CN104147079B - 超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷及其提取和测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明超声‑微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法包括如下步骤，1)得到山茱萸粗粉；2)将山茱萸粗粉按料液比为1:5～1:25的比例加入体积分数为80％的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率300～700W，超声功率120～600W的条件下提取3～15min得到提取液；3)将提取液抽滤后得到滤液，经定容过滤浓缩干燥纯化后得到本发明提供的山茱萸环烯醚萜苷。山茱萸环烯醚萜苷测定方法包括如下步骤，a.混合对照品溶液的制备；b.供试品溶液的制备，c.采用HPLC‑UV法测定混合对照品及供试品中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷的含量；d.根据液相色谱分析结果计算分别得到4种苷的含量。

Description

超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷及其提取和测定 方法

技术领域

本发明属于山茱萸环烯醚萜苷的提取和测定领域，具体为超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷及其提取和测定方法。

背景技术

山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，其味酸、涩，性微温，归肝、肾经，具有补益肝肾、涩精固脱之功效，主治眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴。主产于我国陕西、浙江和河南等省，四川、安徽、山东、山西等地亦有栽培。山茱萸是常用中成药“六、八味地黄丸”、“杞菊地黄丸”等的原料，为我国传统名贵中药材，是国家40种用量较大的重点药材之一。近年来，国内外学者对山茱萸的多种有效成分进行了研究，从中分离得到环烯醚萜苷类、总多糖、鞣质和皂苷等多种活性成分，莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷为环烯醚萜苷类物质中的主要成分，具有抗肿瘤、降血糖、保肝和调节免疫等药理作用。因此，山茱萸环烯醚萜苷的开发及利用对人体的功能保健具有重要意义。

山茱萸环烯醚萜苷的提取方法主要为索式提取、加热回流提取、超声辅助提取、微波辅助提取、索式提取和加热回流提取这两种传统方法均具有提取时间长，提取率低，提取物结构易被破坏等缺点。而环烯醚萜苷类成分性质大多不稳定，遇酸、高温等易分解，而索式提取和加热回流提取法正是利用高温冷凝回流使原料成分析出，而单纯的超声辅助提取可以利用超声波产生强烈的振动、空化和搅拌等作用，加速物质的溶解度和运动速度，但是提取时间相对较长；微波辅助提取法具有选择性高、提取时间短等优点，但其受热不均匀。

现有技术中，不仅对山茱萸环烯醚萜苷的提取方法不能满足要求，而且不能对提取后得到产物中的有效物质的含量进行快速有效的同时分离和测定，测定山茱萸多种有效成分的HPLC色谱方法具有色谱峰分离度低，且各色谱峰没有完全达到基线分离。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种操作简单，耗时短，提取效率高，检测准确，重现性好的超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷及其提取和测定方法。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法，包括如下步骤，

(1)将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却，剥除果核；将剩余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸粗粉；

(2)称取一定量的山茱萸粗粉，置于反应容器中，按料液比为1:5～1:25的比例加入体积分数为80％的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率300～700W，超声功率120～600W的条件下提取3～15min得到提取液；

(3)将提取液抽滤后得到滤液，将滤液用80％的甲醇溶液补充至称定的重量，摇匀过0.22μm微孔滤膜，浓缩干燥，再经纯化后得到山茱萸环烯醚萜苷。

优选的，步骤2)中，1:15～1:25的比例加入体积分数为80％的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率500～700W，超声功率240～480W的条件下提取6～12min得到提取液。

优选的，步骤2)中，1:21的比例加入体积分数为80％的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率641W，超声功率360W的条件下提取9min得到提取液。

进一步的，料液比1:21，微波功率为641W，超声功率为360W和时间9min的提取条件由响应面法优化得到，步骤如下；

1)制备山茱萸环烯醚萜苷样品液；精密称取山茱萸粗粉1.00g，置于反应瓶中，加入80％甲醇溶液密封，称定重量，连接好回流装置，超声微波组合反应系统中提取，抽滤，所得滤液再用80％甲醇溶液补至原重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，得到山茱萸环烯醚萜苷样品液备用；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照品1.00、0.50、0.10、0.20mg，置1mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，0.22μm微孔滤膜过滤即得1.00mg/mL莫诺苷、0.50mg/mL马钱苷、0.10mg/mL獐芽菜苷和0.20mg/mL山茱萸新苷混合对照品溶液；绘制标准曲线得线性回归方程，并根据线性回归方程计算出山茱萸样品液中环烯醚萜苷的含量；

