CN108802237B - 一种生物样本中微量雷公藤甲素的检测分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种生物样本中微量雷公藤甲素含量的检测分析方法，该方法具体为：所述雷公藤甲素与衍生试剂d 0‑/d 3‑3‑N‑甲基‑2’‑羧基罗丹明6G发生稳定同位素标记衍生化反应，磁性分子印迹聚合物特异性萃取后得到的衍生化产物经滤膜过滤后，利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱分析系统进行检测。本发明利用带有永久正电荷d 0‑/d 3‑MCR6G的稳定同位素标记衍生试剂对微量雷公藤甲素进行标记衍生，反应温和、快速，效率高，显著提高分析物的色谱分离度和质谱离子化效率。本发明提供的磁性分子印迹聚合物，选择性识别和富集复杂样品中的目标物，降低基质干扰，制备简单、稳定性好、选择性和回收率高。

Description

一种生物样本中微量雷公藤甲素的检测分析方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种生物样本中微量雷公藤甲素含量的检测分析方法，具体而言，涉及一种利用d 0-/d 3-3-N-甲基-2’-羧基罗丹明6G（d 0-/d 3-MCR6G）作为衍生试剂，微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取技术联合超高效液相色谱三重四极杆串联质谱检测的分析方法。
背景技术
雷公藤甲素是从传统中草药雷公藤中提取的活性二萜内酯化合物，具有广泛的药理学性质，包括抗炎、神经保护、免疫抑制和抗肿瘤活性等，同时也是雷公藤引起毒副作用的主要成分，近年来引起了广泛关注。此外，雷公藤甲素分子小和亲脂性的性质，可穿透血脑屏障，从而对中枢神经系统疾病具有潜在的药用价值。因此，开发一种灵敏、快速和准确的分析方法对检测口服雷公藤甲素的药代动力学水平是非常有必要的。
文献《毛细管气相色谱法测定雷公藤中雷公藤甲素》（中草药，2005, 36（10）：1567-1568）采用衍生化试剂三氟乙酐(TFAA)进行柱前衍生化气相色谱法对雷公藤甲素进行测定,其分离度良好，操作简便且灵敏度增强，但定性能力较弱，不能直接给出定性结果。中国专利（CN 104991020 A），文献《Simultaneous LC-MS/MS determination of fivetripterygium pyridine alkaloids in dog plasma and its application to theirpharmacokinetic study after oral administration of tripterygium glycosidestablets》（Journal of Chromatography B, 2015, 990: 31–38）和文献《UPLC-MS/MS 法测定大鼠血浆中雷公藤内酯醇及其药代动力学》（首都医科大学学报，2015，36（1）: 121-126）利用液相色谱-串联质谱技术对生物样本中雷公藤甲素直接检测，可实现快速分析和分析物的分离与结构鉴定。但由于药物活性成分在生物样本中含量极低，存在严重的基质干扰等局限性，使得方法的灵敏度、准确度和质谱离子化效率亟待提高。
发明内容
针对现有技术中存在的如何快速、准确、高灵敏且选择性地分析生物样本中微量雷公藤甲素的问题，本发明提供了一种生物样本中微量雷公藤甲素含量的检测分析方法，该方法为稳定同位素标记衍生技术，通过轻/重标衍生试剂分别对实际样品和标准品溶液中的雷公藤甲素进行衍生化，然后进行磁分散固相萃取和色谱/质谱联用检测的分析方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种生物样本中微量雷公藤甲素含量的检测分析方法，所述雷公藤甲素与衍生试剂d 0-/d 3-3-N-甲基-2’-羧基罗丹明6G（d 0-/d 3-MCR6G）发生稳定同位素标记衍生化反应，磁性分子印迹聚合物特异性萃取后得到的衍生化产物经滤膜过滤后，利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱分析系统进行检测。
本发明所提供的检测分析方法具体包括以下步骤：
