CN102230924A - 一种烟草及烟草制品中游离烟碱的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草及烟草制品中游离烟碱的测定方法。该方法采用聚二甲基硅氧烷/苯乙烯为萃取材料对烟草样品粉末进行固相微萃取，并进行气相色谱/质谱联用仪定量分析，得到游离烟碱测定结果。方法评价数据表明，本方法具有测定结果准确，重现性好、对游离烟碱与质子态烟碱之间的平衡破坏少等优点。

Description

一种烟草及烟草制品中游离烟碱的测定方法

技术领域

本发明属于卷烟评测技术领域，具体涉及一种烟草及烟草制品中游离烟碱的测定方法。

背景技术

烟碱为烟草中特有的、含吡啶环和吡咯环的有机生物碱，并在烟草制品中起到了重要的作用，为卷烟消费的主要目标物之一。上个世纪以来，烟碱，尤其是游离烟碱在卷烟烟气中的含量及生理作用激发了科学家们更多的研究兴趣。1970年，Armitage（Armitage, Nature, 1970）发现游离烟碱比质子态烟碱具有较强的亲酯性、易于穿透口腔黏膜从而更快速的被人体吸收。人们针对游离烟碱在人体中的吸收代谢（Schievelbein, Agents Actions 1973; Taylor, Proc. Natl. Acad. Sci. 2010）、游离烟碱的成瘾性以及游离烟碱与卷烟抽吸品质（陈建潭，烟草科技 2000; 于川芳，烟草科技 2006）等方面开展了大量的工作。

在烟草及烟草制品中，游离烟碱与质子态烟碱存在动态的平衡，游离烟碱的含量易受到诸如水分、温度、溶剂、pH等因素的干扰。因此，有关烟草及烟草制品中游离烟碱的准确测定仍然为本领域的一项技术难题。基于此，建立一种对游离烟碱存在环境干扰少、测定准确的方法对于分析检测人员而言存在较大的困难。迄今为止，人们更多的关于卷烟烟气中游离烟碱的检测方法研究，而烟草及烟草制品中游离烟碱的检测研究报道较少。

杜珊（杜珊，安徽大学学报（自然科学版） 2006）等采用了水溶液对烟草制品进行萃取后，采用氯仿萃取水溶液中游离烟碱并进行GC/FID分析，并考察了不同萃取方式对测定方法回收率的影响，进而分析了回收率偏低的原因在于萃取的水溶液为缓冲体系所致。

卢斌斌（卢斌斌，烟草科技 2003）采用去CO2的超纯水对烟末进行萃取，再用含内标的氯仿溶液分两次萃取，合并后进行GC/FID分析，采用所建立的方法针对47种商品卷烟进行了游离烟碱的测定，并进行了游离烟碱，总烟碱和pH的相关性分析，结果表明：游离烟碱的含量与pH呈显著正相关。

卢丽娟（卢丽娟，安徽农业科学 2009）采用去CO2的超纯水对烟末进行萃取，考察了不同物料比、萃取溶剂和萃取时间等因素对游离烟碱测定结果的影响。

Divanidis（Divanidis, S. CORESTA 2000）在2000年CORESTA大会上发表论文建议在未使用碱的情况下，能被有机溶剂或水蒸气蒸馏等方式而提取的那部分烟碱为游离烟碱，但未严格定义提取溶剂的性质及蒸馏时间等参数。研究结果表明：按照此方式提取得到的游离烟碱可以很好的用来表征卷烟烟气劲头。 

于瑞国（于瑞国，中国烟草学会工业专业委员会2005烟草化学学术研讨会 2005）根据Divanidis对游离烟碱的定义，采用中性水为萃取介质，在130 ℃条件下，对40 目烟末样品进行萃取，蒸馏出的馏分经冷却后，参照烟草中总植物碱的连续流动分析方法，对游离态烟碱进行测定，研究考察了蒸馏温度及蒸馏介质pH对测定结果的影响，并对检测方法进行了相关探讨。

上述这些方法均对游离烟碱存在环境有不同程度的破坏。因此，建立一种易于推广并能准确测定烟草及烟草制品中游离烟碱含量的方法，就成为本技术领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种对游离烟碱存在环境干扰较小、不影响游离烟碱平衡、能够准确测定烟草及烟草制品中游离烟碱的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

