢物进行同时检测，进而影响三苯接触健康风险的全面评估。
发明内容
针对上述不足，本发明所要解决的问题是如何高效、快速提取净化处理尿液样品，有效降低三苯8种代谢物(tt-MA、S-PMA、8-OHdG、S-BMA、HA、2-MHA、3-MHA和4-MHA)检测过程中的基质干扰效应，以实现快速、准确检测尿液样品中痕量三苯8种代谢物的浓度。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、制备交联琼脂糖微球，粒径为10-200μm；
步骤b、通过沉淀聚合反应，在引发剂AIBN作用下，以交联剂二乙烯苯和功能单体氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺为聚合单体，在交联琼脂糖表面实现季胺功能化高分子聚合物修饰，制备得到亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球。
高分子复合微球采用亲水性交联琼脂糖作为基体材料，能增强吸附材料与尿液样品的相容性，同时该材料具有多孔性，能显著增加比表面积；通过在亲水性交联琼脂糖基础上修饰季胺功能化高分子聚合物，能兼顾交联琼脂糖的亲水性和多孔性，以及季胺功能化高分子对目标分析物的高吸附容量，可大大提高吸附材料的活性位点，改善吸附效果。
进一步地，所述步骤b中各原料的重量分数为：交联琼脂糖微球1-5份、二乙烯苯3-5份、氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺1-5份、AIBN 0.2-0.5份。可根据样品类型和目标物化学结构特征，灵活调整吸附材料与样品基质的相容性及对目标分析物的吸附性能。
进一步地，所述步骤b具体包括：将交联琼脂糖微球超声分散于异丙醇中得到分散液；将二乙烯苯、氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺和AIBN溶解于乙腈中，并加入到上述分散液中；机械搅拌下升温至75-80℃，维持20-30min，快速升温至85-90℃，冷凝回流16-24h；将反应得到的产物使用纯水与乙醇清洗，得到亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球。
本发明第二方面提供一种用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球，由上述的制备方法制得。本发明的高分子复合微球对于尿液样品中8种三苯代谢物具有很好的吸附效果，可以实现三苯代谢物的快速提取净化，具有十分重要的现实意义。
本发明第三方面提供一种试剂盒，包括吸附材料分散液和分散固相萃取瓶，所述吸附材料分散液的溶质为上述的用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球。
进一步地，所述分散固相萃取瓶包括瓶体、滤筒、端盖、封盖和隔垫，所述瓶体和所述滤筒上下两端开口，所述端盖设置在所述瓶体的下端并与所述瓶体可拆卸连接，所述滤筒从所述瓶体的上端开口进入所述瓶体，所述滤筒的下端设有过滤膜，所述过滤膜覆盖所述滤筒的下端开口，所述隔垫覆盖所述滤筒的上端开口，所述封盖与所述滤筒的上端连接并压紧所述隔垫。设计了集提取、净化、过滤和进样瓶功能于一体的“四合一”分散固相萃取瓶，大大简化了样品处理的操作过程，节约了样品处理时间，降低了成本。
进一步地，所述吸附材料分散液的溶剂为硼砂缓冲液，pH为7.5-9.5。
进一步地，所述吸附材料分散液中高分子复合微球的浓度为5-20g/L。
本发明的试剂盒适合现场采样，配合小型涡旋仪即可实现尿液样品的现场采样、处理与保存，后续带回实验室立即可以进行仪器检测，大大减少了三苯代谢物在采样和运输过程中的变化与损失，提高结果的准确度，为临床精准治疗提供更准确的结果。
本发明第四方面提供一种尿液中三苯代谢物的提取方法，使上述的试剂盒，提取方法包括以下步骤：
步骤一、将分散固相萃取瓶的滤筒上拉至最高位置，打开瓶体的端盖，移取并向瓶体内加入200μL尿液样品，再加入1.0mL吸附材料分散液，关闭端盖，涡旋提取，将滤筒推至瓶体底部，上清液进入滤筒，打开滤筒的封盖，弃去上清液；
步骤二、将滤筒上拉至最高位置，打开端盖，向瓶体内加入1mL水清洗，涡旋淋洗，推动滤筒至瓶体底部使上清液进入滤筒，打开滤筒的封盖，弃去上清液；
