CN108828114B

CN108828114B - 一种固相微萃取-质谱联用在线富集检测烟草中烟碱类化合物的方法

Info

Publication number: CN108828114B
Application number: CN201810579758.3A
Authority: CN
Inventors: 吴芳玲; 王亮; 杨淑童; 丁航宇; 储艳秋; 丁传凡
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2038-06-07
Also published as: CN108828114A

Abstract

本发明公开了一种固相微萃取‑质谱联用在线富集检测烟草中烟碱类化合物的方法。本发明通过将Poly(DVB‑co‑NIPPAm‑co‑MBAA)聚合整体微萃取柱与大气压电离质谱API‑MS在线联用，实现对烟草中烟碱类化合物的在线富集检测。本发明将整体微萃取柱与API‑MS在线联用，利用整体柱表面的氢键，π‑π键及疏水性等与烟碱化合物之间非共价键相互作用，应用于烟碱类有害物质的富集，可实现烟碱类化合物的在线分析，本发明方法简单，价格便宜，易于操作，烟叶中多种有害烟碱类成分的快速萃取富集，提高了其检测灵敏度及减少了基质干扰，并满足烟草中烟碱类化合物的高效检测要求。

Description

一种固相微萃取-质谱联用在线富集检测烟草中烟碱类化合物的方法

技术领域

本发明属于食品检测分离分析技术领域，具体涉及一种固相微萃取-质谱联用在线富集检测烟草中烟碱类化合物的方法。

背景技术

烟草中含有很多危害生命健康的化学物质，并且这些物质是许多疾病的致病因素，例如：肺部疾病、心血管疾病，哮喘、糖尿病及癌症等。因此，烟草中一些成分如烟碱等的存在对人们身体健康还是特别重要的。据分析，烟碱是烟草中含量且毒性较大的化合物，其又称为尼古丁。并且烟碱中特有的亚硝胺类化合物，是影响身体健康的一大类化合物。其中比较常见且毒性较大的包括：1-(4-硝基苯基)哌嗪(1-(4-Nitrophenyl)piperazine，简称NHK)、尼古丁(L-Nicotine,LNT)、DL-毒藜碱(DL-Anabasine，简称DL-ABs)、降烟碱(Nornicotine，简称NCt)、烟酸乙酯(Ethylnicotinoate，简称NAE)、4,4'-(1,3-丙二基)双吡啶(4，4'-Trimethylenedipyridine，简称TMP)、4-苄基吡啶(4-Benzylpiperidine，简称BPD)等。因此，这些毒性化合物含量的测定与限制对吸烟者身体的健康具有很大的意义。

电喷雾质谱法(ESI-MS)属于软电离技术，化合物在电离过程中不被破坏，可以得到更为准确完整的分子量信息，并且该方法具有灵敏度高，大气压环境下电离，可以多个化合物同时检查，线性范围宽等优点，因此该方法也是有机/无机等化合物分析研究的常用工具。当ESI-MS遇到实际样品时，会由于实际样品成分复杂，目标化合物含量少，基质问题，也有可能会引起质谱的污染堵塞等问题，影响到检查结果的准确性或影响到质谱其分析性能。因此，在实际样品检测前都需要有特定的样品前处理过。

管内固相微萃取(In-tube Solid Phase Micro-extraction,In-tube SPME)是近年来样品前处理较为热门的一项新技术，最初由Pawliszy等人提出。In-tube SPME是基于SPE基础上发展而来，属于一种新型的集分析物净化、萃取、富集及分离于一体的样品前处理技术。其做法是将反应单体、交联剂、引发剂和致孔剂混合液注入经前处理的空毛细管中，密封后在一定条件下发生聚合反应，以在毛细管柱内形成连续多孔的有机聚合物材料，其中聚合物中功能单体的选择对目标化合物的富集有很大的关系。由于该技术具有无需大量萃取溶剂，操作简单，分析时间短，重现性好等优点，其已成功地在医药、环境分析、食品检测等众多领域中得以应用。