除非另有说明，本发明所使用的百分数均为质量百分数。

一种烟草及烟草制品中游离烟碱的测定方法，包括以下步骤：

1、标准工作曲线的绘制

①空白样品的制备：将50 g烟丝磨成粉末，加入1 L浓度2%的 NaOH水溶液超声提取1 h，重复提取5次，每次提取完毕后，用纱布过滤提取液，将滤得的烟末进行下一次提取；提取完成后将烟末烘干至10%～15%的含水率，再将烟末放入温度为22 ℃，相对湿度为RH60%的恒温恒湿箱中平衡48 h，得到空白烟末样品；

②标准溶液的配制：以正己烷为溶剂配制浓度为100 g/L、50 g/L、25 g/L、10 g/L、5 g/L、1 g/L的烟碱标准溶液；以正己烷为溶剂配制浓度为10 g/L及5 g/L的氘代甲苯溶液；

③标准曲线的建立：取6个棕色顶空瓶，每个顶空瓶中放置0.2 g的空白烟末样品，分别准确加入1 μL浓度为10 g/L的氘代甲苯溶液，再分别准确加入1 μL浓度为100 g/L、50 g/L、25 g/L、10 g/L、5 g/L、1 g/L的烟碱标准溶液，立即密封后将烟末混合均匀；将6个顶空瓶在30 ℃平衡2 h后进行分析测试；将6个样品的游离烟碱与氘代甲苯的响应值比与烟碱的浓度进行线性回归，得到标准工作曲线，曲线不强制归零，线性相关系数R²须大于0.999；

2、待测样品的准备

①将待测烟草样品粉碎成粉末，将样品烟末放入温度为22 ℃，相对湿度为RH60%的恒温恒湿箱平衡48 h；

所述的待测烟草样品也可以是烟草制品，即成品卷烟，除去卷烟纸、水松纸、卷烟滤棒等辅材后得到的纯烟丝。

②称取0.200 g待测样品烟末置于20 mL棕色顶空瓶中，加入2 μL浓度为5 g/L的氘代甲苯溶液，立即密封后混合均匀，在30 ℃条件下平衡2 h后，进行游离烟碱的分析测试；

3、游离烟碱仪器分析条件

①固相微萃取针：

萃取材料为：聚二甲基硅氧烷/苯乙烯材料，部分交联，材料膜厚为65 μm；

②固相微萃取条件：

预平衡温度：30 ℃，预平衡时间：600 s，萃取时间：1800 s，脱附时间：20 s，洗针时间：900 s，洗针温度：250 ℃，洗针气体：纯度≥99.999%的高纯氮气，洗针压力设置为：0.2 Mpa；

③色谱分析条件：

以纯度≥99.999%的氦气为载气，恒流模式，流量为1.5 mL/min；进样口温度设定为250 ℃；采用分流进样方式，分流比为40:1，程序升温条件为初始温度50 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至210 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至240 ℃，保持3 min；

④质谱分析条件：

电离方式采用电子轰击源，电离能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；传输线温度为250 ℃；游离烟碱定量离子为84，辅助定量离子为133和162，氘代甲苯的定量离子为98，辅助定量离子为100和70；

4、分析结果计算

记录测试样品游离烟碱及氘代甲苯的响应值，根据步骤1所建立的标准曲线，计算得出样品中游离烟碱的含量。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、本发明所公开的烟草及烟草制品中游离烟碱的测定方法对游离烟碱与质子态烟碱所存在的平衡无干扰，对游离烟碱存在环境无破坏，测定结果更为准确可靠。

2、本发明所公开的烟草及烟草制品中游离烟碱的测定方法具有溶剂使用极少，对环境友好等优点。

3、本发明所公开的烟草及烟草制品中游离烟碱的测定方法具有测定结果准确，操作简单，方法重现性好的优点。游离烟碱含量的准确测定对卷烟配方设计、产品维护及质量控制等方面具有指导借鉴意义。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明分析条件等技术要点，并不用于限定本发明。

实施例1

所使用的主要试剂及仪器

烟碱：纯度≥99%；

正己烷：色谱纯，美国Fisher公司；

3R4F参比卷烟，美国Kentucky大学；

带顶空固相微萃取自动进样器的气相色谱/质谱联用仪，型号6890/5973，美国Agilent公司；

ZB-624弹性毛细管14%氰丙基苯和86%二甲基聚硅氧烷柱，长度为30 m，内径为0.32 mm，膜厚为1.8 μm，美国Phenomenex公司；

65 μm聚二甲基硅氧烷/苯乙烯固相微萃取头，部分交联，美国Supelco公司；

分析天平，感量0.1 mg；

手动微量进样针；

各种规格棕色容量瓶；

1. 标准工作曲线的建立

1.1 空白样品的制备

将50 g烟丝磨成粉末，加入1 L浓度2%的 NaOH水溶液超声提取1 h，按上述步骤重复提取5次，每次提取完毕后，用纱布过滤提取液，将滤得的烟末进行下一次提取；提取完成后将烟末烘干至10%～15%的含水率，再将烟末放入温度为22 ℃，相对湿度为RH60%的恒温恒湿箱中平衡48 h，得到空白烟末样品。

