CN114113394A - 用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球、制备方法、试剂盒及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球、制备方法、试剂盒及提取方法，本发明的试剂盒以具有核壳结构的双亲性羧基功能化磁性微球为吸附材料，能高效、快速净化处理血浆样本，有效降低百草枯代谢物检测过程中的基质干扰效应，快速、准确检测中毒病人血浆样本中痕量百草枯的四种代谢物的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域，尤其涉及一种用于提取净化百草枯代 谢物的磁性微球、制备方法、试剂盒及提取方法。
背景技术
百草枯是一种快速灭生性除草剂，对人体毒性极大，口服中毒死亡率 高达50％以上，毒性可累及全身多个脏器，可导致多器官功能障碍综合征， 至今尚无特效解毒药。目前，我国虽已禁止百草枯的生产与使用，但由于 管理难度太大，仍有不法商贩在经营销售，尤其出现农药商品名称与实际 成分不一致的现象。如在敌草快和草铵膦农药中非法添加百草枯成分以提 高除草效果，由此造成众多误服中毒的现象，给社会造成了极为严重的不良影响。近年来，因自杀、误服和投毒而引起的百草枯急性中毒事件呈逐 年上升趋势，已成为我国最为主要的中毒致死农药之一。然而，急性百草 枯中毒临床救治研究迄今未获实质性突破，中毒病死率居高不下，已成为 我国急性中毒防治的突出难题，造成这一现状的一个重要原因可能是百草 枯的中毒机制尚未阐明。现有研究多集中于百草枯原型(PQ)，而对其在生 物体内的代谢产物和代谢机理的研究较少，一定程度上导致人们对其中毒 机制认识的片面性。诚然，导致这一现象的一个重要原因可能是百草枯在 人体内的代谢过程复杂，其代谢产物的确证和检测难度大，从而影响了研 究人员对百草枯中毒机制的全面认识。
此外，由于中低剂量百草枯中毒病人潜伏期长，出现临床症状滞后， 随着病程的延长，百草枯在体内可发生代谢反应，临床救治过程中中毒病 人生物样本中百草枯原型常常难以检测到，给救治工作带来了极大的挑战。 多起临床中毒病例血浆样品监测结果表明，经10～15天的病程发展，中毒 病人体内难以检测到百草枯原型，但可以检测到血浆中百草枯的四种代谢 物(monoquat、paraquat monopyridone(MP)、4-carboxy-1-methylpyridiniumion (MINA)和paraquat dipyridone(DP))，代谢途径如图1所示。通过监测血浆中百草枯四种代谢物的浓度，能准确掌控中毒病人所处的阶段，为临床精 准治疗提供强有力的技术支撑。因此，开展生物样本(尤其血浆)中百草 枯代谢产物的准确定量分析，不仅有利于进一步深化对百草枯中毒机制的 认识，对于临床百草枯中毒病例的精准治疗具有重要的科学价值与现实意 义。
目前，关于中毒生物样本中百草枯代谢产物的定量分析研究很少，马 红娟等人论文(马红娟,等.中国法医学杂志,2018,33:586-589)测定了 生物样品中百草枯及其两种代谢物(monoquat和paraquat monopyridone(M P))，而百草枯的代谢物还包含4-carboxy-1-methyl pyridiniumion(MINA) 和paraquat dipyridone(DP)，因此该文献检测对象偏少，不能全面反映百 草枯在人体内的代谢情况。另一方面，该论文在样品前处理过程中，仅简单采用纯水稀释和乙腈沉淀蛋白，难以清除血液样本中高浓度的无机盐和 引起基质干扰效应的磷脂成分，对百草枯代谢物的准确定量分析十分不利， 而且高浓度的无机盐和磷脂成分对于液相色谱-质谱联用仪极其不友好，极 易导致液相色谱进样系统和质谱仪离子源电喷雾针的堵塞，且高浓度磷脂 成分易污染液相色谱柱，导致检测结果准确度和重复性差。因此，研究一 种新的百草枯代谢物的提取净化技术具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的问题是如何开发一种百草枯代谢物的提取净化技 术，提高血浆样品中百草枯代谢物的提取净化回收率。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种用于提取净化百草枯 代谢物的磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