2)单因素实验；根据步骤1)中山茱萸环烯醚萜苷样品液的制备方法，分别按料液比、超声功率、微波功率和提取时间四个单因素设计若干组单因素实验；

3)响应面法优化；以山茱萸环烯醚萜苷提取率为响应因子，采用Design-Expert软件中的Box-Behnken原理在步骤2)中单因素实验的基础上进行响应面实验，模拟得到二次多元回归方程如下：

R1＝26.25+0.49A-0.098B+1.42C-0.080D+0.21AB+0.65AC+0.88AD-0.29BC+0.54BD-0.22CD-0.91A²-1.02B²-2.89C²

其中，R1为相应因子，A为微波功率的影响量，B为超声功率的影响量，C为料液比的影响量，D为时间的影响量；

4)通过Design-Expert软件对回归方程的求解，得到山茱萸环烯醚萜苷提取的最佳条件为：料液比1:21.45、微波功率640.57W、超声功率356.59W、时间9.22min；再以实际操作为约束条件，将修正得到最佳提取工艺参数为：料液比1:21、微波功率641W、超声功率360W、时间9min。

本发明超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷，由所述的任意一种所述的提取方法制得。

再进一步，山茱萸环烯醚萜苷至少包括莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四种物质。

本发明超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷的测定方法，对再进一步中所述的山茱萸环烯醚萜苷进行测定，包括如下步骤，

a.混合对照品溶液的制备；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照品1.00、0.50、0.10、0.20mg，置1mL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容，0.22μm微孔滤膜过滤即得1.00mg/mL莫诺苷、0.50mg/mL马钱苷、0.10mg/mL獐芽菜苷和0.20mg/mL山茱萸新苷混合对照品溶液；

b.供试品溶液的制备，精密称取过40目筛的山茱萸粉末1.00g，置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，加入80％甲醇溶液21mL密封，称定重量，连接好回流装置，于XO-200超声微波组合反应系统中提取9min，取出，抽滤，所得滤液再用80％甲醇溶液补至原重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜作供试液；

c.测定法；采用HPLC-UV法测定混合对照品及供试品中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷的含量；具体如下，

色谱条件：色谱柱：采用JADE-PAK ODS-AQ色谱柱为C18柱；柱温：35℃；检测波长：240nm；梯度洗脱条件：乙腈-0.2％乙酸水溶液梯度洗脱，A为0.2％乙酸水，B为乙腈；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；

以体积百分比计算，梯度洗脱阶段如下，

0～15min，A从90％线性下降至80％，B从10％线性增加至20％；

15～19min，A从80％线性下降至78％，B从20％线性增加至22％；

19～25min，A从78％线性下降至75％，B从22％线性增加至25％；

25～35min，A从75％线性下降至73％，B从25％线性增加至27％；

35～50min，A从73％线性下降至0％，B从27％线性增加至100％，

50～55min，为100％B等度洗脱；

d.根据液相色谱分析结果计算分别得到山茱萸药材中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷的含量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明所述提取方法通过将超声振动与脉冲式微波两种作用方式结合，利用微波的高能作用与超声波的空化作用，实现对样品快速、高效、可靠地处理，是一种新型的提取技术；其微波快速加热和超声波空化作用使样品获得足够的热转移和乳化特性，进而加速了分子的热运动速度和相互碰撞作用，具有提取时间短、提取率高、提取物结构未被破坏等优点；能够提高样品的提取率，缩短样品的制备时间，从而达到降低生产成本的目的。

进一步的，由于中药提取过程中常常受到诸多因素的影响，响应面法和超声-微波协同提取方法的有机结合不仅可以精确地找出整个区域上因素的最佳组合，而且可以确定在试验范围内的任何试验点的预测值，通过将响应面分析法用于工艺条件的优化，精确的表达因素和响应值之间的关系，同时可根据数学模型控制响应值，选择不同的操作参数，得到最佳工艺参数。相比现有的正交设计、索式提取、回流提取和单独的超声波辅助提取或微波辅助提取法，采用响应面法优化的超声-微波提取工艺更为精准，能够更好的将山茱萸环烯醚萜苷的提取用于工业化生产；比索式提取法提高了36.13％，超声辅助提取法提高了28.00％，比微波辅助提取法提高了10.22％。