a. 微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取：取50-100 μL预处理的待测样品置于离心管中，加入25 μL 2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和25 μL 4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，涡旋10秒后，将150-300 μL d 0-MCR6G乙腈溶液加入待测样品中，摇匀后密封并在微波反应器中反应6-7分钟，得d 0-MCR6G标记的待测样品；取50-100 μL雷公藤甲素标准品溶液置于离心管中，加入25 μL 2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和25 μL 4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，涡旋10秒后，将150-300 μL d 3-MCR6G乙腈溶液加入雷公藤甲素标准品溶液中，摇匀后密封并在微波反应器中反应6-7分钟，得d 3-MCR6G标记的雷公藤甲素标准品溶液；将d 0-MCR6G标记的待测样品和d 3-MCR6G标记的雷公藤甲素标准品溶液按体积比1:1混合，摇匀；将5-15 mg磁性固体吸附剂分散到上述混合溶液中，振荡60分钟，磁性分离，用解吸溶剂将同位素标记衍生物从吸附剂上解吸下来，磁性分离，氮气吹干，残余物用200-300μL甲醇溶解，得到雷公藤甲素同位素标记衍生物萃取溶液；
b. 将雷公藤甲素同位素标记衍生物萃取溶液经滤膜过滤，利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。
进一步的，所述CMPI乙腈溶液的浓度为5-10 wt%；所述DMAP乙腈溶液的浓度为10-20 wt%；所述d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液浓度均为1.0×10-3 mol/L；所述微波反应器的功率为800-870 W，在微波反应器中反应的温度为55-65 °C；所述雷公藤甲素标准品溶液的浓度介于3-5000pg/mL。
进一步的，所述微波反应器的功率为850 W，反应的温度为60 °C。
进一步的，所述磁性固体吸附剂为以SiO2@Fe3O4为载体、以d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物为模板分子的磁性分子印迹聚合物；所述解析溶剂为含10 %乙酸的甲醇、乙腈、乙醇或丙酮；所述解吸溶剂最优化的为含10 %乙酸的甲醇。
本发明所使用的上述磁性固体吸附剂采用以下方法制备而成：
（1）磁性Fe3O4的制备：磁力搅拌下将5.40 g FeCl3溶解于200 mL乙二醇中，40 min后得清澈黄色溶液，然后加入14.80 g乙酸钠，继续搅拌40 min；将搅拌好的混合液转移至400 mL的聚四氟乙烯不锈钢高压反应釜中，密封后在烘箱内200℃下反应8 h，反应结束后自然冷却，在外加磁铁下收集黑色磁性纳米微球，用水和乙醇分别洗三次，放入真空烘箱60℃下干燥12 h；
（2）磁性Fe3O4的修饰：300 mg磁性 Fe3O4分散到50.0 mL异丙醇中，加入4.0 mL纯水超声15.0 min，然后加入5.0 mL氨水和2.0 mL 四乙氧基硅烷，室温下持续搅拌反应12h，在外磁铁作用下收集反应获得的Fe3O4@SiO2，利用高纯水清洗，然后放入45 ℃真空烘箱中干燥24 h，称取200 mg干燥的Fe3O4@SiO2颗粒分撒于50.0 mL甲醇中，超声10.0 min，搅拌下逐滴加入 3.0 mL 3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯，室温下搅拌反应24 h，在外加磁铁下收集乙烯基修饰的Fe3O4@SiO2，利用甲醇清洗后放入45 ℃真空烘箱内干燥24 h；
（3）磁性核壳分子印迹材料的制备：0.1 mmol d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物和0.4mmol 丙烯酰胺溶解于10.0 mL乙腈中，超声15.0 min，暗处理12 h形成预聚合溶液，100 mg乙烯基修饰的Fe3O4@SiO2，2.0 mmol 二甲基丙烯酸乙二醇酯 和20 mg 偶氮二异丁腈均匀分散入预聚合溶液中，超声15.0 min得混合液，将混合液加入含有70.0 mL乙腈溶液的三口烧瓶中，氮气净化，搅拌下60 ℃反应24 h，在外磁铁作用下收集磁性核壳分子印迹材料颗粒，利用甲醇/乙酸（9:1, v:v）进行索氏提取除去模板分子，获得的产物放入45 ℃真空烘箱中干燥24 h即得。
本发明所使用的衍生试剂d 0-/d 3-MCR6G采用以下方法制备而成：将1g罗丹明6G溶于30mLDMF中，室温下搅拌5分钟后，缓慢加入0.217gNaH反应3分钟，然后在3-5分钟内加入330 μL CH3I或CD3I，室温下反应150分钟后，加入150 mL水终止反应；用150 mL氯仿萃取混合物两次，合并有机层并减压蒸馏得粗产物，经甲醇/氯仿（1:1, V/V）重结晶，得到产物d 0-MCR6G或d 3-MCR6G。
上述NaH加入时以煤油作为载体；所述NaH在煤油中的质量百分含量为60%。