1.2 烟碱标准溶液

烟碱标准储备液：称取2.5 g烟碱标准品于25 mL容量瓶中，用正己烷定容，得到100 g/L烟碱标准储备液，于4 ℃冰箱中避光保存，有效期为3个月。

烟碱标准工作溶液：将标准储备液用正己烷逐级稀释，得到50 g/L、25 g/L、10 g/L、5 g/L、1 g/L标准工作溶液。

1.3 内标标准溶液

内标储备液：称取100 mg氘代甲苯于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，得到10 g/L的标准储备液，于4 ℃冰箱中避光保存，有效期为3个月。

内标工作溶液：将内标储备液稀释一倍，得到5 g/L的内标工作溶液。

1.4 标准工作样品

分别准确称取0.200 g平衡好的空白烟末样品于6个顶空瓶中，分别准确加入1 μL内标储备液和1 μL浓度为100 g/L、50 g/L、25 g/L、10 g/L、5 g/L、1 g/L的烟碱标准溶液，旋紧旋塞，将6个顶空瓶在30 ℃下平衡2 h后上机测试，各标准工作样品浓度如表1所示。

1.5 标准曲线的绘制

对标准工作样品进行选择性离子扫描，分别计算每个标准样品中游离烟碱与内标的响应值比，将6个样品的响应值比与烟碱的浓度进行线性回归，得到标准工作曲线，曲线不强制归零，线性相关系数R²须大于0.999。

2. 待测样品的前处理

取10 g待测烟叶或烟丝样品，经过旋风磨磨碎以后，将烟末放入温度为22 ℃，相对湿度为RH60%的恒温恒湿箱内平衡48 h，即为待测样品。

准确称取0.200 g（精确至0.1 mg）待测样品于20 mL棕色顶空瓶中，准确加入浓度为5 g/L的内标工作溶液2 μL，密封混匀，待测样品在30 ℃条件下平衡2 h后，进行色谱分析。

3. 游离烟碱的仪器分析条件

3.1 固相微萃取条件

将室温平衡好的样品上机，以材料膜厚为65 μm、部分交联的聚二甲基硅氧烷/苯乙烯为固相微萃取材料；固相微萃取平衡温度设定30 ℃，预平衡时间600 s，萃取时间1800 s，脱附时间20 s，脱附后针洗针处理时间为900 s。洗针温度：250 ℃；洗针气体：纯度≥99.999%的高纯氮气；洗针压力设置为：0.2 MPa。

3.2 色谱分析条件

载气：氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流量：1.5 mL/min。

进样口温度：250 ℃。

分流进样，分流比40:1；

程序升温：初始温度50 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至210 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至240 ℃，保持3 min。

3.3质谱条件

电离方式：电子轰击源（EI）；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；传输线温度：250 ℃。

定性分析：采用标准物质保留时间、待测组分特征离子、各定性离子丰度比进行定性分析。

定量分析：采用选择性离子扫描模式分段扫描，以特征离子进行定量分析。各组分特征离子选择见表2所示。

* 表示定量离子

3.4 注意事项

萃取针上次进样时间与本次进样时间间隔超过12 h，应首先进行萃取针的活化，活化方式依次按照3.1和3.2程序进行。

4 样品测定结果的计算

将待测样品按照步骤3所设定的仪器条件进行测定，计算得出待测样品中游离烟碱与内标物的响应值比，再由标准工作曲线计算得出样品中游离烟碱的含量，单位为微克/克（μg/g）。

5. 方法评价

5.1 方法的检出限和定量检测限

由于对同一个样品瓶进行进样会使其内标逐步降低，这样会严重影响测定结果，因此，本实验采用将最低浓度的样品平行测定10次，进样测定其最低检出限（LOD）和最低检测限（LOQ），其测定结果如表3所示。

