CN114577915B

CN114577915B - 一种烟液中游离态和质子态烟碱含量的测定方法

Info

Publication number: CN114577915B
Application number: CN202011376450.2A
Authority: CN
Inventors: 卢乐华; 高峄涵; 谢焰
Original assignee: Shanghai Tobacco Group Co Ltd; Shanghai New Tobacco Products Research Institute Co Ltd
Current assignee: Shanghai Tobacco Group Co Ltd; Shanghai New Tobacco Products Research Institute Co Ltd
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN114577915A

Abstract

本发明公开了一种烟液中游离态和质子态烟碱含量的测定方法，其特征在于，包括中性水制备步骤、样品处理步骤、定量分析步骤。在样品处理步骤中，烟液样品经过一次萃取得到第一有机相溶液和第一水相溶液，对第一水相溶液进行多次萃取后得到第二有机相溶液，采用气相色谱‑质谱联用仪分别对第一有机相溶液和第二有机相溶液的烟碱含量进行测定，得到烟液样品的游离态烟碱含量和质子态烟碱含量。本发明提供的方法在测定过程中能够保持游离态烟碱和质子态烟碱在样品体系中的稳定，能够稳定可靠地测定电子烟烟液中游离烟碱和质子态烟碱含量。

Description

一种烟液中游离态和质子态烟碱含量的测定方法

技术领域

本发明涉及化学分析领域，特别涉及一种电子烟烟液中游离态和质子态烟碱含量的测定方法。

背景技术

烟碱是一种易挥发的弱二级碱，易与无机酸和多种有机酸结合形成盐。烟碱在电子烟的烟液及烟液加热后生成的气溶胶中能够以游离态、单质子态或双质子态存在。近年来，电子烟烟液中开始使用烟碱盐技术，该技术采用有机酸-烟碱复合盐形成质子态烟碱盐，其中烟碱主要以质子化形态存在，使得高烟碱含量也能具有适中的刺激性和击喉感，突破了游离态烟碱的添加量限制，获得了接近传统卷烟的感官体验和生理满足感。可见，游离态烟碱和质子态烟碱在感官质量上体现出显著差异，因此，如何区分电子烟烟液中的游离态烟碱和质子态烟碱，并分别进行定量测定，是评价烟碱和烟碱盐在电子烟烟液中功效作用的关键。现有烟碱形态测定方法主要分为两类：

1.间接推导法，如基于Henderson–Hasselbalch方程的pH推导法、核磁共振法(¹HNMR)。pH推导法中，pH值测定过程会受到水作为稀释溶剂的酸碱性、溶解于水中的CO₂的影响，以及样品基质(或者说样品组成的酸碱性)、Henderson–Hasselbalch方程推导和计算过程的影响；NMR法虽然避免了测定过程的溶剂引入，但数学推导过程复杂，不同的数学计算模型所得到的结果也有明显差异。

2.直接测定法，如固相微萃取法、液液萃取法。固相微萃取法(SPME)基于游离态和质子态烟碱的挥发性差异进行测定。然而，游离态烟碱和质子态烟碱并没有明显的挥发温度界限，在萃取温度下，二者是否达到完全分离、或是否形态发生转化无法得到有效评估，从而导致固相微萃取法测定结果不准确。液液萃取法基于游离态烟碱和质子态烟碱的疏水性差异分别测定。测定过程需引入水和有机溶剂，水中溶解的CO₂、水自身的酸碱性以及有机溶剂的疏水性能，都会对样品体系的酸碱平衡产生影响，导致烟碱在游离态和质子态之间发生转化，从而影响烟碱形态分布的真实性。