本发明所述测定方法，采用高效液相紫外检测法，结合0.2％乙酸水溶液-乙腈流动相梯度洗脱，实现同时测定山茱萸中4种环烯醚萜苷的含量。本发明所建立的色谱方法能够较好地分离和测定山茱萸中4种环烯醚萜苷的含量，其色谱峰峰形好，分离度高，能够准确地测定山茱萸药材中4种环烯醚萜苷的含量。本方法操作简单，精密度、重现性和稳定性良好，可为山茱萸环烯醚萜苷的分离纯化和质量标准控制提供科学依据，并且能够通过HPLC法同时对山茱萸中4种环烯醚萜苷含量的测定，更好的优化最佳的超声-微波协同提取工艺，从而为山茱萸环烯醚萜苷的药理作用及生产实践方面的应用提供基础。

附图说明

图1：料液比对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图。

图2：提取时间对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图。

图3：超声功率对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图。

图4：微波功率对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图。

图5：超声功率和微波功率对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，5a为响应面图，5b为等高线图。

图6：料液比和微波功率对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，6a为响应面图，6b为等高线图。

图7：提取时间和微波功率对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，7a为响应面图，7b为等高线图。

图8：料液比和超声功率对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，8a为响应面图，8b为等高线图。

图9：提取时间和超声功率对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，9a为响应面图，9b为等高线图。

图10：提取时间和料液比对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，10a为响应面图，10b为等高线图。

图11：对照品图色谱图，其中：1-莫诺苷，2-马钱苷，3-獐芽菜苷，4-山茱萸新苷。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法，包括如下步骤，1)将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却，剥除果核；将剩余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸粗粉；

2)称取一定量的山茱萸粗粉，置于反应容器中，按料液比为1:5～1:25的比例加入体积分数为80％的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率300～700W，超声功率120～600W的条件下提取3～15min得到提取液；3)将提取液抽滤后得到滤液，将滤液用80％的甲醇溶液补充至称定的重量，摇匀过0.22μm微孔滤膜，浓缩干燥，再经纯化后得到山茱萸环烯醚萜苷。

本优选实施例中还能够在步骤2)中，以1:15～1:25的比例加入体积分数为80％的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率500～700W，超声功率240～480W的条件下提取6～12min得到提取液。除了以上所述的两个范围的端点值外，具体的以，1:21的比例加入体积分数为80％的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率641W，超声功率360W的条件下提取9min得到提取液为例，以其中的点值进行说明，同时还能够取到限定范围内的其他值。

其中，料液比1:21，微波功率为641W，超声功率为360W和时间9min的提取条件由响应面法优化得到，步骤如下；

1)制备山茱萸环烯醚萜苷样品液；精密称取山茱萸粗粉1.00g，置于反应瓶中，加入80％甲醇溶液密封，称定重量，连接好回流装置，超声微波组合反应系统中提取，抽滤，所得滤液再用80％甲醇溶液补至原重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，得到山茱萸环烯醚萜苷样品液备用；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照品1.00、0.50、0.10、0.20mg，置1mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，0.22μm微孔滤膜过滤即得1.00mg/mL莫诺苷、0.50mg/mL马钱苷、0.10mg/mL獐芽菜苷和0.20mg/mL山茱萸新苷混合对照品溶液；绘制标准曲线得线性回归方程，并根据线性回归方程计算出山茱萸样品液中环烯醚萜苷的含量；

2)单因素实验；根据步骤1)中山茱萸环烯醚萜苷样品液的制备方法，分别按料液比、超声功率、微波功率和提取时间四个单因素设计若干组单因素实验；

3)响应面法优化；以山茱萸环烯醚萜苷提取率为响应因子，采用Design-Expert软件中的Box-Behnken原理在步骤2)中单因素实验的基础上进行响应面实验，模拟得到二次多元回归方程如下：