步骤三、将滤筒上拉至最高位置，打开端盖，向瓶体内加入0.4mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，涡旋洗脱，推动滤筒至瓶体底部使上清液进入滤筒，对滤筒内洗脱液进行LC-MS进样分析。
进一步地，所述步骤一中，涡旋提取时间为5-10min；所述步骤三中，涡旋洗脱时间为5-10min。
本发明的提取方法提高了样品处理效果，简化了操作步骤；本方法基于分散固相萃取技术，将吸附材料分散液移取至分散固相萃取瓶中，并与尿液样品混合，涡旋混匀提取，通过优化提取时间，能保证吸附剂与样品溶液充分接触，进而实现目标分析物的充分吸附；与传统分散固相萃取相比，本方法免除了传统分散固相萃取技术需要的离心等繁琐步骤，且能解决传统分散固相萃取技术离心后取上清液过程中易浑浊的难题，完美解决了传统固相萃取技术和分散固相萃取技术的缺陷与不足。
综上所述，本发明的有益效果包括：
(1)提高了尿液样品处理效果，简化了提取三苯代谢物的操作步骤。商品化的固相萃取方法将吸附剂填充于SPE柱中，颗粒之间较紧密，在提取与净化过程中，样品溶液流过SPE填料，难以与吸附剂之间较充分接触，导致吸附与净化效果较差。本发明所研发的试剂盒基于分散固相萃取技术，将吸附材料分散液移取至分散固相萃取瓶中，并与尿液样品溶液混合，涡旋混匀提取，通过优化提取时间，能保证吸附剂与样品溶液充分接触，进而实现目标分析物的充分吸附。与传统分散固相萃取相比，本发明试剂盒中分散固相萃取瓶集成了提取、净化、洗脱、过滤与进样瓶功能，免除了传统分散固相萃取技术需要的离心等繁琐步骤，且能解决传统分散固相萃取技术离心后取上清液过程中易浑浊的难题。因此，本发明完美解决了传统固相萃取技术和分散固相萃取技术的缺陷与不足。
(2)缩短了提取尿液中三苯代谢物的操作时间，降低了成本。本发明的分散固相萃取瓶集提取、净化、洗脱、过滤和进样瓶功能于一体，大大简化了样品处理的操作过程，节约了样品处理时间，降低了成本；本发明提取方法无需采用基质匹配工作曲线或内标法即可实现准确定量分析，减少了基质匹配工作曲线配制过程，不使用内标法定量能大大降低成本。传统固相萃取柱一根SPE柱需要30-100元，再加上进样瓶、离心管等耗材，处理一份生物样品的耗材成本在80-150元，而运用本发明的试剂盒，处理一份样本的耗材成本可降低至5-10元，成本缩减了5-15倍。
(3)本发明的吸附材料采用亲水性交联琼脂糖作为基体材料，能增强吸附材料与尿液样品的相容性，同时该材料具有多孔性，能显著增加比表面积；通过在亲水性交联琼脂糖基础上修饰季胺功能化高分子聚合物，能兼顾交联琼脂糖的亲水性和多孔性，以及季胺功能化高分子对目标分析物的高吸附容量，可大大提高吸附材料的活性位点，改善吸附效果。
(4)与传统MAX固相萃取柱净化结果相比，本发明提取方法具有更好的去除基质干扰能力。由于分散固相萃取法能保证吸附剂与样品基质溶液充分接触，吸附材料与目标分析物实现亲密接触以达到完全吸附的目的。同时，由于本发明所用吸附材料可修饰性强，可根据待测化合物的结构特征灵活调整材料制备过程中功能单体和亲水基体的比例，以达到最优的提取净化效果。
(5)本发明的试剂盒适合现场采样，用以针对三苯中毒紧迫性、三苯代谢物在生物样品中变化快的特点，试剂盒配合小型涡旋仪即可实现尿液样品的现场采样、处理与保存，后续带回实验室立即可以进行仪器检测，大大减少了三苯代谢物在采样和运输过程中的变化与损失，提高结果的准确度，为临床精准治疗提供更准确的结果。
附图说明
图1是实施例2中分散固相萃取瓶的剖视图；
图2是实验例1中高分子复合微球的扫描电子显微镜图像；
图3是实验例1中高分子复合微球的粒径分布图；
图4是实验例1中高分子复合微球的红外光谱结果；
图5是实验例1中高分子复合微球的热重-差热分析结果；
图6是实验例2中不同pH缓冲体系对三苯代谢物峰面积的影响；
图7是实验例3中吸附材料分散液中高分子复合微球浓度对三苯代谢物峰面积的影响；
图8是实验例4中提取时间对三苯代谢物峰面积的影响；
图9是实验例4中洗脱时间对三苯代谢物峰面积的影响；
图10是实验例5中交联琼脂糖与功能单体用量比例对三苯代谢物峰面积的影响。
附图标记说明：
1-瓶体，2-滤筒，3-凸圈，4-过滤膜，5-端盖，6-封盖，7-隔垫。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
实施例1高分子复合微球的制备
