CN106153794A

CN106153794A - 一种微波辅助提取/hplc检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法

Info

Publication number: CN106153794A
Application number: CN201510167555.XA
Authority: CN
Inventors: 杨立业; 欧阳小琨; 李庆龙
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2015-04-10
Filing date: 2015-04-10
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明涉及一种微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理：新鲜的雷公藤叶干制后粉碎，过15～20目筛得雷公藤叶粉末，将制得的雷公藤叶粉末置于容器中，按料液比1:6～8进入石油醚，混合均匀后超声脱脂50～60min，脱脂后干燥备用；(2)微波提取：按料液比1:6～14将提取溶剂放入上述雷公藤叶粉末中，在微波温度60～70℃、微波功率500～900w条件下微波提取5～25min，重复提取0～2次；(3)检测：采用HPLC进行检测。该方法简便、快捷、准确，重复性好，适合于雷公藤叶中雷公藤甲素的含量测定。

Description

一种微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法

技术领域

本发明涉及中药材活性成分雷公藤甲素的检测，尤其涉及一种微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)系卫矛科雷公藤属木质藤本植物，又名菜虫药、黄藤根、断肠草等，是雷公藤属植物中的一种，在我国有广泛分布。雷公藤甲素(Triptolide，TP)又称雷公藤内酯、雷公藤内酯醇，是从雷公藤中分离出的一种活性最高的环氧化二萜单体，是雷公藤的主要有效成分之一，其相关效价比雷公藤总苷高100～200倍。雷公藤甲素是具有松香烷骨架的二萜，含有独特的三环氧结构和α,β-不饱和五元内酯环(如下式所示)为白色晶体，分子式C₂₀H₂₄O₆，相对分子质量为360.41。自1977年黎磊石院士首次证实雷公藤对肾小球肾炎有减少蛋白尿、消水肿的作用，并相继发表了以雷公藤提取液TⅡ(相当于目前的雷公藤多甙片)治疗肾炎的临床及实验研究报告，全国各地普遍开始将其用于肾脏疾病治疗。近年来国内外专家学者对其研究较多，它不但具有抗肿瘤生物活性，还能抗炎、免疫抑制、抗生育等，临床上在癌症、器官移植排斥反应、自身免疫性疾病、肾病综合征等方面疗效显著，如申请号为CN200510019501.5(公开号为CN1762346A)的中国发明专利《雷公藤甲素在制备抗卵巢癌药物中的应用》、专利号为ZL201110093907.3(公开号为CN102327279A)《雷公藤甲素与忍冬苷配伍的药物组合物及其制备和用途》等。

微波萃取技术又叫微波辅助提取(MAE),是利用微波能作为一种辅助手段，选择性地使样品中欲分析组分从样品基体中渗出，实现与基体的分离。微波萃取的原理就是在微波场中，利用不同结构的物质吸收微波能力的差异，使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使被萃取物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中。将微波萃取与传统的Soxhlet萃取、搅拌萃取、超声波萃取或超临界流体萃取等方法比较，它克服了传统萃取方法费时、费试剂、效率低、重现性差、对环境和操作人员造成危害的缺点，具有设备简单、选择性高、萃取效率高、重现性好、操作简单、易于控温、节省时间、节省试剂、污染轻等优点。目前微波萃取已被广泛应用于很多领域，尤其在生物、医药、化工、食品等领域，微波萃取可用于生物样品中农药残留的研究、环境中有机污染物的研究、植物中有效成分的萃取等，在我国微波萃取广泛被用于天然产物的提取，目前已应用于多项中草药的浸取生产线之中，如葛根、茶叶、银杏等。

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”，高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。申请号为200710069906.9(公开号为CN 101339168A)的中国发明专利《雷公藤药材中雷公藤甲素的含量测定方法》，该发明利用三氯甲烷对雷公藤药材粉末进行萃取，然后利用高效液相色谱法进行分析，虽然该方法能确保雷公藤制成品的优质原料，保证雷公藤制剂的用药安全和疗效，但雷公藤甲素的萃取率相对较低，萃取时间过长，使得其整体萃取效率不高，从而影响其检测的效率和精度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种萃取效率高、检测快速且精度高的微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品前处理：新鲜的雷公藤叶干制后粉碎，过15～20目筛得雷公藤叶粉末，将制得的雷公藤叶粉末置于容器中，按料液比1:6～8进入石油醚，混合均匀后超声脱脂50～60min，脱脂后干燥备用；