有研究将液液萃取法进行改良，通过多次萃取提高方法的萃取效率。但萃取时导致电子烟烟液中的香精成分从水相中带走，如果香精成分具有酸碱性，则在二次萃取时改变了水相体系的酸碱性，促使质子态烟碱向游离态转化，从而导致测定时的游离态烟碱含量偏高。可见，烟碱形态在烟液中并非始终处于稳定状态，而是在酸碱平衡条件下保持一种动态平衡。当酸碱平衡被打破，游离态和质子态之间发生转化，将改变烟液体系中烟碱的原始形态分布。因此，如何维持样品测定过程的酸碱平衡稳定，从而实现准确测定电子烟烟液中的游离态和质子态烟碱的含量的目的，成为电子烟中烟碱功效评价的重要课题。

发明内容

本发明的目的在于解决传统测定方法影响因素多、测定不准确、结果无法真实反映样品烟碱形态分布的问题。为解决上述技术问题，本发明公开了一种烟液中游离态和质子态烟碱含量的测定方法，包括中性水制备步骤、样品处理步骤、定量分析步骤。所述中性水制备步骤是将去离子水煮沸后加盖密封并冷却至室温，在进行样品处理步骤前即时利用稀酸液或稀碱液将pH值调节至中性，得到中性水；特别地，每批次样品处理，均需重新制备中性水。在所述样品处理步骤中，称取烟液样品，向烟液样品中加入中性水、内标物、萃取剂进行一次萃取，分离得到第一有机相溶液和第一水相溶液。特别地，烟液样品在得到第一水相溶液前只萃取一次，由于烟液中具有酸碱性的香精成分被第一有机相溶液带走，第一水相溶液酸碱平衡被打破，质子态烟碱向游离态转化，因此当萃取次数大于一次时，可能将部分质子态烟碱萃取至第一有机相溶液中，造成测定误差。向第一水相溶液加入碱性溶液、内标物、萃取剂后，进行多次萃取，将多次萃取中每次得到的有机相溶液进行合并，从而得到第二有机相溶液。在所述定量分析步骤中，采用气相色谱-质谱联用仪对所述第一有机相溶液的烟碱含量进行测定，从而得到烟液样品的游离态烟碱含量；采用气相色谱-质谱联用仪对所述第二有机相溶液的烟碱含量进行测定，从而得到烟液样品的质子态烟碱含量；最终还可通过将游离态烟碱含量和质子态烟碱含量相加得到烟碱的总含量。

上述技术方案通过保持样品处理过程中体系酸碱平衡的稳定，避免了样品处理过程中引入的因素使酸碱平衡发生变化导致游离态和质子态烟碱发生相互转化，从而影响测定结果的准确性。随后，在保持样品体系酸碱平衡稳定的前提下，分别萃取电子烟烟液中的游离态烟碱和质子态烟碱，准确测定游离态烟碱和质子态烟碱的含量。该技术方案能够稳定、可靠地测定电子烟烟液中游离态烟碱和质子态烟碱的含量，为电子烟烟液中不同形态烟碱的分布提供定量评价方法，为烟碱提供的生理满足感功效评价提供新的思路和定量表征手段。

进一步地，对第一水相溶液进行萃取的次数为两次。当萃取次数大于两次时，测定结果与进行两次萃取的结果无明显差别。

进一步地，在所述定量分析步骤前，所述测定方法还包括绘制标准工作曲线步骤。将烟碱标准溶液与内标物、萃取剂混合配置成浓度的线性范围为0.1～500.0μg/mL的至少6个标准工作溶液，然后采用气相色谱-质谱联用仪测定标准工作溶液的烟碱含量，并拟和曲线方程得到烟碱含量的标准工作曲线。

可选地，标准工作溶液的浓度的线性范围为1.0～100.0μg/mL。

其中，烟碱标准溶液是指具有某一浓度的烟碱溶液。例如，在本申请中采用烟碱的异丙醇溶液的市售产品，具体可以为市售的4000μg/mL的烟碱的异丙醇溶液。这是因为电子烟烟液及其中的烟碱能够更稳定地溶解于异丙醇水溶液中。