S11、通过溶剂热法制备得到Fe3O4微球；
S12、在磁性Fe3O4微球表面修饰含双键的MPS组分，得到Fe3O4@SiO2-MPS微球；
S13、通过微波辅助沉淀聚合反应，在引发剂作用下，以二乙烯苯、N- 乙烯基吡咯烷酮和4-乙烯基苯甲酸为聚合单体，在Fe3O4微球表面实现羧基 官能化高分子聚合物修饰，制备得到双亲性羧基功能化的磁性微球。
进一步地，所述步骤S3中各原料的用量为：Fe3O4@SiO2-MPS微球1. 2g、二乙烯苯4.8g、N-乙烯吡咯烷酮3.3-8.5g、4-乙烯基苯甲酸1.6-5.2g、A IBN 0.2-0.5g。聚合单体中二乙烯苯为交联剂，用于促进单体聚合成型，N- 乙烯吡咯烷酮为亲水单体，用于改善材料与血浆基质的相容性，4-乙烯基苯 甲酸为功能单体，用于吸附百草枯代谢物。通过在材料表面高密度羧基功 能化修饰，能提高磁性微球对百草枯代谢物的吸附容量，进而提高血浆样 品中目标化合物的提取净化回收率；通过调节材料的亲水单体和功能单体 比例，能有效改善材料与血浆基质的相容性，从而提高净化效率。
进一步地，所述步骤S3具体包括：将Fe3O4@SiO2-MPS微球超声分散 于异丙醇中，将二乙烯苯、N-乙烯吡咯烷酮、4-乙烯基苯甲酸和AIBN溶解 于乙腈中，并加入上述分散液中，微波辅助机械搅拌下，升温至75～80℃， 维持20min，然后快速升温至81～82℃，冷凝回流16h，将反应得到的产 物使用纯水与乙醇清洗，得到双亲性羧基功能化的磁性微球。
本发明方法可以制得用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球，制备过 程中可以根据样品基质类型和目标分析物化学结构特征，灵活调整磁性吸 附材料与样品基质的相容性及对目标分析物的吸附性能；通过在材料制备 过程中引入磁性组分，制得的磁性微球能实现快速固液相磁分离，极大地 提高了样品净化效率。
本发明第二方面提供一种用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球，由 上述的制备方法制得。本发明的磁性微球对于血浆样品中四种百草枯代谢 物均具有很好的吸附效果，可以实现百草枯代谢物的快速提取净化，具有 十分重要的现实意义。
本发明第三方面提供一种试剂盒包括吸附材料分散液，所述吸附材料 分散液中的溶质为上述的用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球。
进一步地，所述吸附材料分散液的溶剂为混合磷酸盐缓冲液，pH为6. 5-9.5。
进一步地，所述吸附材料分散液中磁性微球的浓度为5-20mg/mL。
进一步地，所述试剂盒还包EDTA抗凝管、注射器、标准系列工作溶 液、离心管、洗脱液和复溶液。
本发明的试剂盒适合现场采样，用以针对百草枯中毒紧迫性，百草枯 代谢物变化快的特点，该试剂盒可以配合磁力架、小型涡旋仪即可实现血 浆样品的现场采样、处理与保存，后续只需将预处理样液带回实验室浓缩 与复溶即可检测，大大减少了百草枯代谢物在采样和运输过程中的变化与 损失，提高结果的准确度，为临床精准治疗提供更准确的结果。
本发明第四方面提供一种百草枯代谢物的提取净化方法，使用上述的 试剂盒，所述提取净化方法包括以下步骤：
S21、移取200μL血浆样品于离心管中，加入1.2mL吸附材料分散液， 涡旋提取，随后置于磁力架上磁分离，弃去上清液；
S22、淋洗后加入1.5mL 2％甲酸乙腈溶液洗脱，涡旋提取，磁分离， 收集上清液，氮气吹干；
S23、加入200μL乙腈-水溶液进行复溶，LC-MS进样分析。
进一步地，所述步骤S21中，涡旋提取时间为5-10min；所述步骤S22 中，涡旋提取时间为4-10min。