R1＝26.25+0.49A-0.098B+1.42C-0.080D+0.21AB+0.65AC+0.88AD-0.29BC+0.54BD-0.22CD-0.91A²-1.02B²-2.89C²

其中，R1为相应因子，A为微波功率的影响量，B为超声功率的影响量，C为料液比的影响量，D为时间的影响量；

4)通过Design-Expert软件对回归方程的求解，得到山茱萸环烯醚萜苷提取的最佳条件为：料液比1:21.45、微波功率640.57W、超声功率356.59W、时间9.22min；再以实际操作为约束条件，将修正得到最佳提取工艺参数为：料液比1:21、微波功率641W、超声功率360W、时间9min。

本发明中所述的超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷，由以上所述的提取方法制得。优选的山茱萸环烯醚萜苷至少包括莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四种物质。

本发明超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷的测定方法，对至少包括莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四种物质的山茱萸环烯醚萜苷进行测定，包括如下步骤，

a.混合对照品溶液的制备；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照品1.00、0.50、0.10、0.20mg，置1mL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容，0.22μm微孔滤膜过滤即得1.00mg/mL莫诺苷、0.50mg/mL马钱苷、0.10mg/mL獐芽菜苷和0.20mg/mL山茱萸新苷混合对照品溶液；

b.供试品溶液的制备，精密称取过40目筛的山茱萸粉末1.00g，置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，加入80％甲醇溶液21mL密封，称定重量，连接好回流装置，于XO-200超声微波组合反应系统中提取9min，取出，抽滤，所得滤液再用80％甲醇溶液补至原重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜作供试液；

c.测定法；采用HPLC-UV法测定混合对照品及供试品中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷的含量；具体如下，

色谱条件：色谱柱：采用JADE-PAK ODS-AQ色谱柱为C18柱；柱温：35℃；检测波长：240nm；梯度洗脱条件：乙腈-0.2％乙酸水溶液梯度洗脱，A为0.2％乙酸水，B为乙腈；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；

以体积百分比计算，梯度洗脱阶段如下，

0～15min，A从90％线性下降至80％，B从10％线性增加至20％；

15～19min，A从80％线性下降至78％，B从20％线性增加至22％；

19～25min，A从78％线性下降至75％，B从22％线性增加至25％；

25～35min，A从75％线性下降至73％，B从25％线性增加至27％；

35～50min，A从73％线性下降至0％，B从27％线性增加至100％，

50～55min，为100％B等度洗脱；

d.根据液相色谱分析结果计算分别得到山茱萸药材中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷的含量。

为了确定本发明的最佳原料配比和最佳工艺步骤，发明人进行了大量的实验室研究试验，具体的试验情况如下。

仪器与试药

仪器：LC-2010A HT型高效液相色谱仪(日本SHIMADZU)，超纯水仪(美国Millipore公司)，精密微量移液器(德国Eppendorf公司)，Centrifuge5804R冷冻台式离心机(德国Eppendorf公司)，FA2004N型电子分析天平(上海天平仪器总厂)，XO-200微波超声波组合反应系统(南京先欧仪器制造有限公司)，DFT-50手提式粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHB-HIA型循环水式多用真空泵(陕西太康生物科技有限公司)。

试剂：马钱苷(成都曼斯特生物，批号：MUST-12052813，纯度：≥98％)；獐牙菜苷(四川省维克奇生物科技有限公司,批号：130311：纯度：≥98％)；莫诺苷(天津一方生物科技有限公司，批号：MUST-13070102，纯度：≥98％)；山茱萸新苷(成都普菲德生物技术有限公司，批号：121015，纯度：≥98％)甲醇为分析纯(河北天力试剂有限公司)；乙腈，冰乙酸均为色谱醇(美国Fisher公司)；水为超纯水。

药材：山茱萸于2011年10月至11月采集于河南西峡，经陕西师范大学肖娅萍教授鉴定为山茱萸科山茱萸(Cornus officinalis Sieb.Et Zucc.)的干燥成熟果肉，50℃烘干，粉碎后过40目筛，备用。

方法与结果

混合对照品溶液的制备：分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照品1.00、0.50、0.10、0.20mg，置1mL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容，0.22μm微孔滤膜过滤即得1.00mg/mL莫诺苷、0.50mg/mL马钱苷、0.10mg/mL獐芽菜苷和0.20mg/mL山茱萸新苷混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密称取过40目筛的山茱萸粉末1.00g，置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，加入80％甲醇溶液21mL密封，称定重量，连接好回流装置，于XO-200超声微波组合反应系统中提取9min，取出，抽滤，所得滤液再用80％甲醇溶液补至原重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜作供试液。