本实施例制备一种用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球，该高分子复合微球可以提取净化尿液中的8种三苯代谢物：tt-MA、S-PMA、8-OHdG、S-BMA、HA、2-MHA、3-MHA和4-MHA。
制备方法包括以下步骤：
步骤a、制备交联琼脂糖微球
称取500mg琼脂糖于反应烧瓶中，加入80mL去离子水，控制机械搅拌速度300rpm，90℃加热反应2h，制得琼脂糖溶液。称取20g Span-80，用250mL液体石蜡将其溶解并完全转移至三口烧瓶中，300rpm下机械搅拌，加热使瓶内温度达到85℃，制得有机相，继续搅拌。然后将有机相反应体系搅拌速率提升至500rpm，将琼脂糖溶液逐渐滴加至反应体系，滴加完毕后800rpm搅拌下继续反应2h，自然降温，调整搅拌速度至200rpm，当反应烧瓶中的温度下降至40℃以下时，使用冰浴降温至15℃，制得琼脂糖颗粒分散液。量取15mL琼脂糖颗粒分散液，分别用无水乙醇和去离子水清洗2次，并使用去离子水定容至100mL，然后转移至三口烧瓶中，加入3mL氨水和3mL氢氧化钠溶液，搅拌反应30min，加入150mL环氧氯丙烷和400mLDMSO混合液，40℃下反应12h，随后用去离子水和无水乙醇各清洗3次，真空烘干12h，制得交联琼脂糖微球。
步骤b、亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球的合成
将1.0-5.0g交联琼脂糖微球超声分散于200mL异丙醇中，置于500mL三口烧瓶中，机械搅拌10min。将3.0-5.0g二乙烯苯、1.0-5.0g氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺和0.2-0.5g AIBN溶解于180mL乙腈中，并加入上述分散液中。机械搅拌下，升温至75-80℃，维持20min，然后快速升温至85℃，冷凝回流16h。将反应得到的产物使用纯水与乙醇清洗3遍，得到亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球。
上述方法制得的高分子复合微球采用亲水性交联琼脂糖作为基体材料，能增强吸附材料与尿液样品的相容性，同时该材料具有多孔性，能显著增加比表面积；通过在亲水性交联琼脂糖基础上修饰季胺功能化高分子聚合物，能兼顾交联琼脂糖的亲水性和多孔性，以及季胺功能化高分子对目标分析物的高吸附容量，可大大提高吸附材料的活性位点。可根据样品类型和目标物化学结构特征，灵活调整吸附材料与样品基质的相容性及对目标分析物的吸附性能，改善吸附效果。
实施例2试剂盒
本实施例提供一种试剂盒，用于提取净化尿液中的三苯代谢物，试剂盒所用的吸附材料为实施例1方法制得的高分子复合微球。
试剂盒包括分散固相萃取瓶、标准系列工作溶液、吸附材料分散液、洗脱液和聚丙烯离心管。
其中吸附材料分散液的溶质为高分子复合微球，溶剂为硼砂缓冲液，pH为7.5-9.5，高分子复合微球的浓度为5-20g/L，洗脱液为0.1％-0.5％甲酸甲醇溶液。
结合图1所示，分散固相萃取瓶包括瓶体1、滤筒2、端盖5、封盖6和隔垫7。瓶体1上下两端开口，端盖5设置在瓶体1的下端并与瓶体1可拆卸连接，连接方式为螺纹连接。滤筒2上下两端开口，下端设有过滤膜4，过滤膜4覆盖滤筒2的下端开口。隔垫7覆盖滤筒2的上端开口，封盖6与滤筒2的上端连接并压紧隔垫7。滤筒2下部设有凸圈3，凸圈3的外壁与瓶体1的内壁贴合。过滤膜4为PTFE或Nylon滤膜，孔径为0.22μm，液体可以穿过过滤膜4，而高分子复合微球无法穿过，由此过滤膜4起到过滤作用。该分散固相萃取瓶用于样品处理，集提取、净化、过滤和进样瓶功能，可以大大简化样品处理的操作过程，节约了样品处理时间，降低了成本。
本实施例的试剂盒配合小型涡旋仪即可实现尿液样品的现场采样、处理与保存，后续带回实验室立即可以进行仪器检测，大大减少了三苯代谢物在采样和运输过程中的变化与损失，提高结果的准确度，为临床精准治疗提供更准确的结果。
实施例3尿液样品中三苯代谢物的提取
本实施例为使用实施例2的试剂盒提取尿液样品中三苯代谢物的方法，包括以下步骤：
步骤一、将分散固相萃取瓶的滤筒2上拉至最高位置，打开瓶体1的端盖5，移取并向瓶体1内加入200μL尿液样品，再加入1.0mL吸附材料分散液，关闭端盖5，涡旋提取5-10min，将滤筒2推至瓶体1底部，上清液穿过过滤膜4进入滤筒2，高分子复合微球留在过滤膜4下侧，打开滤筒2的封盖6，弃去上清液。