本发明的百草枯代谢物的提取净化方法采用磁固相萃取法，能在磁场 作用下实现快速的磁分离，省去离心、过滤等耗时操作过程，提高提取净 化速度；由于磁分散固相萃取法能保证吸附剂与样品基质溶液充分接触， 能与目标分析物实现亲密接触以达到完全吸附的目的；且本方法与传统WC X固相萃取柱净化相比，具有更好的去除基质干扰能力，利用本方法无需 采用基质匹配工作曲线或内标法即可实现准确定量分析，减少了基质匹配工作曲线配制过程的繁琐，不使用内标法定量则能大大降低成本。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明设计了能高效、快速净化处理血浆样本的试剂盒，该试剂 盒能有效降低百草枯代谢物检测过程中的基质干扰效应，可以实现快速、 准确检测中毒病人血浆样本中痕量百草枯的四种代谢物的浓度。
(2)本发明的试剂盒以具有核壳结构的双亲性羧基功能化磁性微球为 吸附材料，吸附材料中引入磁性组分，能实现快速固液相磁分离，极大地 提高了样品净化效率。
(3)通过调节磁性微球的亲水单体和功能单体比例，能增加吸附材料 与基质的相容性，合理调配材料表面官能团的密度，减小空间位阻效应， 提高了吸附剂的净化能力。
(4)通过在磁性微球表面高密度羧基功能化修饰，能提高磁性微球对 百草枯代谢物的吸附容量，进而提高血浆样品中目标化合物的提取净化回 收率。
附图说明
图1是百草枯在生物体内可能的代谢途径；
图2是实验例1中磁性微球的透射电子显微镜图像；
图3是实验例1中磁性微球的扫描电子显微镜图像；
图4是实验例1中磁性微球的红外光谱结果；
图5是实验例1中磁性微球的热重-差热分析结果；
图6是实验例2中不同pH缓冲体系对百草枯及其代谢物峰面积的影 响；
图7是实验例3中吸附材料分散液中磁性微球浓度对百草枯及其代谢 物峰面积的影响；
图8是实验例4中提取时间对百草枯及其代谢物峰面积的影响；
图9是实验例4中洗脱时间对百草枯及其代谢物峰面积的影响；
图10是实验例5中不同亲水单体和功能单体比例对提取净化过程中百 草枯及其代谢物峰面积的影响。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附 图对本发明的具体实施例做详细的说明。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于 限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该 范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间 值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也 包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围 内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述 领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方 法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等 同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公 开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时， 以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实 施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本 发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申 请说明书和实施例仅是示例性的。
实施例1磁性微球的制备
本实施例制备一种用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球，该磁性微 球可以提取净化血浆中的四种百草枯代谢物：monoquat、paraquat monopyr idone(MP)、4-carboxy-1-methyl pyridiniumion(MINA)和paraquat dipyrido ne(DP)。
制备方法包括以下步骤：
S11、Fe3O4微球的合成