进一步的，所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30 °C，采用梯度洗脱法；所述质谱的条件为：干燥气温度310 °C，流速12 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度300 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV，扫描方式为多反应监测模式，质谱检测的前1.0分钟流动相进废液，1.0-3.0分钟进入电离源。
上述梯度洗脱法：时间为3.0 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为20%甲醇水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇，0 min流动相组成为70% A+30% B，1 min时30% A+70% B，2.0 min时2% A+98% B，3.0 min时2% A+98% B。
本发明流动相中各分数均指体积分数。
本发明所使用的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统由安捷伦1290系列超高效液相色谱，配备安捷伦6460三重四极杆串联质谱系统组成。
本发明的分析物雷公藤甲素为含羟基的化合物，具体的化学结构如下：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
本发明利用微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取技术联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法，准确、灵敏、特异性的测定生物样本中微量雷公藤甲素的含量。首次设计合成了一对含有同位素标签和永久正电荷的罗丹明6G类衍生化试剂（d 0-/d 3-MCR6G），对带有活性羟基官能团的雷公藤甲素进行同位素标记衍生化，以d 3-MCR6G标记的标准品作为内标进行定量分析，衍生产物母离子可产生特异性的含有永久正电荷和同位素标签的罗丹明报告离子，借助所引入的同位素标签, 不但能实现上述药物分子的相对定量分析, 更为提升目标化合物的质谱检测灵敏度和准确度提供可能。此外，雷公藤甲素所含有的活性羟基，能够和同位素标记衍生试剂d 0-/d 3-MCR6G的活性羧基在微波作用下迅速反应。衍生后采用磁性分子印迹技术萃取目标分析物，有效地降低了基质干扰、特异性好，回收率高。本发明克服了常规方法的衍生反应时间长、灵敏度低、基质干扰严重等问题。本发明为雷公藤甲素的药代动力学检测提供了一种可靠的技术手段。d 0-/d 3-MCR6G作为稳定同位素标记衍生试剂的衍生化反应过程如下所示：
Figure 492871DEST_PATH_IMAGE002
本发明中采用微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取技术对SD大鼠口服雷公藤甲素（0.5 mg/kg）1小时后的脑微透析液、血液微透析液、血清和血浆以及加入雷公藤甲素标准品的医院正常人血清等生物样本中的雷公藤甲素进行前处理，该技术具有快速、灵敏、高效和特异选择性等优点。
本发明的优点及有益效果：
1. 本发明利用首次设计合成的带有永久正电荷d 0-/d 3-MCR6G的稳定同位素标记衍生试剂对生物样本中微量雷公藤甲素进行标记衍生，衍生化反应条件温和、快速，衍生化效率高，能够显著提高分析物的色谱分离度和质谱离子化效率。
2、本发明磁分散固相萃取的吸附剂为磁性分子印迹聚合物，可选择性识别和富集复杂样品中的目标物，有效地降低基质干扰，其制备简单、稳定性好、选择性和回收率高。
3. 本发明通过微波辅助衍生-磁性分子印迹聚合物分散固相萃取技术，联合多反应监测模式超高效液相色谱三重四极杆串联质谱的分析方法，具有快速、准确、高选择性、高灵敏和高选择性的优点。
4. 本发明的分析方法可应用于可能含雷公藤甲素的脑微透析液、血液微透析液、血清和血浆以及加入雷公藤甲素标准品的医院正常人血清等复杂生物样本的药物代谢研究，分析方法的适用性良好，更清楚地了解雷公藤甲素在体内的药代动力学规律。
附图说明
图1为实施例1中雷公藤甲素标准品衍生物的质谱检测分离图。
图2为实施例1中雷公藤甲素衍生物质谱裂解机理示意图：(A) d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物；(B) d 3-MCR6G-雷公藤甲素衍生物。
图3为实施例2中大鼠脑微透析液中雷公藤甲素衍生物的质谱检测分离图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明所使用的甲醇、乙腈和甲酸等化学试剂为色谱纯，水为高纯水。
本发明中稳定同位素标记衍生物的萃取物经滤膜（0.22 μm）过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。
实施例1
雷公藤甲素的色谱分离和质谱定性定量分析方法：