步骤二、将滤筒2上拉至最高位置，打开端盖5，向瓶体1内加入1mL水清洗，涡旋淋洗2-5min，推动滤筒2至瓶体1底部，上清液穿过过滤膜4进入滤筒2，高分子复合微球留在过滤膜4下侧，打开滤筒2的封盖6，弃去上清液。
步骤三、将滤筒2上拉至最高位置，打开端盖5，向瓶体1内加入0.4mL0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，涡旋洗脱5-10min，推动滤筒2至瓶体1底部，上清液穿过过滤膜4进入滤筒2，高分子复合微球留在过滤膜4下侧，对滤筒2内洗脱液进行LC-MS进样分析。
LC-MS仪器条件如下：
(1)液相色谱条件
采用Waters Acquity UPLC BEH Phenyl色谱柱(柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm)，或相当者进行液相色谱分离，柱温设置40℃，流速0.3mL/min，进样体积5μL。流动相A：5mM甲酸铵-0.1％甲酸水溶液，流动相B：乙腈。梯度洗脱条件：10％B(0.00-1.50min)，10％-20％B(1.50-5.00min)，20％-40％B(5.00-8.50min)，40％-95％B(8.50-9.00min)，95％B(9.00-10.50min)，95％-10％B(9.50-10.60min)，10％B(10.60-13.00min)。
(2)质谱条件
电喷雾离子源(ESI-)，负离子模式和一级全扫描-数据依赖二级质谱扫描模式(Full mass-ddMS2),电喷雾电压-3.0kV，脱溶剂气压力275.8kPa，辅助气速率180L/h，反吹气压力13.8kPa，射频棱镜电压50％，辅助气加热温度280℃，离子传输管加热温度200℃，一级扫描分辨率70000，二级扫描分辨率35000，自动增益控制(AGC Target)1E5，最大注入时间(Maximum IT)100ms，质荷比隔离窗口(Isolation window)1.0m/z。其它质谱条件见表1。
表1三苯8种代谢物的质谱参数
本实施例的方法基于分散固相萃取技术，将吸附材料分散液移取至分散固相萃取瓶中，并与尿液样品混合，涡旋混匀提取，通过优化提取时间，能保证吸附剂与样品溶液充分接触，进而实现目标分析物的充分吸附；与传统分散固相萃取相比，本方法免除了传统分散固相萃取技术需要的离心等繁琐步骤，且能解决传统分散固相萃取技术离心后取上清液过程中易浑浊的难题；利用本方法无需采用基质匹配工作曲线或内标法即可实现准确定量分析，减少了基质匹配工作曲线配制过程的繁琐，不使用内标法定量则能大大降低成本。
实验例1高分子复合微球的表征
分别采用扫描电子显微镜(SEM)、激光粒度仪、红外光谱仪(FTIR)和热重-差热分析仪(TG-DTG)对实施例1制得的高分子复合微球的形貌、组成和结构进行表征。所用高分子复合微球的制备原料包括5g交联琼脂糖微球、5g二乙烯苯、2g氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺、0.2g AIBN。
扫描电子显微镜表征结果如图2所示，由图2(a)可知，亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球呈不规则球形，表面呈现多孔性；图2(b)为球体表面放大的SEM图谱，可以进一步验证球体表面的多孔性。
采用激光粒度仪对高分子复合微球的粒径分布进行测试，结果如图3所示，表明高分子复合微球的粒径范围为10-200μm，其尺寸大于0.22μm过滤膜的孔道直径，因此在过滤过程中高分子复合微球不会通过滤膜通道进入上清液。
红外光谱结果如图4所示，1073cm-1处的强吸收峰可归属为交联琼脂糖基体表面C-O-C的伸缩振动吸收峰；1447cm-1、1510cm-1、1602cm-1和1629cm-1可归属为聚合单体中苯环的骨架振动吸收峰，989cm-1可归属为季胺基团的特征吸收峰，由此可见，亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球已成功合成。
为了进一步考察材料的热稳定性能，采用TG-DTG手段进行表征，验结果如图5所示，表明该吸附材料能耐受200℃而无明显的质量损失，250-400℃和400-600℃的质量损失可归属为材料表面共聚高分子层的热损失(约58％)，600-1000℃的质量损失可归属为交联琼脂糖基体的热损失(约12％)。由此可见，高分子复合微球具有较好的热稳定性能。