采用溶剂热法，称取0.3～0.5g柠檬酸钠和0.65～0.85g FeCl3·6H2O于 250mL烧瓶中，加入80mL乙二醇，室温下机械搅拌溶解30min；然后 加入5g乙酸钠并继续搅拌30min；随后，将上述混合溶液装入100mL高 压反应釜中，200℃反应8h，冷却至室温；然后分别用纯水与乙醇清洗3遍， 60℃真空干燥过夜。
S12、Fe3O4@SiO2-MPS微球的合成
将1g磁性Fe3O4微球分散于100mL水和300mL乙醇的混合溶液中； 在氮气保护下，将15mL TEOS-乙醇溶液逐滴加入上述分散液中，TEOS- 乙醇溶液中TEOS体积为3ml；在30℃反应12h；用纯水与乙醇清洗3遍， 得到Fe3O4@SiO2微球。
称取1g Fe3O4@SiO2微球，分散于200mL异丙醇中，边搅拌边加入1 ～2mL三乙胺，氮气保护下，逐滴加入15mL MPS-乙醇溶液，MPS-乙醇 溶液中MPS体积为3～5mL；70℃反应12h；用纯水与乙醇清洗3遍，得 到含双键修饰的Fe3O4@SiO2-MPS微球。
S13、磁性微球的合成
将1.2g Fe3O4@SiO2-MPS微球超声分散于200mL异丙醇中，置于5 00mL三口烧瓶中，机械搅拌10min；将4.8g二乙烯苯、3.3～8.5g N- 乙烯吡咯烷酮、1.6～5.2g 4-乙烯基苯甲酸和0.2～0.5g AIBN溶解于180m L乙腈中，并加入上述分散液中；微波辅助机械搅拌下，升温至75～80℃， 维持20min，然后快速升温至81～82℃，冷凝回流16h；将反应得到的产 物使用纯水与乙醇清洗3遍，制备得到双亲性羧基功能化的磁性微球。
上述方法制备的磁性微球批间差异小，核壳结构显著，耐酸碱能力强。 在聚合过程中采用微波辅助合成技术，能有效促进聚合单体在种子磁核表 面的均匀分布，易制备成核壳结构显著的磁性高分子复合材料，且高分子 壳层的保护有利于提高磁性微球的耐酸碱性。
且该磁性微球可以大大提高血浆中百草枯代谢物的净化效率：根据分 析物结构特点和血浆基质特点，可以通过调节亲水单体和功能单体的比例， 增加了磁性微球与基质的相容性，合理调配材料表面官能团的密度，减小 空间位阻效应，提高磁性微球的净化能力。
实施例2试剂盒
本实施例提供一种试剂盒，用于提取净化百草枯代谢物，试剂盒所用 的吸附材料为实施例1制得的磁性微球。
试剂盒包括EDTA抗凝管、一次性注射器、标准系列工作溶液、吸附 材料分散液、2mL聚丙烯离心管、洗脱液和复溶液。其中吸附材料分散液 的溶质为磁性微球，溶剂为混合磷酸盐缓冲液，pH为6.5-9.5，磁性微球的 浓度为5-20mg/mL，洗脱液为1％～5％甲酸乙腈溶液，复溶液为乙腈水溶液 (体积比为1：1～1：5)。
本实施例的试剂盒配合磁力架、小型涡旋仪即可实现血浆样品的现场 采样、处理与保存，后续只需将预处理样液带回实验室浓缩与复溶即可检 测，大大减少了百草枯及其代谢物在采样和运输过程中的变化与损失，提 高结果的准确度，为临床精准治疗提供更准确的结果。
实施例3血浆样品中百草枯代谢物的提取
本实施例为使用实施例3的试剂盒提取血浆样品中百草枯代谢物的方 法，包括以下步骤：
S21、准确移取200μL血浆样品于2mL聚丙烯离心管中，加入1.2mL 吸附材料分散液，涡旋提取5-10min，随后置于磁力架上磁分离10s，弃去 上清液。
S22、分别用1mL水和1mL甲醇清洗，磁分离10s，弃去上清液；后 加入1.5mL 2％甲酸乙腈溶液洗脱，涡旋提取4-10min，磁分离10s，收集 上清液，40℃下氮气吹干。
S23、加入200μL乙腈-水溶液(1:1,v/v)进行复溶，LC-MS进样分 析。
LC-MS仪器条件如下：
(1)液相条件
采用Syncronis HILIC色谱柱(柱长100mm，柱内径2.1mm，填料 粒径1.7μm)，或相当者进行液相色谱分离，柱温设置40℃，流速0.3mL /min，进样体积5μL。流动相A：20mM甲酸铵-0.25％甲酸水溶液(v/v)， 流动相B：乙腈。梯度洗脱条件：80％B(0.00～2.00min)，80％～15％B(2. 00～2.10min)，15％B(2.10～7.00min)，15％～80％B(7.00～7.01min)，80％B(7.01～10min)。