在3-5000 pg/mL范围内，配制7个不同浓度的d 0-MCR6G标记的雷公藤甲素标准溶液（20 pg/mL, 400 pg/mL, 800 pg/mL, 1500 pg/mL, 2000 pg/mL, 3000 pg/mL, 4000pg/mL），其中以d 3-MCR6G标记的标准品（2500 pg/mL）作为固定内标。具体的衍生化过程如下：上述不同浓度水平的标准品溶液1份，25 μL CMPI（7 wt%）和25 μL DMAP（10.5 wt%）乙腈溶液，150 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液，依次加入1.5 mL的离心管中，涡旋10秒。密封并在56 °C在微波反应器（840 W）中反应6.5分钟。将7个浓度水平的d 0-MCR6G标准品衍生物和d 3-MCR6G标记的固定标准品衍生物分别1:1（V/V）混合，摇匀。磁分散固相萃取过程如下：将14 mg磁性分子印迹聚合物分散到上述混合溶液中, 振荡60分钟。磁性分离，用甲醇（含10 %乙酸）将吸附的d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物解吸下来。磁性分离，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。依据d 0-/d 3-MCR6G衍生物的峰面积比值（d 0-MCR6G标准品衍生物/d 3-MCR6G固定内标）与d 0-MCR6G标记的标准品浓度进行线性回归，制作校准曲线，按照上述分析过程对实际样品进行测定的峰面积带入线性方程计算实际样品含量。
流动相A为20%甲醇水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇，按照上述部分的梯度洗脱程序能得到较好的分离度，图1为雷公藤甲素标准品衍生物的质谱检测图，轻重标衍生物的保留时间差不大于0.02 min, 避免了两者间的相互干扰和仪器信号波动对定量的影响。质谱分析实验结果表明，分析物的稳定同位素标记衍生物在多反应监测模式（MRM）下产生一对子离子m/z 429.3（轻标）和m/z 432.3（重标）。图2（A）为d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物质谱裂解机理示意图，母离子为[M]+ m/z 757.4，在MRM检测时产生特异性子离子m/z 429.3。图2（B）为d 3-MCR6G-雷公藤甲素衍生物质谱裂解机理示意图，母离子为[M]+ m/z 760.4，在MRM检测时产生特异性子离子m/z 432.3。对MRM模式的参数进行了优化，分析物的母离子、子离子、最优化碎裂电压（V）和电离能（eV）以及线性方程的相关系数、检出限和回收率见表 1。
表1
Figure 675590DEST_PATH_IMAGE003
实施例2
脑微透析液中雷公藤甲素的提取包括以下操作步骤：
取大鼠脑微透析液200 μL到离心管中, 氮气吹干, 残渣以200 μL乙腈复溶，以备稳定同位素标记衍生。取50 µL脑微透析液乙腈复溶液或标准品溶液，25 μL CMPI（8 wt%）和25 μL DMAP（15 wt%）乙腈溶液，150 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液，依次加入1.5 mL的离心管中，涡旋10秒。密封并在60 °C在微波反应器（850 W）中反应6.5分钟。d 0-MCR6G标记的脑微透析液和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀。将10 mg磁性分子印迹聚合物分散到上述混合溶液中, 振荡60分钟。磁性分离，用甲醇（含10 %乙酸）将吸附的d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物解吸下来。磁性分离，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。口服雷公藤甲素1小时的脑微透析液中药物含量根据实施例1建立的定量方程计算得出。
实施例3
血液微透析液中雷公藤甲素的提取包括以下操作步骤：
取大鼠血液微透析液200 μL到离心管中, 氮气吹干, 残渣以200 μL乙腈复溶，以备稳定同位素标记衍生。取50 µL血液微透析液乙腈复溶液或标准品溶液，25 μL CMPI（7wt%）和25 μL DMAP（14 wt%）乙腈溶液，100 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液，依次加入1.5mL的离心管中，涡旋10秒。密封并在57 °C在微波反应器（820 W）中反应6分钟。d 0-MCR6G标记的血液微透析液和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀。将12 mg磁性分子印迹聚合物分散到上述混合溶液中, 振荡60分钟。磁性分离，用甲醇（含10 %乙酸）将吸附的d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物解吸下来。磁性分离，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。口服雷公藤甲素1小时的血液微透析液中药物含量根据实施例1建立的定量方程计算得出。