实验例2缓冲体系pH对吸附性能的影响
实验材料准备：选择三个缓冲体系，分别为pH＝4.00邻苯二甲酸氢钾缓冲液、pH＝6.86混合磷酸盐缓冲液和pH＝9.18硼砂缓冲液，将实施例1制得的高分子复合微球分别分散在上述3种缓冲溶液中，配制成5g/L的吸附材料分散液于50mL塑料离心管中。所用高分子复合微球的制备原料包括2g交联琼脂糖微球、5g二乙烯苯、5g氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺、0.4g AIBN。
实验方法：将分散固相萃取瓶的滤筒上拉至最高位置，打开瓶体的端盖，准确移取200μL尿液加标样品(8种三苯代谢物的加标浓度均为100μg/L)于瓶体中，加入1.0mL吸附材料分散液，关闭端盖，涡旋提取6min，缓慢推动滤筒至瓶体底部，打开滤筒的封盖，弃去上清液；将滤筒上拉至最高位置，打开端盖，向瓶体内加入1mL水进行淋洗，涡旋淋洗2min，缓慢推动滤筒至瓶体底部，打开滤筒的封盖，弃去上清液；将滤筒上拉至最高位置，打开端盖，向瓶体内加入0.4mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，涡旋洗脱5min，缓慢推动滤筒至瓶体底部，使洗脱液进入滤筒，LC-MS进样分析。
实验结果：结果如图6所示，由图6可知，由图5可知，对于三苯的8种代谢物，其峰面积在pH＝4.00缓冲液中较小，而随着缓冲体系pH值的升高峰面积增大，且pH＝9.18缓冲体系中三苯的8种代谢物的峰面积差异最大。因此本发明试剂盒中的吸附材料分散液的溶剂pH控制在7.5-9.5，可以保证对三苯的8种代谢物的提取净化效果。
实验例3吸附材料分散液中高分子复合微球浓度对吸附性能的影响
实验材料准备：将实施例1制得的高分子复合微球分散在pH＝9.18硼砂缓冲液中，制得浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0g/L吸附材料分散液。所用高分子复合微球的制备原料包括2g交联琼脂糖微球、4g二乙烯苯、3g氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺、0.3g AIBN。。
实验方法：将分散固相萃取瓶的滤筒上拉至最高位置，打开瓶体的端盖，准确移取200μL尿液加标样品(8种三苯代谢物的加标浓度均为100μg/L)于瓶体中，然后分别加入1.0mL浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0和20.0g/L的吸附材料分散液，按照实施例3的方法提取、清洗和洗脱，LC-MS进样分析。
实验结果：结果如图7所示，当吸附材料分散液中高分子复合微球的浓度较低时，三苯代谢物的峰面积均较小；随着高分子复合微球浓度增大，目标分析物峰面积急剧增大；当高分子复合微球浓度达到某一数值时，继续增加浓度对目标化合物的峰面积无显著影响，且峰面积达到平台。对于代谢物tt-MA和3-MHA，其出现峰面积平台期时最小高分子复合微球浓度均为5.0g/L；代谢物S-PMA、S-BMA、HA、2-MHA和4-MHA出现峰面积平台期所需的最小高分子复合微球浓度为2.0g/L；8-OHdG出现峰面积平台期所需的最小高分子复合微球浓度为1.0g/L。为兼顾经济性和净化效率，试剂盒中的吸附材料分散液的高分子复合微球浓度为5.0-20g/L。
实验例4吸附时间和洗脱时间对吸附效果的影响
(1)吸附时间对吸附效果的影响
选择1-60min作为提取时间进行考察。将实施例1制得的高分子复合微球作为吸附材料，所用高分子复合微球的制备原料包括5g交联琼脂糖微球、5g二乙烯苯、5g氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺和0.5g AIBN。
分别吸取200μL尿液加标样品(三苯8种代谢物的加标浓度均为100μg/L)于分散固相萃取瓶的瓶体中，加入1.0mL 5.0g/L吸附材料分散液，分别涡旋提取1-60min，缓慢推动滤筒，弃上清液；按照实施例3的方法淋洗、洗脱，LC-MS进样分析。