(2)质谱条件
电喷雾离子源(ESI+)，正离子模式和平行反应监测模式(PRM),电 喷雾电压+3.8kV，脱溶剂气压力275.8kPa，辅助气速率180L/h，射频电 压60％，辅助气加热温度300℃，离子传输管加热温度325℃，分辨率350 00，自动增益控制(AGC Target)1E5，最大注入时间(Maximum IT)10 0ms，质荷比隔离窗口(Isolation window)1.0m/z。其它质谱条件见表1。
表1 百草枯及其代谢物的质谱条件
本实施例的提取净化方法采用磁固相萃取法，能在磁场作用下实现快 速的磁分离，省去离心、过滤等耗时操作过程，提高提取净化速度。且本 方法与传统WCX固相萃取柱净化相比，具有更好的去除基质干扰能力，利 用本方法无需采用基质匹配工作曲线或内标法即可实现准确定量分析，减 少了基质匹配工作曲线配制过程的繁琐，不使用内标法定量则能大大降低 成本。
实验例1磁性微球的表征
分别采用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、红外光 谱仪(FTIR)和热重-差热分析仪(TG-DTG)对实施例1制得的磁性微球 的形貌、组成和结构进行表征，所用磁性微球的制备原料包括1.2g Fe3O4 @SiO2-MPS，4.8g二乙烯苯、4.5g N-乙烯吡咯烷酮、3.5g4-乙烯基苯 甲酸和0.5g AIBN。
透射电子显微镜表征结果如图2所示，双亲性羧基功能化磁性微球具 有明显的核壳结构，球体的尺寸约为600nm，其中灰色的高分子外壳平均 尺寸约为100nm。扫描电子显微镜表征结果如图3所示，可以进一步印证 材料的核壳结构与尺寸。
红外光谱结果如图4所示，1695cm-1可归属为表面官能团羧基的特征 吸收峰，1484cm-1、1509cm-1、1575cm-1和1609cm-1可归属为苯环的骨 架振动吸收峰，587cm-1可归属于内核Fe3O4的特征吸收峰，由此可见，双 亲性羧基功能化磁性微球已成功合成。
为了进一步考察材料的热稳定性能，采用TG-DTG手段进行表征，实 验结果如图5所示，表明该吸附材料能耐受200℃而无明显的质量损失，2 00～600℃的质量损失可归属为材料表面高分子层的热损失(约45％)，600 ～1000℃的质量损失可归属为材料内层SiO2层的热损失(约21％)，约34％ 残余质量为磁性Fe3O4内核。
实验例2缓冲体系pH对吸附性能的影响
实验材料准备：选择三个缓冲体系，分别为pH＝4.00邻苯二甲酸氢钾 缓冲液、pH＝6.86混合磷酸盐缓冲液和pH＝9.18硼砂缓冲液，将实施例1 制得的磁性微球分别分散在上述3种缓冲溶液中，配制成5mg/mL的吸附 材料分散液。所用磁性微球的制备原料包括1.2g Fe3O4@SiO2-MPS，4.8 g二乙烯苯、5.5g N-乙烯吡咯烷酮、4.6g 4-乙烯基苯甲酸和0.2g AIBN。
血浆样品处理：将三种样品置于50mL塑料离心管中，准确移取200 μL血浆加标样本(百草枯及其4种代谢物的加标浓度均为100μg/L)于2 mL聚丙烯离心管中，加入1.2mL吸附材料分散液，涡旋提取5min，随 后置于磁力架上磁分离10s，弃去上清液；然后分别用1mL水和1mL甲 醇清洗，磁分离10s，弃去上清液；然后加入1.5mL 2％甲酸乙腈溶液洗 脱，涡旋提取4min，磁分离10s，收集上清液，40℃下氮气吹干，然后加 入200μL乙腈-水溶液(1:1,v/v)进行复溶，LC-MS进样分析。
实验结果：结果如图6所示，由图6可知，对于百草枯及其四种代谢 物，其峰面积在pH＝4.00缓冲液中较小，而随着缓冲体系pH值的升高峰面 积增大，且pH＝6.86和pH＝9.18两个体系中百草枯及其四种代谢物的峰面 积差异不大。因此本发明试剂盒中的吸附材料分散液的溶剂pH控制在6.5- 9.5，可以保证对百草枯的四种代谢物的提取净化效果。
实验例3吸附材料分散液中磁性微球浓度对吸附性能的影响
实验材料准备：将实施例1制得的磁性微球分散在pH＝6.86混合磷酸 盐缓冲液中，制得浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0mg/mL吸附材 料分散液。所用磁性微球的制备原料包括1.2g Fe3O4@SiO2-MPS，4.8g 二乙烯苯、5.5g N-乙烯吡咯烷酮、4.6g 4-乙烯基苯甲酸和0.2g AIBN。