进一步地，在中性水制备步骤中，稀酸液选自于小分子酸，包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸中的一种或多种，稀碱液包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水溶液中的一种或多种，且稀酸液或稀碱液的浓度不超过0.01mol/L。由于水本身可能是酸性，也可能是碱性，所以调节时可以根据具体情况选择稀酸液或是稀碱液。而由于水的pH值已接近中性，因此所选用的稀酸液或稀碱液的浓度不宜过高。

进一步地，在所述样品处理步骤中，碱性溶液包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水溶液中的一种或多种，并且碱性溶液的浓度为0.1～5.0mol/L，优选为氢氧化钠溶液。

可选地，碱性溶液为1.0mol/L的氢氧化钠溶液，该技术方案能够确保质子态烟碱完全转化成游离态，并适当减少碱性溶液的添加量。

进一步地，本申请内标物的选择应满足以下要求：1)挥发或半挥发性物质，具有良好的气相色谱行为；2)不溶于水，易溶于疏水性有机溶剂；3)在气相色谱上与烟碱有良好的分离度；4)不受样品基质成分干扰，尤其是不受烟液雾化溶剂(如丙二醇、甘油)和主要香精组分的干扰。因此，内标物选自于C10～C30的直链烷烃，其浓度为10～100μg/mL。

可选地，内标物为正十七烷，正十七烷的浓度为50μg/mL。

进一步地，萃取剂为为强疏水性溶剂，包括但不限于二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、正己烷、叔丁基甲基醚中的一种或多种，加入烟液样品中的中性水和萃取剂的体积比为1:1～1:10，优选1:1～1:2，更优选为1:1。

进一步地，本申请的气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，配置自动进样系统和电子轰击电离源(EI)。

进一步地，色谱柱采用极性或非极性毛细管色谱柱，固定相为聚乙二醇或聚硅氧烷或其他类似键合固定相，色谱柱的柱长为15～30m，内径为0.25～0.53mm，膜厚0.10～0.50μm。可选地，色谱柱以聚乙二醇、聚硅氧烷固定相，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm。

进一步地，在采用气相色谱-质谱联用仪的升温程序中，分流进样，选择离子扫描(SIM)。

进一步地，采用气相色谱-质谱联用仪分析时，样品中目标物和内标物保留时间应与标准工作溶液一致。所选定量和定性离子均出现，且丰度比与标准品丰度比一致。因此，当相对丰度＞50％时，允许±10％偏差；相对丰度在20％～50％之间时，允许±15％偏差；相对丰度在10％～20％之间时，允许±20％偏差；相对丰度＜10％时，允许±50％偏差。

本发明具有以下优点：

1、直接测定烟液中的游离态和质子态烟碱含量，不经过其他数学推导过程。测定准确，方法稳健，干扰因素少。

2、稀释溶剂去离子水的中性化处理消除了水中CO₂及酸碱性影响，避免水对样品体系酸碱平衡的影响，提高了测定结果的可靠性。

3、游离态烟碱单次萃取确保样品体系酸碱平衡稳定，避免因样品中的香精成分在第一次萃取时被有机溶剂提取，从而改变水相体系的香精组成、酸碱平衡发生变化，以及在第二次萃取时质子态烟碱向游离态转化，导致测定结果失真。

4、疏水性有机溶剂与水互不相溶，对丙二醇、甘油等电子烟烟液雾化溶剂的溶解性低，萃取溶液干净，避免样品基质对测定仪器的污染或干扰测定。

5、气相色谱-质谱联用仪灵敏度高、选择性好、线性范围宽，对游离态和质子态烟碱含量差异显著的烟碱盐型电子烟烟液样品具有良好的适用性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地说明：