由于In-tube SPME使用寿命长、装置简单、不需要设计复杂的附加进样接口，该技术可以方便地与各种分析仪器联用，以提高方法的灵敏度和适用面，也更容易实现痕量分析。其中，In-tube SPME可作为MS的样品导入技术，直接与MS联用。Meurer等人设计了一种In-tube SPME-MS简单直接的联用方式，仅需要在大气压环境下与高真空质谱仪之间使用一个隔膜作为接口，即组成了In-tube SPME-MS联用的进样系统。并利用该系统分析了水溶液中低浓度的挥发性和半挥发性有机化合物，结果证明该系统具有高的灵敏度，好的重现性和精密度。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种固相微萃取-质谱联用在线富集检测烟草中烟碱类化合物的方法。本发明先制备一种可用于烟草中烟碱成分富集的管内聚合物整体柱(In-tube SPME)，进而建立一种In-tube SPME与API-MS在线检测实际样品烟草中有害身体健康的烟碱化合物含量的方法。该方法利用整体柱表面的氢键，π-π键及疏水性等与烟碱化合物之间非共价键相互作用，实现烟碱类有害物质的富集，进而实现烟草中包括1-(4-硝基苯基)哌嗪NHK、尼古丁LNT、DL-毒藜碱DL-ABs、降烟碱NCt、烟酸乙酯NAE、4,4'-(1,3-丙二基)双吡啶TMP、4-苄基吡啶BPD六种烟碱类化合物的在线分析。该方法具有高通量、高灵敏度、低样品消耗及简单快速等优点，适合该烟碱类物质的痕量分析。

本发明的技术方案具体介绍如下。

一种固相微萃取-质谱联用在线富集检测烟草中烟碱类化合物的方法，其通过将Poly(DVB-co-NIPPAm-co-MBAA)聚合整体微萃取柱与大气压电离质谱API-MS在线联用，实现对烟草中烟碱类化合物的在线富集检测；其中：Poly(NIPAAm-co-DVB-co-MBAA)聚合整体柱的制备方法具体如下：

(1)对毛细管柱进行活化处理；

(2)将3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷γ-MAPS和甲醇混合超声均匀后注入到活化好的毛细管柱内，两端密封，55～65℃的水浴锅内反应20～28小时，反应结束后，洗涤、氮气吹干，得到硅烷化的毛细管柱；

(3)将对乙烯基苯DVB，N-异丙基丙烯酰胺NIPPAm、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺MBAA、引发剂及致孔剂混合超声后，注入到硅烷化的毛细管柱中，将毛细管柱两端密封，再在60℃～65℃的水浴锅中反应15～24小时，待反应结束后，洗涤，得到Poly(NIPAAm-co-DVB-co-MBAA)聚合整体柱。

本发明中，步骤(1)中，采用0.08～0.12mol·L^-1NaOH溶液连续冲洗活化洁净的毛细管空柱2-4小时，实现毛细管柱的活化处理。

本发明中，步骤(2)中，3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷γ-MAPS和甲醇的体积比为3:2～2:3。

本发明中，步骤(2)中，采用甲醇洗涤毛细管柱。

本发明中，步骤(3)中，对乙烯基苯DVB，N-异丙基丙烯酰胺NIPPAm和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺MBAA的质量比为(3～5)：(2～4)：(7～9)。

本发明中，步骤(3)中，引发剂为AIBN，引发剂用量为对乙烯基苯DVB，N-异丙基丙烯酰胺NIPPAm和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺MBAA总质量的0.1％～0.5％；致孔剂为二元致孔剂，其由质量比为1:3～1:5的聚乙二醇20000和甲醇组成，致孔剂和对乙烯基苯DVB，N-异丙基丙烯酰胺NIPPAm和乙二醇二甲基丙烯酸酯EDMA的总质量的投料比为4:1～6:1。

本发明中，步骤(3)中，采用乙醇洗涤毛细管柱。

本发明中，通过PEEK管和三通阀将第一微量进样注射泵和第二微量进样注射泵和Poly(DVB-co-NIPPAm-co-MBAA)聚合整体微萃取柱联结实现Poly(DVB-co-NIPPAm-co-MBAA)聚合整体微萃取柱与大气压电离质谱API-MS的在线联用；在线联用时，首先，将第一微量进样注射泵打开，将体积为300μL、浓度为1～100ng·mL^-1的待检测样品溶液通过PEEK管送入到Poly(DVB-co-NIPPAm-co-MBAA)聚合整体微萃取柱中，使目标分析物通过固-液萃取富集在Poly(DVB-co-NIPPAm-co-MBAA)聚合整体微萃取柱上；当样品溶液萃取完成后，将第一微量进样注射泵关掉，打开第二微量进样注射泵，将洗脱溶液输送到毛细管整体柱中，先洗脱去除整体柱中的残留的水和气泡，2～3分钟后打开电喷雾的电压，一边洗脱一边进行ESI-MS分析。

本发明中，待检测样品溶液的溶剂采用体积比为99:1～15:85的二次水和乙腈；待检测样品溶液的进样流速为30μL min^-1，萃取时间为10min。

本发明中，洗脱溶液为洗脱溶液为体积比为0～70％的乙腈和0～0.02％(v/v)的甲酸水溶液组成的混合溶液；洗脱流速为3～15μL min^-1；洗脱时间为8min。