(2)微波提取：按料液比1:6～14将提取溶剂放入上述雷公藤叶粉末中，在微波温度60～70℃、微波功率500～900w条件下微波提取5～25min，提取次数为1～3次；

(3)检测：采用HPLC进行检测，HPLC的色谱条件为：色谱柱为Kromasil ODS-C18(4.6mm×250mm)，流动相为乙腈-水，检测波长为218nm，柱温为室温,流速为0.5～0.7mL/min，进样量为20μL。

作为优选，所述雷公藤粉末与提取溶剂的料液比为1:8。

作为优选，所述提取溶剂为甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿中的至少一种。

进一步，所述提取溶剂为甲醇。

作为优选，所述微波温度70℃、微波功率600w条件下微波提取20min，提取次数为1次。

作为优选，所述步骤(3)中流动相中乙腈-水的体积比为4:6，所述流速为0.7mL/min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明利用微波辅助提取来提取雷公藤叶中雷公藤甲素，与现有的提取方法相比，具有不破坏样品基体，升温快温度、时间、压力可控，受溶剂亲和力的影响小、可供选择的溶剂种类多等优点，使得对雷公藤甲素的提取效率较高，应用HPLC对提取液中的雷公藤甲素进行检测，该方法简便、快捷、准确，重复性好，适合于雷公藤叶中雷公藤甲素的含量测定。

附图说明

图1为实施例1的1-2中雷公藤甲素标准曲线图；

图2为实施例1的1-2中雷公藤甲素标准品HPLC谱图；

图3为实施例2的2-1中不同提取溶剂对雷公藤甲素萃取效果的影响；

图4为实施例2的2-1中以甲醇为提取溶剂时所得的雷公藤甲素HPLC谱图；

图5为实施例2的2-2中不同微波功率对雷公藤甲素萃取率的影响；

图6为实施例2的2-2中微波功率600w时所得的雷公藤甲素HPLC谱图；

图7为实施例2的2-3中料液比对雷公藤甲素萃取率的影响；

图8为实施例2的2-3中料液比1:8时所得的雷公藤甲素HPLC谱图；

图9为实施例2的2-4中提取时间对雷公藤甲素提取率的影响；

图10实施例2的2-4中提取时间20min时所得的雷公藤甲素HPLC谱图；

图11为实施例2的2-5中提取次数对雷公藤甲素萃取率的影响；

图12为对比例中三种提取方法所得雷公藤甲素含量图；

图13为对比例中回流提取所得的雷公藤甲素HPLC谱图；

图14为对比例中超声提取所得的雷公藤甲素HPLC谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对发明作进一步详细描述。

实施例1：检测条件

1-1、HPLC色谱条件

HPLC色谱条件为：色谱柱：Kromasil ODS-C18(4.6mm×250mm)，流动相：乙腈-水(4:6)，检测波长：218nm，柱温：室温，流速：0.7mL·min^-1，进样量：20μL。

1-2、标准曲线的制备

精密量取雷公藤甲素标准品(中国药检所)10mg，用甲醇(AR)定容在10ml的容量瓶中，再分别配制成浓度分别为：0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.003mg/mL、0.004mg/mL、0.005mg/mL的5份雷公藤甲素标准溶液。用HPLC测上述5份雷公藤甲素标准溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，雷公藤甲素浓度为横坐标绘制标准曲线。雷公藤甲素标准品浓度及其对应所测得的峰面积如表1所示；雷公藤甲素标准品浓度与峰面积的线性关系如下图1所示，即回归方程为y＝22126x+0.784，R²＝0.9993；雷公藤甲素标准品HPLC谱图如图2所示。

表1 雷公藤甲素标准品浓度及相应测得的峰面积

实施例2：样品萃取

样品前处理：新鲜的雷公藤叶干制后粉碎，过20目筛得雷公藤叶粉末，将制得的雷公藤叶粉末置于1000mL的圆底烧瓶中，按料液比1:6～8进入石油醚，混合均匀后超声脱脂50～60min，脱脂后的雷公藤叶粉末样品，摊开晾干备用；