色谱条件

色谱柱：JADE-PAK ODS-AQ C₁₈极性色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温：35℃，流速：1.0mL/min，检测波长：240nm，进样量：10μL。流动相：A为0.2％乙酸水，B为乙腈；梯度洗脱条件：0～15min，10％～20％B；15～19min，20％～22％B；19～25min，22％～25％B；25～35min，25％～27％B；35～50min，27％～100％B；50～55min，100％B等度洗脱。山茱萸对照品色谱图见图11。

方法学考察

线性关系考察

依次进已配制的莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和莫诺苷混合对照品溶液1、4、10、14、18μL，于240nm波长下检测各物质的峰面积，以峰面积值为纵坐标，各对照品含量为横坐标进行线性回归，得回归方程。结果详见表1。

表1 线性关系试验结果(n＝3)

Table 1 Linear relation between peak area and concentration.n＝3

精密度试验

精密吸取已配制好的混合对照品溶液10μL,连续进样6次，测定环烯醚萜苷的RSD为0.23％。表明仪器精密度良好。

重现性试验

按上述方法制备6份山茱萸(河南西峡)供试样品溶液，在上述色谱条件下进样10μL测定峰面积，其RSD值为0.89％，说明该方法的重复性良好。

稳定性试验

取上述山茱萸供试样品溶液10μL，分别于0，2，4，6，8，12，24h在上述色谱条件下进样测定，其RSD值为1.76％，结果表明样品溶液在24h内稳定。

加样回收率试验

精密称取已测定含量的山茱萸药材(河南西峡)6份，每份1g，分别精密加入与样品中含有量相当的莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷的对照品，按上述方法制备供试样品溶液，在上述色谱条件下，进样10μL，进行分析测定，计算加样回收率。结果取6次的平均值，测得平均回收率(n＝6)为100.67％；RSD为1.31％。结果表明回收率良好。

单因素试验及结果

根据样品液的制备方法，分别设置料液比(1:5、1:10、1:15、1:20、1:25)、超声功率(120、240、360、480、600W)、微波功率(300、400、500、600、700W)和提取时间(3、6、9、12、15min)4个单因素实验，研究各个因素对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响。选取料液比、提取时间、超声功率和微波功率4个影响山茱萸环烯醚萜苷提取效果的因素，以山茱萸环烯醚萜苷含量为指标确定这4个因素的适宜范围。单因素结果见图1-图4。图1为料液比对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图；其中，超声功率360W，微波功率500W，甲醇体积分数80％，提取时间10min；图2为提取时间对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图，其中，超声功率360W，微波功率500W，甲醇体积分数80％，料液比1:20；图3为超声功率对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图，其中，微波功率500W，甲醇体积分数80％，料液比1:20，提取时间9min；图4为微波功率对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图，其中，超声功率360W，甲醇体积分数80％，料液比1:20，提取时间9min；实验结果显示料液比、提取时间、超声功率和微波功率均对山茱萸环烯醚萜苷含量有较大影响，所以初步选定超声-微波协同提取的最佳工艺条件为料液比1:20、提取时间9min、超声功率360W、微波功率600W。

响应面试验，采用Design-Expert8.0.5.0软件研究料液比、提取时间、超声功率和微波功率4个因素对山茱萸环烯醚萜苷的影响，并用Box-Behnken中心组合设计(BBD)的试验方案，进行4因素3水平的响应面试验。

响应面的实验设计及结果，根据Box-Behnken试验设计原理，运用Design-Expert8.0.5.0软件对微波功率(A)、超声功率(B)、料液比(C)、提取时间(D)四个因素作进一步优化。响应面分析因素与水平和实验设计分别见表1和表2。

表2 响应曲面试验设计因素水平表

Table 2 Variables and levels of Box-Behnken design

方差分析及其显著性检验 以山茱萸环烯醚萜苷含量为响应值，用Design-Expert8.0.5.0软件对表2实验数据进行二次多项式逐步回归拟合，得到数学模型:

Y＝26.25+0.49A-0.098B+1.42C-0.080D+0.21AB+0.65AC+0.88AD-0.29BC+0.54BD-0.22CD-0.91A²-1.02B²-2.89C²，

回归方程的显著性检验及方差分析结果见表3。

表3 BBD实验设计和实验结果

Table 3 Box-Behnken design and observed responses

表4 拟合回归方程的方差分析结果

Table 4 Analysis result of variance(ANOVA)for the fitted quadraticpolynomial model

注：^*P＜0.05，差异显著，^**P＜0.01，差异极显著。

由表4方差分析可知，模型的P＜0.0001,表明试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性，失拟项P＝0.3481＞0.05,表明失拟项不显著。由此可见，该模型能够较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。该回归模型的调整确定系数为R² _Adj＝0.8714,即该模型能解释87.14％响应值的变化，模型拟合程度良好，试验误差小，说明应用响应曲面法优化山茱萸环烯醚萜苷的提取模型条件可行。此外，还可以明显看出，模型的一次项C极显著(P<0.01)，A显著(P<0.05)，且显著性顺序是料液比(C)＞微波功率(A)＞超声功率(B)＞提取时间(D)，二次项A²、B²、C²、D²均极显著影响(P<0.01)，交叉项AD显著(P<0.05)，其余交叉项均不显著，表明各因素对响应值的影响都不是简单的线性关系。微波功率、超声功率、液料比和提取时间的二次项均对山茱萸环烯醚萜苷的提取率有极显著影响。通过回归方程来绘制分析图，考察所拟合的响应曲面和等高线的形状，如图5-10。

如图5-10所示，从不同的三维响应图中预测了自变量微波功率、超声功率、料液比和提取时间的不同水平对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响。其中每个三维响应图和等高线图都代表了各独立变量之间的交互作用对响应值的影响。从响应曲面图的陡峭或拱形程度可看出独立变量之间的交互作用对响应值的影响，等高线图的形状和密集程度也可以反映出交互作用的强弱。

以图7为例，响应曲面陡峭且呈拱形，等高线成椭圆形且排列紧密，表明微波功率和提取时间的交互作用对响应值(R1)影响显著，与表4中的方差分析及单因素结果一致。其中，提取时间对响应值(R1)的影响比较显著，其曲线呈先增大后减小的趋势。微波功率的曲线比较平缓，表明其对响应值(R1)的影响较小。由此可以确定最佳的水平范围为提取时间9-10min，微波功率600-650W。同理可得出，图5微波功率比超声功率影响大，图6、图8、图10中料液比比微波功率、超声功率、提取时间影响大，图7、9、10中时间对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响较大。

参数优化及模型检验，运用Design-Expert8.0.5.0软件和其回归方程求出最佳的提取工艺为微波功率640.57W，超声功率为356.59W，料液比为1:21.45，提取时间为9.22min，在此条件下测得的山茱萸环烯醚萜苷含量为26.55mg/g。考虑到实际操作的具体情况，确定最终的提取工艺条件为：微波功率641W，超声功率360W，料液比1:21和提取时间9min。

为了验证模型方程的可靠性，采用上述最优条件进行山茱萸环烯醚萜苷含量的提取实验，并在此条件下提取6次，实际测得的平均含量为26.32mg/g，其相对标准偏差为1.8％。因此，采用响应面法优化得到的结果可靠。

不同方法的比较结果

通过索式提取法、超声辅助法、微波辅助法和超声-微波协同辅助法分别进行山茱萸环烯醚萜苷的提取，其结果见表5。由表5可知，三种方法之间的差异达到了极显著水平(P<0.01)，超声-微波协同辅助法对山茱萸环烯醚萜苷的提取率最高，与其他三种方法相比，环烯醚萜苷提取率比索式提取法提高了36.13％，超声辅助提取法提高了28.00％，比微波辅助提取法提高了10.22％。

表5 不同方法比较结果

注**代表p<0.01与超声-微波协同辅助法比较差异极显著

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法，其特征在于，包括如下步骤，

(1)将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却，剥除果核；将剩余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸粗粉；

(2)称取一定量的山茱萸粗粉，置于反应容器中，按料液比为1:21的比例加入体积分数为80％的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率641W，超声功率360W的条件下提取9min得到提取液；