5.2 方法的精密度

选取了曲靖红大C3F（2008年）烟末为实验对象，平行处理10份样品，进行游离烟碱分析，分析结果表明：方法精密度较高，达到检测要求，结果如表4所示：

。

实施例2

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

分别选取2002年产重庆万州白肋烟片烟和2009年产曲靖红大片烟，将上述两个样品经切丝得到烟丝样品，切丝宽度为0.9 mm。将烟丝经旋风磨碾磨得到烟末样品。分别将上述六个片烟、烟丝、烟末样品进行样品中游离烟碱的测定，测定结果如表5所示。结果表明：烟末的测定结果要高于其它形态的烟草制品，因此本方法采用烟末作为实验对象。

实施例3～5

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

为了考察不同样品称样量对检测结果的影响，实施例3采用了0.1 g样品称样量，实施例4采用了0.2 g样品称样量，实施例5采用了0.5 g样品称样量，在不同称样量条件下，平行处理5份样品，考察样品检测结果的变异系数，检测结果表明：称样量在0.2 g时游离烟碱和氘代甲苯满足分析测试要求，结果如表6所示。

实施例6

文献和本实验均已证实，测试样品水分的含量高低极显著地影响对游离烟碱的检测结果。因此，所有样品须保持在同一含水率。

为了考察不同的样品在经过平衡后含水率的结果，我们随机选取了20个烟叶样品，样品以烤烟型烟叶为主，兼顾了晾晒烟和香料烟，将这些经过粉碎后，在60 RH%，22 ℃条件下平衡48 h，按照YC/T 345-2010《烟草及烟草制品 水分的测定》测定其含水率。检测结果如下表所示，检测结果表明：大部分样品在经过48 h平衡后，水分均保持在相同的含水率水平。结果如表7所示。为了简化测定程序，本方案采用将样品在上述条件下平衡后进行游离烟碱的测定。

实施例7～10

在本系列实施例中，考察了标准曲线空白基质的建立方法，即考察了对样品中烟碱的去除方法，其目的在于将标准曲线建立在一个无烟碱或近似无烟碱，但样品基质又尽可能的与实测样品基质尽可能的接近的空白基质。实施例7采用对烟末样品采用水5次振荡提取，实施例8采用水5次超声提取，实施例9采用5%HCl溶液超声提取3次，实施例10采用2%NaOH水溶液超声提取5次，上述实施例每次提取时间均为1 h，提取溶液用量均为1 L。通过实施例7~10的实施，结果表明：采用水溶液振荡崎岖、超声波提取方法及5%HCl溶液多次提取后，最后一次的提取溶液经过高效液相色谱检测，表明提取液中无烟碱，但将烟末样品碱化后，恒温恒湿平衡后进行样品中游离烟碱的分析，仍可以检测到烟碱的信号，说明上述几个提取方案对烟末中的烟碱提取不完全。而采用2%NaOH溶液分5次超声提取后，样品的游离烟碱信号较低，满足标准曲线的绘制要求。

实施例11～14

在空白样品制备得到后，要使标准曲线基质与实际样品的基质吻合，也要兼顾游离烟碱的游离程度。为此，实验考察了使用同一样品在不同处理条件下，加入相同量的内标和游离烟碱，检测其信号强弱并进行对比。将实施例10处理得到的样品进行以下技术处理，实施例11采用将样品烘干，再置于温度为22 ℃，相对湿度为RH60%的恒温恒湿箱内平衡48 h，实施例12采用多次用水洗涤烟末至中性，烘干，再置于温度为22 ℃，相对湿度为RH60%的恒温恒湿箱内平衡48 h，实施例13采用多次洗涤烟末至中性，烘干，置于温度为22 ℃，相对湿度为RH60%的恒温恒湿箱内平衡48 h后再与NH₃密封容器中平衡1 h，实施例14采用空瓶直接加标准物质。通过以上实施例的实施，结果表明：采用实施例11的方法处理简单，氘代甲苯信号式中，游离烟碱的游离程度较高。结果如表8所示。

实施例15

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

固相微萃取材料采用聚二甲基硅氧烷，非键合，材料膜厚为100 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，其选择性较差，杂质干扰较多，氘代甲苯信号相对偏低。

实施例16

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

固相微萃取材料采用聚二甲基硅氧烷，键合，材料膜厚为7 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，其选择性较差，杂质干扰较多，氘代甲苯和游离烟碱信号显著降低，表明萃取材料对游离烟碱萃取容量小，当用于高游离烟碱含量样品分析时，存在过载现象。

实施例17

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

固相微萃取材料采用聚丙烯酸酯，部分交联，材料膜厚为85 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，其选择性较好，但对游离烟碱和氘代甲苯的萃取效率较低。