实施例4
血清中雷公藤甲素的提取包括以下操作步骤：
取大鼠血清300 μL, 加入50% 甲醇50 μL，乙腈300 μL，涡旋1 min, 离心（1.5×104 r/min）15 min, 吸取上清液，氮气吹干, 残渣以200 μL乙腈复溶，以备稳定同位素标记衍生。取50 µL血清乙腈复溶液或标准品溶液，25 μL CMPI（6.5 wt%）和25 μL DMAP（17wt%）乙腈溶液，150 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液，依次加入1.5 mL的离心管中，涡旋10秒。密封并在59 °C在微波反应器（860 W）中反应6分钟。d 0-MCR6G标记的血清乙腈复溶液和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀。将8 mg磁性分子印迹聚合物分散到上述混合溶液中, 振荡60分钟。磁性分离，用甲醇（含10 %乙酸）将吸附的d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物解吸下来。磁性分离，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。口服雷公藤甲素1小时的血清中药物含量根据实施例1建立的定量方程计算得出。
实施例5
血浆中雷公藤甲素的提取包括以下操作步骤：
取300 μL血浆, 加入200 μL 10% 三氯醋酸沉淀蛋白，振荡后离心（1.5×104 r/min）15 min, 取上清液, 氮气吹干, 残渣以200 μL乙腈复溶，以备稳定同位素标记衍生。取50 µL血浆乙腈复溶液或标准品溶液，25 μL CMPI（8 wt%）和25 μL DMAP（18 wt%）乙腈溶液，200 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液，依次加入1.5 mL的离心管中，涡旋10秒。密封并在59 °C在微波反应器（870 W）中反应6.5分钟。d 0-MCR6G标记的血浆乙腈复溶液和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀。将6 mg磁性分子印迹聚合物分散到上述混合溶液中,振荡60分钟。磁性分离，用甲醇（含10 %乙酸）将吸附的d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物解吸下来。磁性分离，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。口服雷公藤甲素1小时的血浆中药物含量根据实施例1建立的定量方程计算得出。
实施例6
加入雷公藤甲素标准品的医院正常人血清的提取包括以下操作步骤：
取医院正常人血清300 μL, 加入雷公藤甲素标准品（1.90 ng/mL）20 μL，50% 甲醇50 μL，乙腈300 μL，涡旋1 min, 离心（1.5×104 r/min）15 min, 吸取上清液，氮气吹干, 残渣以200 μL乙腈复溶，以备稳定同位素标记衍生。取50 µL加标的正常人血清乙腈复溶液或标准品溶液，25 μL CMPI（10 wt%）和25 μL DMAP（20 wt%）乙腈溶液，200 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液，依次加入1.5 mL的离心管中，涡旋10秒。密封并在57 °C在微波反应器（860 W）中反应6分钟。d 0-MCR6G标记的加标的正常人血清乙腈复溶液和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀。将7 mg磁性分子印迹聚合物分散到上述混合溶液中, 振荡60分钟。磁性分离，用甲醇（含10 %乙酸）将吸附的d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物解吸下来。磁性分离，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。加入雷公藤甲素标准品的医院正常人血清中药物含量根据实施例1建立的定量方程计算得出。
