CN104231032A

CN104231032A - 一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯二醇的方法

Info

Publication number: CN104231032A
Application number: CN201310237971.3A
Authority: CN
Inventors: 沈剑; 屠雪姣
Original assignee: Ningbo University of Technology
Current assignee: Ningbo University of Technology
Priority date: 2013-06-13
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2014-12-24

Abstract

一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯二醇的方法，步骤为：雷公藤叶粉末通过乙醇水溶液提取，蒸去乙醇得到水悬浮物，向水悬浮物中加正己烷脱脂，取下相，加有机混合溶剂萃取，取有机相，蒸干得到有机相萃取物，有机相萃取物上硅胶柱层析，蒸干洗脱剂得到雷公藤内酯二醇粗品，用四元两相体系，对该粗品进行分配，取上相蒸干得到四元分配物，最后通过高速逆流色谱精制得到雷公藤内酯二醇精品。本发明的提取方法工艺简单、耗时短、易操作，所涉及到的溶剂不含对环境和人体损害较大的氯代溶剂，生产过程安全环保，而且成本低，提取的雷公藤内酯二醇的纯度在95%以上，提取率也较高。

Description

一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯二醇的方法

技术领域

本发明涉及植物有效成分的分离技术领域，具体涉及一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯二醇的方法。

背景技术

雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook F,简称TWHF）是卫矛科（Celastraceae）雷公藤属木质藤本植物，是雷公藤（Tripterygium）属植物的一种，主要分布于我国长江以南地区和东北长白山区。雷公藤，作为一种传统中药（traditional Chinese medicine,TCM）在中国有数百年的应用历史，最早记录于《神农本草经》，名莽草，在《纲目拾遗》中有详细记载，又名断肠草、山砒霜、南蛇藤，由于毒性大，民间也有用于杀虫、毒鼠等。作为药物，雷公藤的主要药理作用是免疫系统作用、抗炎、抗生育作用。雷公藤提取物在治疗风湿性关节炎、牛皮癣、红斑狼疮等显示出了良好的效果。

雷公藤中的药效成分主要是雷公藤二萜内酯、雷公藤三萜类、雷公藤生物碱等。雷公藤内酯二醇（tripdiolide），又名雷公藤乙素（CAS No.38647-10-8），有的文献上称为T8，是从雷公藤中分离出来的含有3个环氧基的二萜内酯化合物，为无色针状晶体(二氯甲烷-乙醚结晶)，相对分子质量为376，分子式为C₂₀H₂₄O₇，分子结构中有α,β-不饱和醛酮内酯环，熔点210～211°C，易溶于氯仿、二氯甲烷、乙醇、甲醇等，不溶于石油醚、正己烷、微溶于水。雷公藤内酯二醇是雷公藤的主要活性成分之一，为中药雷公藤多甙片的主要有效化合物。

现有文献报道分离得到雷公藤内酯二醇的方法：雷公藤提取物经过反复柱层析分离，过程繁琐、耗时长；也有文献报道采用制备高效液相制备分离雷公藤内酯二醇，但每次进样操作样品少，成本高；还有采用柱层析结合结晶方法分离雷公藤内酯二醇的，但该方法雷公藤内酯二醇损失较大。

高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography,HSCCC）是20世纪80年代发展起来的一种高效的液-液分配色谱分离技术。高速逆流色谱与柱色谱（columnchromatography,CC）相比，不存在固体支撑，避免了不可逆吸附，从而避免了样品的损失、失活、变性，分离时间短，节省溶剂；与制备高效液相色谱（PHPLC）相比，样品可以直接进样，没有纯度要求，而且样品可以全部回收，上样量大，重复性好，设备操作方便简单。通过以上对高速逆流色谱的了解，高速逆流色谱适用于植物有效成分的提取分离，特别是适用于植物有效成分分离的最后精制纯化步骤。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯二醇的方法，具有工艺简单、耗时短、生产过程环保、成本低的特点，同时提取的雷公藤内酯二醇的提取率和纯度均较高。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯二醇的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将雷公藤叶磨成粉末，过筛，用乙醇水溶液回流提取后，将得到的提取液蒸去乙醇得到水悬浮物；