微波提取：将一定量的提取溶剂放入上述雷公藤叶粉末中，在一定微波温度、微波功率条件下微波提取。

应用HPLC对提取液进行检测，由于雷公藤标准曲线的回归方程为y＝22126x+0.784，R2＝0.9993，x：雷公藤甲素浓度，y：峰面积。所以可得雷公藤甲素的含量＝[(峰面积-0.784)*100/22126]*粗提物得量；纯度＝(峰面积-0.784)*100/22126。

2-1、提取溶剂的选择

分别准确称取5g雷公藤叶粉末样品加到4个干净的三颈瓶中，各三颈瓶中分别加入甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿作为提取溶剂，其他提取条件为：微波温度70℃、功率700w、料液比1:8、提取时间5min。将提取液进行抽虑得滤液，再将滤液在旋转蒸发仪上浓缩得粗提物，算得量，选出最佳溶剂。

提取溶剂为甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿时的粗提物得量分别为：0.6931g、0.4040g、0.0899g、0.0492g。用HPLC检测4种溶剂所对应的峰面积、含量、纯度如表2所示，不同溶剂提取的雷公藤甲素含量如图3所示。

表2 不同溶剂所得雷公藤甲素的峰面积和含量

由表2和图3可知，当用甲醇做溶剂时，提取的的雷公藤甲素含量最高，提取效果最好，故选择甲醇作为提取溶剂，甲醇作为提取溶剂对应的雷公藤甲素HPLC谱图如图4所示。

2-2、提取功率的选择

分别准确称取5g脱脂后的雷公藤叶粉末加到5个干净的三颈瓶中，提取功率分别为500w、600w、700w、800w、900w，其他提取条件为：甲醇为提取溶剂，在微波温度70℃、料液比1:8、提取时间5min。将提取液进行抽虑得滤液，再将滤液在旋转蒸发仪上浓缩得粗提物，算得量，选出最佳功率。

功率为500w、600w、700w、800w、900w时的粗提物得量分别为：0.6612g、0.6840g、0.6406g、0.6519g、0.6294g。用HPLC检测5种功率所对应的峰面积、含量、纯度如表3所示，不同功率提取的雷公藤甲素含量如图5所示。

表3 不同功率所得雷公藤甲素的峰面积和含量、纯度

由图5表可知，随着微波提取功率的逐渐增加，雷公藤甲素的提取量先增加后降低，当功率为600w时雷公藤甲素含量最高，提取效果最好，故最佳提取功率为600w，提取功率所对应的雷公藤甲素HPLC谱图如图6所示。

2-3、料液比的选择

分别准确称取5g脱脂后的雷公藤叶粉末加到5个干净的三颈瓶中，料液比分别为1:6、1:8、1:10、1:12、1:14，其他提取条件为：以甲醇为提取溶剂，在微波温度70℃、功率600w、提取时间5min。将提取液进行抽虑得滤液，再将滤液在旋转蒸发仪上浓缩得粗提物，算得量，选出最佳料液比。

料液比为1:6、1:8、1:10、1:12、1:14时的粗提物得量分别为：0.6198g、0.6690g、0.6481g、0.6037g、0.6119g。用HPLC检测5种料液比所对应的峰面积、含量、纯度如表4所示，不同料液比提取的雷公藤甲素含量如图7所示。

表4 不同料液比所得雷公藤甲素的峰面积和含量、纯度

由图7和表4可知，当料液比为1:8时雷公藤甲素含量最高，提取效果最好，故最佳料液比为1:8，不一定所加的溶剂越多提取就越好，最佳料液比所对应的雷公藤甲素HPLC谱图如图8所示。

2-4、提取时间的选择

分别准确称取5g脱脂后的雷公藤叶粉末加到5个干净的三颈瓶中，提取时间为分别5min、10min、15min、20min、25min，其他提取条件为：甲醇为提取溶剂，在微波温度70℃、功率600w、料液比1:8。将提取液进行抽虑得滤液，再将滤液在旋转蒸发仪上浓缩得粗提物，算得量选出最佳提取时间。