和现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明基于烟碱化合物的结构为基础，以“相似相溶”的原理，以DVB、NIPAAm和MBAA为反应单体制备了poly(NIPAAm-co-DVB-co-MBAA)聚合物整体柱。该聚合物整体柱对目标分析物具有良好的富集性能和选择性，简化了样品分析复杂的前处理过程，提高了分析物的检测灵敏度，其最低检测限可达0.140～0.644ng·mL^-1，最低检测量可达1.99～4.06ng·mL^-1，同一天和不同天的相对偏差分别低于0.43％和1.22％。此外，整个分析过程为在线分析，包括样品富集和分析，在最优分析条件下可在20min内即可以完成；分析样品用量小，即300μL可实现烟草中烟碱化合物(例如NCt、NAE、LNT、BPD、TMP和NHK)的检测分析；本发明还具有方法简单，有机溶剂用量少，经济实惠，易于推广等优点。

附图说明

图1是poly(NIPAAm-co-DVB-co-MBAA)聚合物整体柱的扫描电镜图。

图2是聚合物整体柱与API-MS联用的系统图；图中标号：1-注射泵A，2-注射泵B，3-PEEK管，4-三通管，5-聚合物整体柱，6-二通管，7-真空电喷雾-质谱检测器。

图3是联用系统的体积优化图；(a)为样品溶液中ACN含量；(b)为样品萃取时间；(c)为解吸溶剂中甲酸的含量；(d)为洗脱样品中水的比例；(e)为解吸流速；(f)为洗脱时间。

图4是烟碱分析物检测质谱图。

图中a是烟碱分析样品直接API-MS分析质谱图；图中b是poly(NIPAAm-co-DVB-co-MBAA)聚合物整体柱与API-MS联用的烟碱分析质谱图。

具体实施方式

为了更加容易的理解本发明的特点或优点，我们进一步的对本发明的内容加以说明，但本技术不止仅限于此。

实施例1

先依次用甲醇15min、水15min、0.1mol L^-1的HCl溶液30min冲洗毛细管整体空柱(内径为150μm)，以除去毛细管内壁残留的有机、无机杂质等。其次通入二次水，到流出的溶液基本为中性为止。然后用0.1mol L^-1的NaOH溶液对毛细管整体柱内壁活化大概3小时，接着再次通人二次水到中性，最后通入甲醇30min，氮气吹干30min。

将甲醇：γ-MAPS＝50:50(v/v)的混合物均匀的注入活化好的毛细管中，反应24小时，使毛细管内壁硅烷化。硅烷化好的毛细管柱，再通入甲醇把硅烷试剂冲洗掉。氮气吹干。

将反应单体：NIPAAm(60mg)；交联剂：DVB(80mg)、MBAA(160mg)；致孔剂：聚乙二醇20000(300mg)和甲醇(1400mg)及引发剂：AIBN(3mg)的混合溶液10℃内超声10min后，均匀缓慢的注入硅烷化好的毛细管空柱中，硅胶垫密封毛细管两端，置于65℃的水浴锅中反应20小时。反应完成后，通入ACN冲洗聚合物整体柱中未反应的单体或致孔剂1小时，最后得到备用的poly(NIPAAm-co-DVB-co-MBAA)聚合物整体柱(其SEM图展示于图1中)。

实施例2

将poly(NIPAAm-co-DVB-co-MBAA)聚合物整体柱与API-MS联用，其联接方式如图2所示。二个微量进样注射泵A 1和B 2分别作为分析样品与洗脱溶剂的驱动力、通过PEEK管3、三通管4与poly(NIPAAm-co-DVB-co-MBAA)聚合物整体柱5联接起来。再通过一个二通管6、PEEK管3与真空电喷雾-质谱检测器API-M7S中真空腔的ESI连接起来。分析物经过样品萃取，洗脱等程序，最后进入质谱中得以分析。

通过条件优化后，最优条件为：样品中乙腈的含量(99％，v/v)、萃取流速(30μLmin^-1)、甲酸的浓度(0.01％,v/v)、水浓度、洗脱流速、洗脱时间，采用以下富集分析步骤(图3)：

首先，将微量进样注射泵A1打开，将300μL的样品溶液(100ng·mL^-1,溶剂为水:ACN＝99:1,v/v)以30μL min^-1通过PEEK管3送入到poly(DVB-co-NIPAAm-co-MBAA)聚合物整体柱5中，使目标分析物通过固-液萃取富集在整体柱上，萃取时间为10min。当样品溶液萃取完成后，将微量进样注射泵A1关掉，打开微量进样注射泵B2，将洗脱溶液(ACN:1％的甲酸水溶液＝95:5，v/v)以10μL min^-1的流速输送到毛细管整体柱中。洗脱的前二分钟是去除整体柱中的残留的水和气泡，二分钟后开始打开电喷雾的电压，一边解吸一边进行ESI-MS分析，洗脱和分析的时间为8min，其质谱分析结果显示于图4中。