图1示出本发明实施例1的标准工作溶液色谱图；

图2示出本发明实施例1中样品1的市售烟液样品色谱图；

图3示出本发明实施例1中样品1的游离态烟碱两次萃取中的香精组分变化色谱图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。虽然本发明的描述将结合较佳实施例一起介绍，但这并不代表此发明的特征仅限于该实施方式。恰恰相反，结合实施方式作发明介绍的目的是为了覆盖基于本发明的权利要求而有可能延伸出的其它选择或改造。为了提供对本发明的深度了解，以下描述中将包含许多具体的细节。本发明也可以不使用这些细节实施。此外，为了避免混乱或模糊本发明的重点，有些具体细节将在描述中被省略。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

应注意的是，在本说明书中，相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

在本文中，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

如果体积、温度、时间、质量或其他数值或参数是以范围、优选范围、较佳范围或一系列上限与下限表示，则其应理解成是本文已特定公开了由任意一对该范围的上限或优选值或较佳值与该范围的下限或优选值或较佳值构成的所有范围，不论这些范围是否有分别公开。此外，本文中若提到数值的范围时，除非另有说明，否则该范围应包括其端点以及范围内的所有整数与分数。

在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)，特别是整数数值。举例而言，“1.0至8.0”的范围描述应视为已经具体公开如1.0至7.0、2.0至8.0、2.0至6.0、3.0至6.0、4.0至8.0、3.0至8.0等等所有次范围，特别是由整数数值所界定的次范围，且应视为已经具体公开范围内如1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0等个别数值。同理，“介于1至8之间”的范围描述应视为已经具体公开如1至8、1至7、2至8、2至6、3至6、4至8、3至8等等所有范围，且应视为涵盖端点值。除非另有指明，否则前述解释方法适用于本发明全文的所有内容，不论范围广泛与否。

若X描述成“选自于由X1、X2及X3所组成的群组”，且Y描述成“选自于由Y1、Y2及Y3所组成的群组”，则表示已经完全描述出X为X1及/或X2及/或X3而Y为Y1及/或Y2及/或Y3的主张。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。

本申请的实施方式公开了一种烟液中游离态和质子态烟碱含量的测定方法，具体包括下述步骤：

中性水制备步骤：

将去离子水煮沸后加盖密封并冷却至室温，在进行样品处理步骤前即时利用稀酸液或稀碱液将pH值调节至中性，得到中性水。特别地，每批次样品处理，均需重新制备中性水。该步骤消除了水中CO₂及酸碱性影响，避免水对样品体系酸碱平衡的影响，提高了测定结果的可靠性。

绘制标准工作曲线步骤：

称取烟碱标准溶液，稀释得到烟碱标准储备液，取烟碱标准储备液和内标物，加入萃取剂配置成线性范围为0.1～500.0μg/mL的至少6个标准工作溶液，如果不马上使用，需要避光保存。其中，标准工作溶液的线性范围优选为1.0～100.0μg/mL。然后采用气相色谱-质谱联用仪测定标准工作溶液的烟碱含量，并拟合曲线方程得到烟碱含量的标准工作曲线。

样品处理步骤：

称取烟液样品，该样品应为液体，烟液的样品形式包括但不限于储油棉、烟弹、瓶装液体，具体可以由储油棉、烟弹等样品形式应通过挤压、注射针等方式取样获得；向烟液样品中加入中性水、内标物、萃取剂进行一次萃取，分离得到第一有机相溶液和第一水相溶液；向第一水相溶液加入碱性溶液、内标物、萃取剂后，进行多次萃取，将多次萃取中每次得到的有机相溶液进行合并，从而得到第二有机相溶液。该步骤对游离态烟碱采用单次萃取确保样品体系酸碱平衡稳定，避免因样品中的香精成分在第一次萃取时被有机溶剂提取，从而改变水相体系的香精组成、酸碱平衡发生变化，并避免质子态烟碱向游离态转化，导致测定结果失真。具体地，对第一水相溶液进行萃取的次数可具体为两次。