(3)将提取液抽滤后得到滤液，将滤液用80％的甲醇溶液补充至称定的重量，摇匀过0.22μm微孔滤膜，浓缩干燥，再经纯化后得到山茱萸环烯醚萜苷；

所述的料液比1:21，微波功率为641W，超声功率为360W和时间9min的提取条件由响应面法优化得到，步骤如下；

1)制备山茱萸环烯醚萜苷样品液；

精密称取山茱萸粗粉1.00g，置于反应瓶中，加入80％甲醇溶液密封，称定重量，连接好回流装置，在超声-微波协同作用下中提取，抽滤，所得滤液再用80％甲醇溶液补至原重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，得到山茱萸环烯醚萜苷样品液备用；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照品1.00、0.50、0.10、0.20mg，置1mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，0.22μm微孔滤膜过滤即得1.00mg/mL莫诺苷、0.50mg/mL马钱苷、0.10mg/mL獐芽菜苷和0.20mg/mL山茱萸新苷混合对照品溶液；绘制标准曲线得线性回归方程，并根据线性回归方程计算出山茱萸样品液中环烯醚萜苷的含量；

2)单因素实验；根据步骤1)中山茱萸环烯醚萜苷样品液的制备方法，分别按料液比、超声功率、微波功率和提取时间四个单因素设计若干组单因素实验；

3)响应面法优化；以山茱萸环烯醚萜苷提取率为响应因子，采用Design-Expert软件中的Box-Behnken原理在步骤2)中单因素实验的基础上进行响应面实验，模拟得到二次多元回归方程如下：

R1＝26.25+0.49A-0.098B+1.42C-0.080D+0.21AB+0.65AC+0.88AD-0.29BC+0.54BD-0.22CD-0.91A²-1.02B²-2.89C²

其中，R1为相应因子，A为微波功率的影响量，B为超声功率的影响量，C为料液比的影响量，D为时间的影响量；

4)通过Design-Expert软件对回归方程的求解，得到山茱萸环烯醚萜苷提取的最佳条件为：料液比1:21.45、微波功率640.57W、超声功率356.59W、时间9.22min；再以实际操作为约束条件，将修正得到最佳提取工艺参数为：料液比1:21、微波功率641W、超声功率360W、时间9min。

2.超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷，其特征在于，所述的山茱萸环烯醚萜苷由权利要求1中所述的提取方法制得。

3.根据权利要求2所述的超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷，其特征在于，至少包括莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四种物质。

4.超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷的测定方法，其特征在于，对权利要求3所述的山茱萸环烯醚萜苷进行测定，包括如下步骤，

a.混合对照品溶液的制备；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照品1.00、0.50、0.10、0.20mg，置1mL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容，0.22μm微孔滤膜过滤即得1.00mg/mL莫诺苷、0.50mg/mL马钱苷、0.10mg/mL獐芽菜苷和0.20mg/mL山茱萸新苷混合对照品溶液；

b.供试品溶液的制备，精密称取过40目筛的山茱萸粗粉1.00g，置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，加入80％甲醇溶液21mL密封，称定重量，连接好回流装置，于XO-200超声微波组合反应系统中提取9min，取出，抽滤，所得滤液再用80％甲醇溶液补至原重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜作供试液；

c.测定法；采用HPLC-UV法测定混合对照品及供试品中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷的含量；具体如下，

色谱条件：色谱柱：采用JADE-PAK ODS-AQ色谱柱为C18柱；柱温：35℃；

检测波长：240nm；

梯度洗脱条件：乙腈-0.2％乙酸水溶液梯度洗脱，A为0.2％乙酸水，B为乙腈；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；

以体积百分比计算，梯度洗脱阶段如下，

0～15min，A从90％线性下降至80％，B从10％线性增加至20％；

15～19min，A从80％线性下降至78％，B从20％线性增加至22％；

19～25min，A从78％线性下降至75％，B从22％线性增加至25％；

25～35min，A从75％线性下降至73％，B从25％线性增加至27％；

35～50min，A从73％线性下降至0％，B从27％线性增加至100％，

50～55min，为100％B等度洗脱；

d.根据液相色谱分析结果计算分别得到山茱萸药材中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷的含量。