血浆样品处理：于2mL聚丙烯离心管中加入200μL血浆加标样本(百 草枯及其4种代谢物的加标浓度均为100μg/L)，然后分别加入1.2mL浓度 分别为0.5、1.0、2.0、5.0、6.0、10.0、15.0和20.0mg/mL的吸附材料分散 液，涡旋提取5min，随后置于磁力架上磁分离10s，弃去上清液；然后分 别用1mL水和1mL甲醇清洗，磁分离10s，弃去上清液；然后加入1.5mL2％甲酸乙腈溶液洗脱，涡旋提取4min，磁分离10s，收集上清液，40℃下 氮气吹干，然后加入200μL乙腈-水溶液(1:1,v/v)进行复溶，LC-MS进 样分析。
实验结果：结果如图7所示，当分散液中吸附剂的浓度较低时，百草 枯及其四种代谢物的峰面积均较小；随着吸附剂浓度增大，目标化合物峰 面积急剧增大；当吸附剂浓度达到某一数值时，继续增加浓度对目标化合 物的峰面积无显著影响，且峰面积达到平台。对于PQ、代谢物Monoquat、 MP和MINA，其出现峰面积平台期时最小吸附剂浓度均为5.0mg/mL，代 谢物DP出现峰面积平台期时最小吸附剂浓度为2.0mg/mL。为兼顾经济性 和净化效率，试剂盒中的吸附材料分散液的磁性微球浓度控制在5-20mg/m L。
实验例4吸附时间和洗脱时间对吸附效果的影响
吸附时间对吸附效果的影响
选择1～60min作为提取时间进行考察。将实施例1制得的磁性微球作 为吸附材料，所用磁性微球的制备原料包括1.2g Fe3O4@SiO2-MPS，4.8 g二乙烯苯、5.5g N-乙烯吡咯烷酮、4.6g 4-乙烯基苯甲酸和0.2g AIBN。
分别吸取200μL血浆加标样本(百草枯及其4种代谢物的加标浓度均 为100μg/L)于2mL聚丙烯离心管中，加入1.2mL 5.0mg/mL吸附材料 分散液，分别涡旋提取1～60min，分别磁分离10s，弃上清液，按实验例 2的方法淋洗、洗脱、氮气吹干和复溶，LC-MS进样分析。结果如图8所 示，对于PQ及其四种代谢物，随提取时间的延长目标化合物的峰面积逐渐 增大，当提取时间达到某个数值时，峰面积不再增加，且达到平台值。达 到峰面积平台值所需要的最短提取时间分别是：PQ和MP为4min，MINA 和DP为3min，Monoquat为5min。为了兼顾提取效率和省时，本发明提 取净化方法的提取时间控制在5-10min。
洗脱时间对吸附效果的影响
选择1～60min作为洗脱时间进行考察。将实施例1制得的磁性微球作 为吸附材料，所用磁性微球的制备原料包括1.2g Fe3O4@SiO2-MPS，4.8 g二乙烯苯、5.5g N-乙烯吡咯烷酮、4.6g 4-乙烯基苯甲酸和0.2g AIBN。
分别吸取200μL血浆加标样本(百草枯及其4种代谢物的加标浓度均 为100μg/L)于2mL聚丙烯离心管中，加入1.2mL 5.0mg/mL双亲性羧 基功能化磁性高分子复合微球分散液，涡旋提取5min，磁分离10s，弃上 清液，按实验例1方法淋洗，分别用1.5mL 2％甲酸乙腈溶液洗脱1～60 min，磁分离，收集上清液，氮气吹干和复溶，LC-MS分析。结果如图9 所示，采用2％甲酸乙腈溶液作为洗脱溶剂能快速地将PQ及其四种代谢物 从双亲性羧基功能化磁性高分子复合微球上洗脱下来，且控制洗脱时间为4 min已能完全洗脱目标化合物，为了保证洗脱效果，本发明提取净化方法的 洗脱时间控制在4-10min。。
实验例5亲水单体和功能单体比例对吸附性能的影响
实验材料准备：分别设计亲水单体N-乙烯基吡咯烷酮和功能单体4-乙 烯基苯甲酸的摩尔比为4：0(Amph-Mag-Ps)、2：2(Amph-Mag-Ps-COO H-1)、1：3(Amph-Mag-Ps-COOH-2)和0：4(Amph-Mag-Ps-COOH-3) 四种磁性微球。