结果如图8所示，对于三苯的8种代谢物，随着提取时间的延长目标化合物的峰面积逐渐增大，当提取时间达到某个数值时，峰面积不再增加，且达到平台值。达到峰面积平台值所需要的最短提取时间分别是：tt-MA为4min，S-PMA，8-OHdG，S-BMA和HA为3min，2-MHA，3-MHA和4-MHA为4min。为了兼顾提取效率和省时，本发明提取净化方法的提取时间控制在5-10min。
(2)洗脱时间对吸附效果的影响
选择1-60min作为洗脱时间进行考察。将实施例1制得的高分子复合微球作为吸附材料，所用高分子复合微球的制备原料包括5g交联琼脂糖微球、5g二乙烯苯、5g氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺和0.5g AIBN。
分别吸取200μL尿液加标样品(三苯8种代谢物的加标浓度均为100μg/L)于分散固相萃取瓶的瓶体中，加入1.0mL 5.0g/L亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球分散液，涡旋提取5min，缓慢推动滤筒，弃上清液；向瓶体内加入1mL水清洗，涡旋淋洗2min，推动滤筒至瓶体底部，弃去上清液；分别用0.4mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱1-60min，缓慢推动滤筒，使上清液进入滤筒，LC-MS分析。
结果如图9所示，采用0.1％甲酸甲醇溶液作为洗脱溶剂能快速地将三苯8种代谢物从亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球上洗脱下来，且控制洗脱时间为5min已能完全洗脱目标分析物。为了保证洗脱效果，本发明提取净化方法的洗脱时间控制在5-10min。
实验例5交联琼脂糖与功能单体用量比例对吸附性能的影响
实验材料准备：分别设计不同功能单体N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺和亲水基体交联琼脂糖的质量比为1：0(QA-P)、1：1(QA-agarose P-1)、2：1(QA-agarose P-2)和3：1(QA-agarose P-3)四种亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球。
吸取200μL尿液加标样品(三苯8种代谢物的加标浓度均为100μg/L)于分散固相萃取瓶的瓶体中，分别加入1.0mL以QA-P、QA-agarose P-1、QA-agarose P-2、QA-agarose P-3四种亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球为溶质的吸附材料分散液，高分子复合微球浓度为5g/L。按照实施例3的方法提取、清洗和洗脱，LC-MS进样分析。
实验结果如图10所示，从实验结果看，当高分子复合微球制备过程中未添加交联琼脂糖(QA-P)时，QA-P对三苯8种代谢物的提取与净化效率明显低于含有一定量交联琼脂糖基体的高分子复合微球(QA-agarose P-1、QA-agarose P-2和QA-agarose P-3)，由此说明亲水性交联琼脂糖基体在提取与净化过程中起着较为重要的作用，但同时高分子复合微球的高分子组分中功能单体氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺的用量也起着重要的作用，因此，高分子组分中功能单体与交联琼脂糖的用量比例对三苯的8种代谢物的峰面积起着关键作用。随着吸附剂高分子组分中功能单体氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺与交联琼脂糖的用量比例升高，三苯的8种代谢物的峰面积增大；当功能单体N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺和亲水基体交联琼脂糖的质量比为1：2时(QA-agarose P-2)，三苯的8种代谢物的峰面积最大，继续增加吸附剂功能单体N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺和亲水基体交联琼脂糖的质量比至3：1(QA-agarose-P-3)时，三苯的8种代谢物的峰面积反而减小。其原因是亲水性交联琼脂糖能有效增加高分子复合微球与尿液样品之间的相容性，有利于提取净化过程中高分子复合微球与样品基质的充分接触，进而提升提取净化效果；功能单体氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺比例过高也不利于提取净化过程，原因是功能基团季胺基密度过高会引起空间位阻效应。因此，材料合成过程中控制合适的功能单体氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺与亲水性交联琼脂糖的用量比例有利于提高吸附材料对三苯的8种代谢物的提取与净化效率。综合上述实验结果，QA-agarose P-2在尿液样品中三苯8种代谢物的提取与净化过程中性能最佳。