将实施例1-6进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析，使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30 ℃，采用梯度洗脱法；梯度洗脱法，时间为3.0 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为20%甲醇水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇，0 min流动相组成为70% A+30% B，1 min时30% A+70% B，2.0 min时2% A+98% B，3.0 min时2% A+98% B。所述质谱的条件为：干燥气温度310 °C，流速12 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度300 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV, 质谱检测的前1.0分钟流动相进废液，1.0-3.0分钟进入电离源。
以SD大鼠脑微透析液样品为例，质谱检测分离图见图3。上述各种实际样品中检测到雷公藤甲素的含量（n=3) 如表2所示。
表2
Figure 970174DEST_PATH_IMAGE004
对比例1
该对比例过程与实施例2相同，不同在于衍生化条件和分析方法不同，对比例1采用TFAA为衍生化试剂，通过柱前衍生化毛细管气相色谱法对雷公藤甲素进行测定。
对比例2
该对比例过程与实施例2相同，不同在于无衍生化过程，对比例2采用LC-MS/MS直接测定雷公藤甲素。
对比例3
该对比例过程与实施例2相同，不同在于无衍生化过程，对比例3采用UPLC-MS/MS直接测定雷公藤甲素及其药代动力学。
下表3为实施例2同对比例1-3的实验结果对比。
表3
Figure 896542DEST_PATH_IMAGE005
表3结果表明，本发明利用微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取技术，具有简便、快速、灵敏、回收率高等优点。本发明的检出限比对比例低228-4555倍左右。本发明使用稳定同位素标记衍生试剂，显著降低了基质效应，提高了检测的准确度和灵敏度。
本分析方法中雷公藤甲素的线性范围3-5000pg/mL，检出限为0.45 pg/mL，定量限为2.92 pg/mL。表1-2结果表明，所建立的分析方法能够很好地应用于不同生物样本中微量雷公藤甲素的药物代谢研究。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，且本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种生物样本中微量雷公藤甲素含量的检测分析方法，其特征在于：包括以下步骤：
a. 微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取：取50-100 μL预处理的待测样品置于离心管中，加入25 μL 2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和25 μL 4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，涡旋10秒后，将150-300 μL d 0-MCR6G乙腈溶液加入待测样品中，摇匀后密封并在微波反应器中反应6-7分钟，得d 0-MCR6G标记的待测样品；取50-100 μL雷公藤甲素标准品溶液置于离心管中，加入25 μL 2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和25 μL 4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，涡旋10秒后，将150-300 μL d 3-MCR6G乙腈溶液加入雷公藤甲素标准品溶液中，摇匀后密封并在微波反应器中反应6-7分钟，得d 3-MCR6G标记的雷公藤甲素标准品溶液；将d 0-MCR6G标记的待测样品和d 3-MCR6G标记的雷公藤甲素标准品溶液按体积比1:1混合，摇匀，得混合溶液；将5-15 mg磁性固体吸附剂分散到上述混合溶液中，振荡60分钟，磁性分离，用解吸溶剂将同位素标记衍生物从吸附剂上解吸下来，磁性分离，氮气吹干，残余物用200-300 μL甲醇溶解，得到雷公藤甲素同位素标记衍生物萃取溶液；
所述d0-MCR6G为
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
所述d3-MCR6G为
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
b. 将雷公藤甲素同位素标记衍生物萃取溶液经滤膜过滤，利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测；