定量分析步骤：

采用气相色谱-质谱联用仪对所述第一有机相溶液的烟碱含量进行测定，从而得到烟液样品的游离态烟碱含量；采用气相色谱-质谱联用仪对所述第二有机相溶液的烟碱含量进行测定，从而得到烟液样品的质子态烟碱含量。烟碱的总含量可通过上述步骤中测定的游离态烟碱含量和质子态烟碱含量相加得到。气相色谱-质谱联用仪灵敏度高、选择性好、线性范围宽，对游离态和质子态烟碱含量差异显著的烟碱盐型电子烟烟液样品具有良好的适用性。

本申请的实施方式提供的测定方法通过保持样品处理过程中体系酸碱平衡的稳定，避免因样品前处理过程引入的因素使酸碱平衡发生变化导致游离态和质子态烟碱发生相互转化，从而影响测定结果的准确性。随后在保持样品体系酸碱平衡稳定的前提下，分别萃取电子烟烟液中的游离态烟碱和质子态烟碱，准确测定游离态烟碱和质子态烟碱的含量。该技术方案能够稳定、可靠地测定电子烟烟液中游离态烟碱和质子态烟碱的含量，为电子烟烟液中不同形态烟碱的分布提供定量评价方法，为烟碱提供的生理满足感功效评价提供新的思路和定量表征手段。

进一步地，在本申请的任意实施方式中：

中性水制备步骤中，稀酸液选自于小分子酸，包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸中的一种或多种。稀碱液包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水溶液中的一种或多种。稀酸液或稀碱液的浓度不超过0.01mol/L。由于水本身可能是酸性，也可能是碱性，所以调节时可以根据具体情况选择稀酸液或是稀碱液。而由于水的pH值已接近中性，因此所选用的稀酸液或稀碱液的浓度不宜过高。

在样品处理步骤中，碱性溶液包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水溶液中的一种或多种，并且碱性溶液的浓度为0.1～5mol/L；具体地，碱性溶液为1.0mol/L的氢氧化钠溶液，以确保质子态烟碱完全转化成游离态，并适当减少碱性溶液的添加量。

内标物选自于C10～C30的直链烷烃，浓度为10～100μg/mL，优选浓度为50μg/mL的正十七烷；

萃取剂为强疏水性溶剂，疏水性有机溶剂与水互不相溶，对丙二醇、甘油等电子烟烟液雾化溶剂的溶解性低，萃取溶液干净，避免样品基质对测定仪器的污染或干扰测定。在本申请的任意实施方式中，萃取剂包括但不限于二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、正己烷、叔丁基甲基醚中的一种或多种，优选为二氯甲烷。

加入烟液样品中的中性水和萃取剂的体积比为1:1～1:10，优选1:1～1:2，更优选为1:1。

气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)的分析条件如下：

配置自动进样系统和电子轰击电离源(EI)；

色谱柱：采用极性或非极性毛细管色谱柱，固定相为聚乙二醇或聚硅氧烷或其他类似键合固定相，色谱柱柱长15～30m，内径0.25～0.53mm，膜厚0.10～0.50μm。在本申请的一个实施例中，色谱柱以聚乙二醇为固定相，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm。

升温程序中，分流进样，选择离子扫描(SIM)。

样品中目标物和内标物保留时间应与标准工作溶液一致。所选定量和定性离子均出现，且丰度比与标准品丰度比一致。因此，当相对丰度＞50％时，允许±10％偏差；相对丰度在20％～50％之间时，允许±15％偏差；相对丰度在10％～20％之间时，允许±20％偏差；相对丰度＜10％时，允许±50％偏差。