实验例6基质效应评价
本实验例对实施例2的试剂盒与商品化Waters Oasis WCX固相萃取柱抗基质干扰能力进行对比，试剂盒中吸附材料分散液的溶剂为pH＝9.18的硼砂缓冲液，高分子复合微球的浓度为5g/L。
分别准确吸取空白尿液样品200μL于分散固相萃取瓶的瓶体中，加入1.0mL 5.0g/L吸附材料分散液，涡旋提取5min，缓慢推动滤筒，弃上清液；向瓶体内加入1mL水清洗，涡旋淋洗2min，推动滤筒至瓶体底部，弃去上清液；分别用0.4mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱1-60min，缓慢推动滤筒，使上清液进入滤筒。然后分别添加适量三苯的8种代谢物的标准储备溶液，用净化后的尿液样品提取液配制成1、5、10、50、100和200μg/L标准系列溶液，同时用Waters Oasis MAX固相萃取柱净化基质匹配工作曲线和用甲醇配制成1、5、10、50、100和200μg/L溶剂标准系列溶液进行对比。
采用公式：基质效应η＝(基质匹配标准曲线斜率Ka-溶剂标准曲线斜率Kb)/溶剂标准曲线斜率Kb，评价亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球提取与净化尿液样品中三苯8种代谢物的基质效应，结果如表2所示。
表2本发明试剂盒与商品化Waters Oasis WCX固相萃取柱抗基质干扰能力对比
由表2可知，经本研究发明的亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球能有效减小尿液样品中三苯8种代谢物提取与净化过程中的基质效应，且基质效应η1的绝对值均小于10％，为弱基质效应，可忽略不计，即在定量过程中无需配制基质匹配工作曲线或使用同位素内标物。对于商品化的Waters Oasis MAX固相萃取柱，其tt-MA、S-PMA、8-OHdG和HA的基质效应η2的绝对值介于20％-50％之间，为中等强度基质效应，需要使用基质匹配工作曲线或使用同位素内标物进行定量分析，大大增加了实验操作的繁琐性。因此，采用本发明的基于亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球的试剂盒，能有效去除尿液样品中干扰杂质，降低三苯8种代谢物的基质干扰效应，提高尿液中三苯8种代谢物检测的准确度，具有快速、简便和准确的优点。
实验例7准确度和精密度评价
本实验例对实施例2的试剂盒用于提取尿液样品中三苯8种代谢物的准确度和精密度进行测定，试剂盒中吸附材料分散液的溶剂为pH＝9.18的硼砂缓冲液，高分子复合微球的浓度为5g/L。
分别控制尿液样品中三苯8种代谢物的加标水平为5.0、100.0和200.0μg/L，分别吸取加标尿液样品200μL于分散固相萃取瓶的瓶体中，然后加入1.0mL 5.0g/L吸附材料分散液，涡旋提取5min，缓慢推动滤筒，弃上清液；向瓶体内加入1mL水清洗，涡旋淋洗2min，推动滤筒至瓶体底部，弃去上清液；用0.4mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱5min，缓慢推动滤筒，使上清液进入滤筒，LC-MS进样分析。结果如表3所示。
表3方法加标回收率、精密度、检出限和定量限(n＝6)
实验结果表明，应用本发明试剂盒提取与净化，尿液样品中三苯8种代谢物的加标回收率为83.2％-101％之间，相对标准偏差(RSDs)为1.1％-6.8％；分别以信噪比S/N≥3和S/N≥9定义方法检出限和定量限，本发明方法对于尿液中三苯8种代谢物的方法检出限与定量限分别为0.3-0.8μg/L和0.9-2.4μg/L。可见本发明基于亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球的试剂盒提取与净化方法具有快速、灵敏和准确等优点。