血浆样品处理方法与实验例2相同，LC-MS进样分析，实验结果如图 10所示。实验结果表明，当吸附剂制备过程中未添加功能单体4-乙烯基苯 甲酸(Amph-Mag-Ps)时，Amph-Mag-Ps对百草枯及其四种代谢物的提取 与净化效率明显低于含功能单体的吸附剂(Amph-Mag-Ps-COOH-1、Amph -Mag-Ps-COOH-2和Amph-Mag-Ps-COOH-3)，由此说明在羧基官能团在提 取与净化过程中起着至关重要的作用。从实验结果看，不是功能单体的用 量越多，对百草枯及其代谢物的提取与净化性能越强，合成过程中添加适 量的亲水单体N-乙烯基吡咯烷酮能提高吸附材料与血浆体系的相容性，进 而提高材料对目标化合物的吸附能力。如对比Amph-Mag-Ps-COOH-1和A mph-Mag-Ps-COOH-3，当材料制备过程中控制亲水单体N-乙烯基吡咯烷酮 和功能单体4-乙烯基苯甲酸的摩尔比为2：2，尽管材料表面官能团羧基的 密度降低了，但百草枯及其代谢物Monoquat、MINA和MP的峰面积相比 无亲水单体的材料Amph-Mag-Ps-COOH-3反而增加了；但如果在材料制备 过程中控制亲水单体N-乙烯基吡咯烷酮和功能单体4-乙烯基苯甲酸的摩尔 比为1：3(Amph-Mag-Ps-COOH-2)，尽管百草枯的峰面积相比具有高密度 羧基的Amph-Mag-Ps-COOH-3有所提升，但百草枯四种代谢物的峰面积均 有不同程度的下降。因此，材料合成过程中控制合适的亲水单体N-乙烯基 吡咯烷酮和功能单体4-乙烯基苯甲酸的用量比例有利于提高吸附材料的提 取与净化效率。综合上述实验结果，Amph-Mag-Ps-COOH-1在血浆中百草 枯及其代谢物的提取与净化过程中性能最佳。
实验例6基质效应评价
本实验例对实施例2的试剂盒与商品化Waters Oasis WCX固相萃取柱 抗基质干扰能力进行对比，试剂盒中吸附材料分散液的溶剂为pH为6.86 的混合磷酸盐缓冲液，磁性微球的浓度为5mg/mL。
分别准确吸取空白血浆样品200μL于2mL聚丙烯离心管中，加入1.2 mL 5.0mg/mL双亲性羧基功能化磁性高分子复合微球分散液，涡旋提取5min，磁分离10s，随后置于磁力架上磁分离10s，弃去上清液；然后分别 用1mL水和1mL甲醇清洗，磁分离10s，弃去上清液；然后加入1.5mL 2％ 甲酸乙腈溶液洗脱，涡旋提取4min，磁分离10s，收集上清液，40℃下氮气吹干，然后加入200μL乙腈-水溶液(1:1,v/v)进行复溶，然后分别添加 适量百草枯代谢物的标准储备溶液，用净化后的血浆提取液配制成5、10、 20、50、100和200μg/L标准系列溶液，同时用Waters Oasis WCX固相萃 取柱净化基质匹配工作曲线和用乙腈-水溶液(1:1,v/v)配制成5、10、20、 50、100和200μg/L溶剂标准系列溶液进行对比。
采用公式：基质效应η＝(基质匹配标准曲线斜率Ka-溶剂标准曲线斜 率Kb)/溶剂标准曲线斜率Kb，评价双亲性羧基功能化磁性高分子复合微球 提取与净化血浆中百草枯及其代谢物的基质效应，结果如表2所示。
表2 本发明试剂盒与商品化Waters Oasis WCX固相萃取柱抗基质干扰能力对比
由表2可知，经本研究发明的磁性微球能有效减小血浆样品中百草枯 四种代谢物提取与净化过程中的基质效应，且基质效应η1的绝对值均小于 20％，为弱基质效应，可忽略不计，即在定量过程中无需配制基质匹配工作 曲线或使用同位素内标物。对于商品化的Waters Oasis WCX固相萃取柱， 其基质效应η2的绝对值介于20％～100％之间，为中等强度基质效应，需要 使用基质匹配工作曲线或使用同位素内标物进行定量分析，大大增加了实 验操作的繁琐性。因此，采用本发明的试剂盒，能有效去除血浆中干扰杂 质，有效降低百草枯及其代谢物的基质干扰效应，提高血浆中百草枯及其 代谢物检测的准确度，具有快速、简便和准确的优点。
实验例7准确度和精密度评价
本实施例考察实施例2的试剂盒用于提取血浆样品中百草枯代谢物的 准确度和精密度，试剂盒中吸附材料分散液的溶剂为pH为6.86的混合磷 酸盐缓冲液，磁性微球的浓度为5mg/mL。
分别控制血浆样品中百草枯及其四种代谢物的加标水平为5.0、20.0、1 00.0和200.0μg/L，分别吸取加标血浆样品200μL，加入1.2mL 5.0mg/ L吸附材料分散液，涡旋提取5min，磁分离10s，分别用1mL水和1mL甲 醇淋洗磁性吸附剂，磁分离10s，弃去上清液，采用1.5mL 2％甲酸乙腈溶 液涡旋洗脱4min，磁分离后收集上清液，氮吹至干，加入200μL乙腈-水 溶液(1:1,v/v)进行复溶，LC-MS进样分析。结果如表3所示。