实施例1

(一)该实施例使用的试剂如下：

二氯甲烷(色谱纯，TEDIA公司)；

丙二醇、甘油(USP级，国药集团化学试剂有限公司)；

去离子水：纯水机制备；

氢氧化钠(AR，上海凌峰化学试剂有限公司)；

正十七烷(≥98.5％，北京百灵威科技有限公司)；

烟碱标准溶液(4000μg/mL异丙醇溶液，上海安谱科技有限公司)；

水杨酸烟碱盐(实验室自制)；

5款市售电子烟烟液样品。

(二)该实施例使用的仪器如下：

Milli-Q50超纯水仪(美国Millipore公司)；

电子天平(梅特勒-托利多公司，CPE205，感量0.01mg)；

气相色谱-质谱联用仪(7890A/5975B GC-MS，美国安捷伦公司)；

多管式涡旋振荡仪(上海安谱科技有限公司)；

低速多管式离心机(无锡瑞江分析仪器有限公司)。

(三)测定过程如下：

(1)中性水制备步骤

取去离子水，煮沸约20分钟，加盖密封后冷却至室温。使用前以0.01mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.00±0.02。

(2)绘制标准工作曲线步骤

将4000μg/mL的烟碱标准溶液配制浓度为400μg/mL的烟碱标准储备液。取一定体积量的烟碱标准储备液和内标物(见表1)，用二氯甲烷萃取剂稀释配制6个曲线浓度的标准工作溶液，标准工作溶液浓度的线性范围为1.0～100μg/mL。避光保存。采用气相色谱-质谱联用仪测定所述标准工作溶液的烟碱含量，并拟合曲线方程得到烟碱含量的标准工作曲线。

表1标准工作溶液配制

(3)样品处理步骤

选取5款烟碱盐型市售电子烟烟液，准确称取电子烟烟液0.2±0.01g，分别加入10mL中性水、50μL正十七烷内标物和10mL二氯甲烷萃取剂，涡旋混合萃取30分钟，2500rpm离心10分钟，分离得到第一有机相溶液和第一水相溶液，取出第一有机相溶液于2mL色谱瓶；

取第一水相溶液，分别加入1mL、1.0mol/L的氢氧化钠溶液、50μL正十七烷内标物和10mL二氯甲烷萃取剂，涡旋萃取30分钟，2500rpm离心10分钟。取出上层水相，按照相同步骤进行二次萃取。分别取两次萃取的有机相于2mL色谱瓶。

(4)定量分析步骤

①该实施例的仪器条件如下：

色谱柱：DB-wax(250℃:30m×0.25mm×0.25μm)；

升温程序：100℃保持1min，5℃/min升至180℃，保持5min，30℃/min升至240℃，保持5分钟；

进样量：1.0μL；分流比：50:1；载气：氦气(He)，流速1.0mL/min；

进样口温度：240℃；传输线温度：240℃；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；

溶剂延迟时间：10.0min；

全扫描(SCAN)模式：选择定性、定量离子及离子比例；

选择离子扫描(SIM)模式：样品定量测定。

②通过试剂中所述的烟碱标准溶液及正十七烷进行全扫描(SCAN)分析，得到烟碱标准溶液和正十七烷的定性、定量离子及相应比例。结果见表2：

表2烟碱和正十七烷定性、定量离子选择

目标化合物	定量离子(m/z)	定性离子(m/z)	离子比例
				烟碱	84	133,162	100：40：22
正十七烷	57	71,85	100：80：60

③测定烟碱含量

游离态烟碱含量：采用气相色谱-质谱联用仪对上述第一有机相溶液的烟碱含量进行测定，从而得到烟液样品的游离态烟碱含量；

质子态烟碱含量：采用气相色谱-质谱联用仪对上述第二有机相溶液的烟碱含量进行测定，从而得到烟液样品的质子态烟碱含量；

烟碱总量：通过将游离态烟碱含量和质子态烟碱含量相加得到烟碱的总含量。

实施例1测定的5款市售电子烟烟液样品的测定结果如表3所示：

表3样品含量测定

表3结果显示，不同的烟液样品，烟碱总量和质子态烟碱比例也不同。烟碱总量相似的烟液，质子态烟碱的比例也不一致。烟碱在不同电子烟烟液中的形态分布量呈现显著的差异性。

对于该方法效果的评价

(1)线性范围

按照实施例1的方法配制6个浓度的标准工作溶液，以各目标物的峰面积/内标物的峰面积之比与目标物浓度进行线性回归分析，得到检验的标准工作曲线。采用本申请的方法，在不同时间运行6个浓度的标准工作溶液，各进行3次平行测定，得到的线性回归方程和相关系数见表4。