所述2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液的浓度为5-10 wt%；所述4-二甲氨基吡啶乙腈溶液的浓度为10-20 wt%；所述d 0-MCR6G乙腈溶液和d 3-MCR6G乙腈溶液浓度均为1.0×10-3 mol/L；所述微波反应器的功率为800-870 W，在微波反应器中反应的温度为55-65℃；所述雷公藤甲素标准品溶液的浓度介于3-5000pg/mL；
所述磁性固体吸附剂为以SiO2@Fe3O4为载体、以d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物为模板分子的磁性分子印迹聚合物；所述解吸溶剂为含10 %乙酸的甲醇、乙腈、乙醇或丙酮； 所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm ×50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30℃，采用梯度洗脱法；所述质谱的条件为：干燥气温度310℃，流速12 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度300℃，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV，扫描方式为多反应监测模式，质谱检测的前1.0分钟流动相进废液，1.0-3.0分钟进入电离源；
所述梯度洗脱法：时间为3.0 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为20%甲醇水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇，0 min流动相组成为70% A+30% B，1 min时30%A+70% B，2.0 min时2% A+98% B，3.0 min时2% A+98% B。
2.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，所述解吸溶剂为含10 %乙酸的甲醇。
3.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，所述磁性固体吸附剂采用以下方法制备而成：
（1）磁性Fe3O4的制备：磁力搅拌下将5.40 g FeCl3溶解于200 mL乙二醇中，40 min后得清澈黄色溶液，然后加入14.80 g乙酸钠，继续搅拌40 min；将搅拌好的混合液转移至400mL的聚四氟乙烯不锈钢高压反应釜中，密封后在烘箱内200℃下反应8 h，反应结束后自然冷却，在外加磁铁下收集黑色磁性纳米微球，用水和乙醇分别洗三次，放入真空烘箱60℃下干燥12 h；
（2）磁性Fe3O4的修饰：300 mg磁性 Fe3O4分散到50.0 mL异丙醇中，加入4.0 mL纯水超声15.0 min，然后加入5.0 mL氨水和2.0 mL 四乙氧基硅烷，室温下持续搅拌反应12 h，在外磁铁作用下收集反应获得的Fe3O4@SiO2，利用高纯水清洗，然后放入45℃真空烘箱中干燥24h，称取200 mg干燥的Fe3O4@SiO2颗粒分撒于50.0 mL甲醇中，超声10.0 min，搅拌下逐滴加入 3.0 mL 3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯，室温下搅拌反应24 h，在外加磁铁下收集乙烯基修饰的Fe3O4@SiO2，利用甲醇清洗后放入45℃真空烘箱内干燥24 h；
（3）磁性核壳分子印迹材料的制备：0.1 mmol d 0-MCR6G-雷公藤甲素衍生物和0.4 mmol丙烯酰胺溶解于10.0 mL乙腈中，超声15.0 min，暗处理12 h形成预聚合溶液，100 mg乙烯基修饰的Fe3O4@SiO2，2.0 mmol 二甲基丙烯酸乙二醇酯和20 mg偶氮二异丁腈均匀分散入预聚合溶液中，超声15.0 min得混合液，将混合液加入含有70.0 mL乙腈溶液的三口烧瓶中，氮气净化，搅拌下60℃反应24 h，在外磁铁作用下收集磁性核壳分子印迹材料颗粒，利用体积比9：1的甲醇/乙酸进行索氏提取除去模板分子，获得的产物放入45℃真空烘箱中干燥24 h即得。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测分析方法，其特征在于，所述d 0-MCR6G或d 3-MCR6G采用以下方法制备而成：将1g罗丹明6G溶于30mLDMF中，室温下搅拌5分钟后，缓慢加入0.217gNaH反应3分钟，然后在3-5分钟内加入330 μL CH3I或CD3I，室温下反应150分钟后，加入150 mL水终止反应；用150 mL氯仿萃取混合物两次，合并有机层并减压蒸馏得粗产物，经体积比1：1的甲醇/氯仿重结晶，得到产物d 0-MCR6G或d 3-MCR6G。
5.根据权利要求4所述的检测分析方法，其特征在于，所述NaH加入时以煤油作为载体；所述NaH在煤油中的质量百分含量为60%。
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