虽然本发明公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a、制备交联琼脂糖微球，粒径为10-200μm；
步骤b、通过沉淀聚合反应，在引发剂AIBN作用下，以交联剂二乙烯苯和功能单体氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺为聚合单体，在交联琼脂糖表面实现季胺功能化高分子聚合物修饰，制备得到亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球。
2.根据权利要求1所述的用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球的制备方法，其特征在于，所述步骤b中各原料的重量分数为：交联琼脂糖微球1-5份、二乙烯苯3-5份、氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺1-5份、AIBN 0.2-0.5份。
3.根据权利要求2所述的用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球的制备方法，其特征在于，所述步骤b具体包括：将交联琼脂糖微球超声分散于异丙醇中得到分散液；将二乙烯苯、氯化N,N,N-三甲基-(1-(4-乙烯基苯基))甲胺和AIBN溶解于乙腈中，并加入到上述分散液中；机械搅拌下升温至75-80℃，维持20-30min，快速升温至85-90℃，冷凝回流16-24h；将反应得到的产物使用纯水与乙醇清洗，得到亲水性季胺功能化交联琼脂糖高分子复合微球。
4.一种用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球，其特征在于，由如权利要求1-3任一所述的制备方法制得。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括吸附材料分散液和分散固相萃取瓶，所述吸附材料分散液的溶质为如权利要求4所述的用于提取净化尿液中三苯代谢物的高分子复合微球。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述分散固相萃取瓶包括瓶体、滤筒、端盖、封盖和隔垫，所述瓶体和所述滤筒上下两端开口，所述端盖设置在所述瓶体的下端并与所述瓶体可拆卸连接，所述滤筒从所述瓶体的上端开口进入所述瓶体，所述滤筒的下端设有过滤膜，所述过滤膜覆盖所述滤筒的下端开口，所述隔垫覆盖所述滤筒的上端开口，所述封盖与所述滤筒的上端连接并压紧所述隔垫。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述吸附材料分散液的溶剂为硼砂缓冲液，pH为7.5-9.5。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述吸附材料分散液中高分子复合微球的浓度为5-20g/L。
9.一种尿液中三苯代谢物的提取方法，其特征在于，使用如权利要求6所述的试剂盒，所述提取方法包括以下步骤：
步骤一、将分散固相萃取瓶的滤筒上拉至最高位置，打开瓶体的端盖，移取并向瓶体内加入200μL尿液样品，再加入1.0mL吸附材料分散液，关闭端盖，涡旋提取，将滤筒推至瓶体底部，上清液进入滤筒，打开滤筒的封盖，弃去上清液；
步骤二、将滤筒上拉至最高位置，打开端盖，向瓶体内加入1mL水清洗，涡旋淋洗，推动滤筒至瓶体底部使上清液进入滤筒，打开滤筒的封盖，弃去上清液；
步骤三、将滤筒上拉至最高位置，打开端盖，向瓶体内加入0.4mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，涡旋洗脱，推动滤筒至瓶体底部使上清液进入滤筒，对滤筒内洗脱液进行LC-MS进样分析。
10.根据权利要求9所述的尿液中三苯代谢物的提取方法，其特征在于，所述步骤一中，涡旋提取时间为5-10min；所述步骤三中，涡旋洗脱时间为5-10min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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