实施例18

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

固相微萃取材料采用聚乙二醇/苯乙烯，部分交联，材料膜厚为65 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，游离烟碱色谱峰拖尾严重，选择性适中，萃取效率较高。

实施例19

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

固相微萃取材料采用碳分子筛/聚二甲基硅氧烷，部分交联，材料膜厚为75 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，对氘代甲苯萃取选择性优异，氘代甲苯信号拖尾，而对游离烟碱的萃取效率适中。

实施例20

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

固相微萃取材料采用聚苯乙烯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷，高度交联，材料膜厚为50/30μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，对氘代甲苯萃取选择性优异，氘代甲苯信号拖尾，而对游离烟碱的萃取效率适中，游离烟碱信号峰拖尾严重。

实施例21～25

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

采用不同溶剂用量，以考察溶剂对氘代甲苯和游离烟碱萃取效率的影响，实施例21采用3 μL环己烷，实施例22采用4 μL环己烷，实施例23采用5 μL环己烷，实施例24采用6 μL环己烷，实施例25采用7 μL环己烷，结果如表9所示。

通过以上实施例的实施，结果表明：环己烷用量对游离烟碱的萃取效率无显著影响，对氘代基本信号影响较大，但均无溶胀现象发生。

实施例26～39

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

采用同一烟末样品，同时制备等质量的14份，对样品依次采用不同平衡时间，以考察游离烟碱和质子态烟碱是否达到平衡，以确定测定数据的科学性。实施例26采用2 min，实施例27采用5 min，实施例28采用10 min，实施例29采用20 min，实施例30采用40 min，实施例31采用1 h，实施例32采用1.5 h，实施例33采用2 h，实施例34采用3 h，实施例35采用4 h，实施例36采用8 h，实施例37采用14 h，实施例38采用48 h，实施例39采用72 h。

通过实施例26～39的实施，结果表明：在30 ℃平衡2 h之后，游离烟碱和氘代甲苯的响应峰面积达到平台，表明游离烟碱和氘代甲苯在烟末和气相中已达到平衡，并且在48 h内保持稳定，72 h后，氘代甲苯信号呈现衰减。如表10所示。

实施例40～43

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

采用同一烟末样品，同时制备等质量的4份，对采用不同萃取温度，以考察不同温度对氘代甲苯和游离烟碱测定结果的影响。实施例40采用40 ℃，实施例41采用37 ℃，实施例42采用50 ℃，实施例43采用60 ℃。

通过实施例40～43的实施，结果表明：随着温度的升高，游离烟碱的萃取量在显著增加，内标氘代甲苯的量也在不同程度的下降，考虑到样品存放温度为室温温度，因此本方法采用自动固相微萃取进样器的最低使用温度为游离烟碱的测定温度。结果如表11所示。

实施例44～49

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

采用不同萃取时间，考察萃取时间对氘代甲苯和游离烟碱测定结果的影响，实施例44采用120 s萃取时间，实施例45采用300 s萃取时间，实施例46采用600 s萃取时间，实施例47采用1800 s萃取时间，实施例48采用3600 s萃取时间，实施例49采用6000 s萃取时间。

通过以上实施例44～49的实施，结果如表12所示，结果表明：在1800 s萃取时间内，氘代甲苯和游离烟碱萃取量达到最大萃取时间（6000 s）同一数量级范围，其灵敏度也满足分析要求，考虑到样品游离烟碱含量的差异，萃取材料必须有足够的冗余以分析高游离烟碱含量的样品，因此，选择1800 s为最佳萃取时间。

实施例50～56

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

采用不同的脱附时间，考察氘代甲苯和游离烟碱在萃取材料的脱附效率，避免游离烟碱在萃取材料上的残余，实验采用某高游离烟碱含量的样品进行。实施例50采用10 s脱附时间，实施例51采用20 s脱附时间，实施例52采用50 s脱附时间，实施例53采用100 s脱附时间，实施例54采用200 s脱附时间，实施例55采用500 s脱附时间，实施例56采用1000 s脱附时间。

通过以上实施例50～56的实施，结果如表13所示，结果表明：20 s脱附时间可以满足分析要求。

实施例57

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

在样品萃取进样后，实验采用进样后高纯氮气流洗脱方式洗脱，压力设定为0.2 MPa，使用推荐洗脱温度250 ℃，洗脱时间设定为15 min，为了考察洗脱效率，在测定实际样品后，进行空白检验，结果表明，本洗脱方法无残留。