实施例3

样品溶液：300μL；溶剂为水:ACN＝99:1(v/v)；进样流速：30μL min^-1；萃取时间：10min；洗脱溶液：ACN:0.01％的甲酸水溶液＝95:5(v/v)；洗脱流速：10μL min^-1；洗脱时间：10min的条件下，利用本方法对烟草样品中六种烟碱化合物检测分析，检测范围在1～100ng/mL，其检测参数如表1所示。

表1管内固相微萃取-质谱方法分析六种烟碱化合物所得的分析参数

注：R2相关系数；RSD相对标准偏差。

表1中结果显示，检测限可达到0.140～0.644ng·mL^-1，最低检测量可达1.99～4.06ng·mL^-1，同一天内的偏差在5.89～6.43％，不同天内的偏差在10.3～12.6％。

Claims

1.一种固相微萃取-质谱联用在线富集检测烟草中烟碱类化合物的方法，其特征在于，其通过将Poly (DVB-co-NIPPAm-co-MBA) 聚合整体微萃取柱与大气压电离质谱API-MS在线联用，实现对烟草中烟碱类化合物的在线富集检测；其中：

Poly (DVB-co-NIPPAm-co-MBA)聚合整体微萃取柱的制备方法具体如下：

（1）对毛细管柱进行活化处理；

（2）将3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷γ-MAPS和甲醇混合超声均匀后注入到活化好的毛细管柱内，两端密封，55~65℃的水浴锅内反应20~28h，反应结束后，洗涤、氮气吹干，得到硅烷化的毛细管柱；

（3）将二乙烯基苯DVB，N-异丙基丙烯酰胺NIPPAm、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺MBA、引发剂及致孔剂混合超声后，注入到硅烷化的毛细管柱中，将毛细管柱两端密封，再在60℃-65℃的水浴锅中反应15~24小时，待反应结束后，洗涤，得到Poly（NIPAAm-co- DVB-co-MBA）聚合整体微萃取柱；其中：

二乙烯基苯DVB，N-异丙基丙烯酰胺NIPPAm和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺MBA的质量比为（3~5）：（2~4）：(7~9)；

引发剂为AIBN，引发剂用量为二乙烯基苯DVB，N-异丙基丙烯酰胺NIPPAm和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺MBA总质量的0.1%~0.5%；致孔剂为二元致孔剂，其由质量比为1:3~1:5的聚乙二醇20000和甲醇组成，致孔剂和二乙烯基苯DVB，N-异丙基丙烯酰胺NIPPAm和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺MBA的总质量的投料比为4:1~6:1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，采用0.08~0.12 mol·L^-1NaOH溶液连续冲洗活化洁净的毛细管空柱2-4小时，实现毛细管柱的活化处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷γ-MAPS和甲醇的体积比为3:2~2:3。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，采用甲醇洗涤毛细管柱。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，采用乙醇洗涤毛细管柱。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过PEEK管和三通阀将第一微量进样注射泵和第二微量进样注射泵和Poly (DVB-co-NIPPAm-co-MBA) 聚合整体微萃取柱联结实现Poly (DVB-co-NIPPAm-co-MBA) 聚合整体微萃取柱与大气压电离质谱API-MS的在线联用；在线联用时，首先，将第一微量进样注射泵打开，将体积为300μL、浓度为1~100 ng·mL⁻¹的待检测样品溶液通过PEEK管送入到Poly (DVB-co-NIPPAm-co-MBA) 聚合整体微萃取柱中，使目标分析物通过固-液萃取富集在Poly (DVB-co-NIPPAm-co-MBA) 聚合整体微萃取柱上；当样品溶液萃取完成后，将第一微量进样注射泵关掉，打开第二微量进样注射泵，将洗脱溶液输送到毛细管整体柱中，先洗脱去除整体柱中的残留的水和气泡，2~3分钟后打开电喷雾的电压，一边洗脱一边进行ESI-MS分析。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，待检测样品溶液的溶剂采用体积比为99:1-15:85的二次水和乙腈；待检测样品溶液的进样流速为10~50 µL min^-1，萃取时间为6~30min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，洗脱溶液为体积比为0~70% 的乙腈和0~0.02%（v/v）的甲酸水溶液组成的混合溶液；洗脱流速为3~15 µL min^-1；洗脱时间为8 min。