表3 方法加标回收率、精密度、检出限和定量限(n＝6)
实验结果表明，应用本发明试剂盒及提取净化方法进行提取与净化， 血浆中百草枯四种代谢物的加标回收率为83.2％～97.3％之间，相对标准偏 差(RSDs)为2.1％～6.5％；分别以信噪比S/N≥3和S/N≥9定义方法检出限 和定量限，该试剂盒对于血浆中百草枯及其四种代谢物的方法检出限与定 量限分别为0.2～1.5μg/L和0.6～4.5μg/L。由此证明本发明的百草枯代谢物 的提取净化方法具有快速、灵敏和准确等优点。
虽然本发明公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领 域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与 修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11、通过溶剂热法制备得到Fe3O4微球；
S12、在磁性Fe3O4微球表面修饰含双键的MPS组分，得到Fe3O4@SiO2-MPS微球；
S13、通过微波辅助沉淀聚合反应，在引发剂作用下，以二乙烯苯、N-乙烯基吡咯烷酮和4-乙烯基苯甲酸为聚合单体，在Fe3O4微球表面实现羧基官能化高分子聚合物修饰，制备得到双亲性羧基功能化的磁性微球。
2.根据权利要求1所述的用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中各原料用量为：Fe3O4@SiO2-MPS微球1.2g、二乙烯苯4.8g、N-乙烯吡咯烷酮3.3-8.5g、4-乙烯基苯甲酸1.6-5.2g、AIBN 0.2-0.5g。
3.根据权利要求1或2所述的用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：将Fe3O4@SiO2-MPS微球超声分散于异丙醇中，将二乙烯苯、N-乙烯吡咯烷酮、4-乙烯基苯甲酸和AIBN溶解于乙腈中，并加入上述分散液中，微波辅助机械搅拌下，升温至75～80℃，维持20min，然后快速升温至81～82℃，冷凝回流16h，将反应得到的产物使用纯水与乙醇清洗，得到双亲性羧基功能化的磁性微球。
4.一种用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球，其特征在于，由如权利要求1所述的制备方法制得。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括吸附材料分散液，所述吸附材料分散液中的溶质为如权利要求4所述的用于提取净化百草枯代谢物的磁性微球。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述吸附材料分散液的溶剂为混合磷酸盐缓冲液，pH为6.5-9.5。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述吸附材料分散液中磁性微球的浓度为5-20mg/mL。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包EDTA抗凝管、注射器、标准系列工作溶液、离心管、洗脱液和复溶液。
9.一种百草枯代谢物的提取方法，其特征在于，使用如权利要求8所述的试剂盒，所述提取方法包括以下步骤：
S21、移取200μL血浆样品于离心管中，加入1.2mL吸附材料分散液，涡旋提取，随后置于磁力架上磁分离，弃去上清液；
S22、淋洗后加入1.5mL 2％甲酸乙腈溶液洗脱，涡旋提取，磁分离，收集上清液，氮气吹干；
S23、加入200μL乙腈-水溶液进行复溶，LC-MS进样分析。
10.根据权利要求9所述的百草枯代谢物的提取方法，其特征在于，所述步骤S21中，涡旋提取时间为5-10min；所述步骤S22中，涡旋提取时间为4-10min。
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