实施例58

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

为了考察不同类型的内标物对游离烟碱测定结果的影响，实验选取了氘代非极性内标，氘代极性内标，氘代同系物内标和外标法进行实施，考察不同内标的实施效果。实施例58采用氘代甲苯为内标，实施例59采用氘代吡啶为内标，实施例60采用氘代甲醇为内标，实施例61采用外外标法。通过以上实施例的实施，结果表明：氘代甲苯的加入量不影响游离烟碱的游离量，氘代吡啶的加入量的多少对游离烟碱游离量的有较大影响，氘代甲醇对烟碱的游离量影响最为显著，使用外标法对游离烟碱的计算结果与采用氘代甲苯为内标的内标法计算结果基本吻合。

实施例62

按照实施例1进行实施，并在以下方面做相应调整：

本实施例考察了不同分析毛细管柱对待测组分分离效果的影响，选取了低极性HP-5MS毛细管柱，规格为：30 m×0.25 mm×0.25 μm，实验结果表明：氘代甲苯峰型较差，且样品中水分存在对低极性毛细管柱液膜损伤的可能。

Claims (2)

1.一种烟草及烟草制品中游离烟碱的测定方法，包括以下步骤：

（1）标准工作曲线的绘制

①空白样品的制备：将50 g烟丝磨成粉末，加入1 L浓度2%的 NaOH水溶液超声提取1 h，重复提取5次，每次提取完毕后，用纱布过滤提取液，将滤得的烟末进行下一次提取；提取完成后将烟末烘干至10%～15%的含水率，再将烟末放入温度为22 ℃，相对湿度为RH60%的恒温恒湿箱中平衡48 h，得到空白烟末样品；

②标准溶液的配制：以正己烷为溶剂配制浓度为100 g/L、50 g/L、25 g/L、10 g/L、5 g/L、1 g/L的烟碱标准溶液；以正己烷为溶剂配制浓度为10 g/L及5 g/L的氘代甲苯溶液；

③标准曲线的建立：取6个棕色顶空瓶，每个顶空瓶中放置0.2 g的空白烟末样品，分别准确加入1 μL浓度为10 g/L的氘代甲苯溶液，再分别准确加入1 μL浓度为100 g/L、50 g/L、25 g/L、10 g/L、5 g/L、1 g/L的烟碱标准溶液，立即密封后将烟末混合均匀；将6个顶空瓶在30 ℃平衡2 h后进行分析测试；将6个样品的游离烟碱与氘代甲苯的响应值比与烟碱的浓度进行线性回归，得到标准工作曲线，曲线不强制归零，线性相关系数R²须大于0.999；

（2）待测样品的准备

①将待测烟草样品粉碎成粉末，将样品烟末放入温度为22 ℃，相对湿度为RH60%的恒温恒湿箱平衡48 h；

②称取0.200 g待测样品烟末置于20 mL棕色顶空瓶中，加入2 μL浓度为5 g/L的氘代甲苯溶液，立即密封后混合均匀，在30 ℃条件下平衡2 h后，进行游离烟碱的分析测试；

（3）游离烟碱仪器分析条件

①固相微萃取针：

萃取材料为：聚二甲基硅氧烷/苯乙烯材料，部分交联，材料膜厚为65 μm；

②固相微萃取条件：

预平衡温度：30 ℃，预平衡时间：600 s，萃取时间：1800 s，脱附时间：20 s，洗针时间：900 s，洗针温度：250 ℃，洗针气体：纯度≥99.999%的高纯氮气，洗针压力设置为：0.2 Mpa；

③色谱分析条件：

以纯度≥99.999%的氦气为载气，恒流模式，流量为1.5 mL/min；进样口温度设定为250 ℃；采用分流进样方式，分流比为40:1，程序升温条件为初始温度50 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至210 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至240 ℃，保持3 min；

④质谱分析条件：

电离方式采用电子轰击源，电离能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；传输线温度为250 ℃；游离烟碱定量离子为84，辅助定量离子为133和162，氘代甲苯的定量离子为98，辅助定量离子为100和70；

（4）分析结果计算

记录测试样品游离烟碱及氘代甲苯的响应值，根据步骤1所建立的标准曲线，计算得出样品中游离烟碱的含量。

2.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中游离烟碱的测定方法，其特征在于：所述的待测烟草样品为成品卷烟除去卷烟纸、水松纸和卷烟滤棒后得到的纯烟丝。