表4线性回归方程和相关系数

由表4可知，不同时间运行的烟碱标准工作曲线斜率一致，线性关系良好，相关系数R²均大于0.995。说明本发明在1.0～100.0μg/mL的线性范围内线性稳定，线性范围宽，具有良好的方法适用性。能够测定不同类型电子烟烟液中恒量和微量的烟碱，为电子烟中烟碱形态分布、烟碱盐的实际存在形态和功效评价提供定量表征的手段。

(2)检出限与定量限

以丙二醇和甘油为雾化溶剂，添加一定量的水杨酸烟碱盐，配制烟碱盐型电子烟烟液样品6，总烟碱浓度约为1.28mg/mL。

按照实施例1的方法测定上述样品。计算烟碱的信噪比(S/N)，以3倍信噪比为方法检出限(LOD)，10倍信噪比为方法定量限(LOQ)。

表5方法的检出限与定量限

结果显示，烟碱的浓度检出限能够达到纳克级。换算至样品质量检出限(μg/g)，也小于0.1μg/g。说明本发明方法灵敏度高，适用于烟碱盐型电子烟烟液中质子态含量高、游离态含量低的情况，能够同时在高、低浓度下准确测定烟碱浓度。

(3)精密度

以丙二醇和甘油为雾化剂，添加一定量的水杨酸烟碱盐，配制烟碱盐型电子烟烟液样品7，总烟碱浓度约为20.0μg/mL。

按照实施例1的方法，运行6个浓度的标准工作溶液，并按前述样品处理步骤对该述样品7进行处理，每个样品平行测定6次，计算测定结果的精密度。

表6方法精密度

如表6所示，烟碱盐型电子烟烟液中的烟碱主要以质子形态存在，游离态烟碱含量在曲线最低点浓度附近。考察6次平行测定的游离态和质子态烟碱含量可知，在低浓度(游离态烟碱)和中等浓度(质子态烟碱)下，测定相对标准偏差(RSD)分别为6.45％和5.13％。方法精密度、稳定性良好，测定结果准确，满足不同浓度下的烟碱定量需求。

(4)回收率

选取一款不含烟碱的香精样品8，分别在样品中加入10μg/mL和50μg/mL的游离态烟碱，得到低浓度和中等浓度的游离态烟碱加标溶液。按照所述样品处理步骤对该游离态烟碱加标溶液进行处理，并按照所述定量分析步骤测定第一有机相溶液中的游离态烟碱含量。

同样，选取一款不含烟碱的香精样品9，分别在样品中加入烟碱浓度为10μg/mL和50μg/mL的水杨酸烟碱盐溶液，得到低浓度和中等浓度的质子态烟碱加标溶液。按照所述样品处理步骤对该质子态烟碱加标溶液进行处理，并按照上述定量分析步骤测定第二有机相溶液中的质子态烟碱含量。

根据测定结果，计算游离态烟碱和质子态烟碱萃取过程的加标回收率。

表7样品加标回收率

	烟碱加标浓度(μg/mL)	游离态烟碱回收率(％)	质子态烟碱回收率(％)
				烟液+低浓度	10	104.65	105.63
烟液+中浓度	50	97.97	100.97