提取时间为5min、10min、15min、20min、25min时的粗提物得量分别为：0.6790g、0.7186g、0.6992g、0.6908g、0.6893g。用HPLC检测5种提取时间所对应的峰面积、含量、纯度如表5所示；不同时间提取的雷公藤甲素含量如图9所示；

表5 不同提取时间所得雷公藤甲素的峰面积和含量、纯度

由表5和图9可知，当提取时间为20min时雷公藤甲素含量最高，提取效果最好。故最佳提取时间为20min，最佳提取时间所对应的雷公藤甲素面积如图10所示。

2-5、提取次数的选择

分别准确称取5g脱脂后的雷公藤叶粉末加到3个干净的三颈瓶中，提取条件为：甲醇为提取溶剂，在微波温度70℃、功率600w、料液比1:8、提取时间10min的，对提取次数进行研究，提取次数分别为：1次、2次、3次。将提取液进行抽虑得滤液，再将滤液在旋转蒸发仪上浓缩得粗提物，算得量。

提取第1次、第2次、第3次的粗提物得量为：0.7211g、0.1510g、0.0800g。用HPLC检测回流提取法、超声提取法所对应的峰面积、含量、纯度如表6所示，比较图如图11所示。

表6 三次提取所得雷公藤甲素的峰面积和含量、纯度

由表6和图11可知，当提取1次时得到雷公藤甲素含量为0.1430mg，而当提取第二次时只多提取出0.0194mg，不到第一次的14％，第三次更少，只有0.0043mg，所以本实施例中的提取次数为1次。

对比例：微波辅助萃取法与常规提取方法对比

回流提取法：

准确称取5g雷公藤叶粉末样品加到干净的三颈瓶中，在料液比1:8的条件下，以甲醇为提取溶剂，进行回流提取120min。将提取液进行抽虑得滤液，再将滤液在旋转蒸发仪上浓缩得粗提物，算得量。

超声提取法：

准确称取5g雷公藤叶粉末样品到干净的三颈瓶中，在料液比1:8、超声功率250w的条件下，以甲醇为提取溶剂，进行超声提取60min。将提取液进行抽虑得滤液，再将滤液在旋转蒸发仪上浓缩得粗提物，算得量。

回流提取的粗提物得量为：0.7826g；超声提取法的粗提物得量为0.6318g。用HPLC检测回流提取法、超声提取法所对应的峰面积、含量、纯度，并与相同条件下微波辅助萃取法所对应的峰面积、含量、纯度作比较，数据如表8所示，比较图如图12所示；回流提取所对应的雷公藤甲素HPLC谱图如图13所示；超声提取所对应的雷公藤甲素HPLC谱图如图14所示。

表7 三种提取方法所得雷公藤甲素的峰面积和含量、纯度

从表7可知，回流提取法提取出的雷公藤甲素含量较低，微波辅助萃取法略高于超声提取法，但超声提取需耗时60min，微波萃取的3倍，因此可见微波辅助萃取法比回流提取法和超声提取法更为适合本实验，也可看出微波辅助萃取具有升温快，萃取时间短，萃取效率高，温度、时间、压力可控等优点。

Claims

1.一种微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法，其特征在于包括以下步骤：

(3)检测：采用HPLC进行检测，HPLC的色谱条件为：色谱柱为KromasilODS-C18(4.6mm×250mm)，流动相为乙腈-水，检测波长为218nm，柱温为室温，流速为0.5～0.7mL/min，进样量为20μL。

2.如权利要求1所述的微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法，其特征在于，所述雷公藤粉末与提取溶剂的料液比为1:8。

3.如权利要求1或2所述的微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法，其特征在于，所述提取溶剂为甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿中的至少一种。

4.如权利要求3所述的微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法，其特征在于，所述提取溶剂为甲醇。

5.如权利要求1所述的微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法，其特征在于，所述微波温度70℃、微波功率600w条件下微波提取20min，提取次数为1次。

6.如权利要求1所述的微波辅助提取/HPLC检测雷公藤叶中雷公藤甲素的方法，其特征在于，所述步骤(3)中流动相中乙腈-水的体积比为4:6，所述流速为0.7mL/min。