表7结果显示，在烟液样品中，不同浓度下的游离态烟碱和质子态烟碱加标回收率均很稳定，方法的萃取效率及测定准确性良好。通过对纯烟碱盐(纯质子态)加标，测定质子态烟碱的回收率，可以证明本发明方法测定质子态烟碱的准确度。良好的回收率说明烟碱盐没有受到萃取溶剂和样品香精基质的影响，保持了整个处理过程中的酸碱平衡稳定，对烟碱盐型电子烟烟液中的游离态和质子态分布进行了准确、可靠的定量评价。

虽然通过参照本发明的某些优选实施方式，已经对本发明进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims

1.一种烟液中游离态和质子态烟碱含量的测定方法，其特征在于，包括下述步骤：中性水制备步骤：将去离子水煮沸后加盖密封并冷却至室温，在进行样品处理步骤前即时利用稀酸液或稀碱液将 pH 值调节至中性，得到中性水；

样品处理步骤：称取烟液样品，向所述烟液样品中加入所述中性水、内标物、萃取剂进行一次萃取，萃取步骤为涡旋混合萃取30分钟，2500rpm离心10分钟，分离得到第一有机相溶液和第一水相溶液；其中加入所述烟液样品中的所述中性水和所述萃取剂的体积比为1:1；向所述第一水相溶液加入碱性溶液、所述内标物、所述萃取剂后，进行多次萃取，萃取步骤为涡旋混合萃取30分钟，2500rpm离心10分钟，将所述多次萃取中每次得到的有机相溶液进行合并，从而得到第二有机相溶液，其中所述萃取剂为二氯甲烷；

定量分析步骤：采用气相色谱-质谱联用仪对所述第一有机相溶液的烟碱含量进行测定，得到所述烟液样品的游离态烟碱含量；采用气相色谱-质谱联用仪对所述第二有机相溶液的烟碱含量进行测定，得到所述烟液样品的质子态烟碱含量；所述气相色谱-质谱联用仪的色谱柱为DB-wax，升温程序为100℃保持1min，5℃/min升至180℃，保持5min，30℃/min升至240℃，保持5分钟。

2.根据权利要求 1 所述的测定方法，其特征在于，对所述第一水相溶液进行萃取的次数为两次。

3.根据权利要求 1 所述的测定方法，其特征在于，在所述定量分析步骤前，所述测定方法还包括绘制标准工作曲线步骤：向烟碱标准溶液中加入所述萃取剂和所述内标物配制成线性范围为0.1~500.0μg/mL的至少6个标准工作溶液；采用气相色谱-质谱联用仪测定所述标准工作溶液的烟碱含量，并拟合曲线方程得到烟碱含量的标准工作曲线。

4.根据权利要求1~3 任一项所述的测定方法，其特征在于，在所述中性水制备步骤中，所述稀酸液选自于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸溶液中的一种或多种；

所述稀碱液选自于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水溶液中的一种或多种；

所述稀酸液或稀碱液的浓度不超过 0.01 mol/L。

5.根据权利要求 1~3 任一项所述的测定方法，其特征在于，在所述样品处理步骤中，所述碱性溶液选自于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水溶液中的一种或多种，并且所述碱性溶液的浓度为 0.1~5.0 mol/L。

6.根据权利要求 5 所述的测定方法，其特征在于，所述碱性溶液为 1.0mol/L 的氢氧化钠溶液。

7.根据权利要求 1~3 任一项所述的测定方法，其特征在于，所述内标物选自于C10~C30 的直链烷烃，所述内标物的浓度为 10~100μg/mL。

8.根据权利要求 7 所述的测定方法，其特征在于，所述内标物为正十七烷，所述正十七烷的浓度为 50μg/mL。

9.根据权利要求 1~3 任一项所述的测定方法，其特征在于，采用所述气相色谱-质谱联用仪分析时，当相对丰度＞50%时，允许±10%偏差；相对丰度在20%~50%之间时，允许±15%偏差；相对丰度在 10%~20%之间时，允许±20%偏差；相对丰度＜10%时，允许±50% 偏差。