2）在水悬浮物中加入1～3倍体积的正己烷或60～90℃石油醚或庚烷搅拌混合，过滤分层后取水相，加入1～2倍水相体积的有机混合溶剂搅拌，分层后分液，取上相蒸干得到有机相萃取物；

3）将有机相萃取物上硅胶柱层析，然后用体积比为1:2～3的正己烷和乙酸乙酯的混合物洗脱，洗脱液浓缩蒸干得到雷公藤内酯二醇粗品；

4）雷公藤内酯二醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水所构成的四元两相体系分配，其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为1～2:8～10:1～2:8～10，分液，下相蒸干得到四元分配物；

5）将上述四元分配物上高速逆流色谱进行精制，所用的溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为1～2:4～6:1～2:4～6，置于分液漏斗中，摇匀、静置分层，平衡后，将上、下相分开；用上相作固定相，下相作流动相；或者下相作为固定相，上相作为流动相，控制仪器转速为450～550r/min，流速为4.5～5.5mL/min，根据检测器的谱图分步收集目标物，减压浓缩得到雷公藤内酯二醇精品。

作为改进，所述步骤1）中的乙醇水溶液为含水体积浓度10～30%的乙醇，回流提取为2～4次，每次提取0.5～2小时，每次每克雷公藤叶粉末用含水体积浓度10～30%的乙醇6～10毫升。

作为改进，所述步骤2）中的过滤后滤液分层是采用静置放置1～12小时。

作为优选，所述步骤2）中的有机混合溶剂为乙酸乙酯和甲醇的混合物，其体积比为20～5:1。

作为改进，所述步骤3）中的正己烷和乙酸乙酯中的正己烷可采用60～90℃石油醚或庚烷进行替换。

再改进，所述步骤3）中的硅胶柱层析的具体参数为：每克有机相萃取物吸附在一克硅胶上，每克有机相萃取物需硅胶填料50～100克，需用体积比为1:2～3的正己烷和乙酸乙酯的混合物250～500毫升洗脱。

再改进，所述步骤5）中上相作固定相，下相作流动相时，用上相充满整个高速逆流色谱中色谱柱，调整高速逆流色谱主机正转，将下相从柱子的首端泵入柱内进行洗脱，待整个体系建立动态平衡后由进样阀进样。

再改进，所述步骤5）中用下相作为固定相，上相作为流动相，用下相充满整个高速逆流色谱中色谱柱，调整高速逆流色谱主机正转，将上相从柱子的尾端泵入柱内进行洗脱；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样。

与现有技术相比，本发明的优点在于：从雷公藤内酯二醇的溶解特性出发，用几种对环境影响较小的常用溶剂，通过乙醇水溶液提取，正己烷萃取脱脂，尽可能地减少了提取过程中雷公藤内酯二醇的损失，有效除杂减少后续工序的处理量，同时减少了柱层析上样负荷，降低了成本；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水构成的四元两相体系对雷公藤内酯二醇粗品进行分配，有效减少了高速逆流色谱步骤的进样量，提高生产效率。本发明的提取方法工艺简单、耗时短、易操作，所涉及到的溶剂不含对环境和人体损害较大的氯代溶剂，生产过程安全环保，而且成本低，提取的雷公藤内酯二醇的质量纯度在95%以上，提取率也较高。

附图说明

图1是本发明的雷公藤内酯二醇的结构式。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明从雷公藤内酯二醇的溶解特性（雷公藤内酯二醇易溶于氯仿、二氯甲烷、乙醇、甲醇等，不溶于石油醚、正己烷、微溶于水）出发，用几种对环境影响较小的常用溶剂，通过乙醇水溶液提取，正己烷萃取脱脂，尽可能地减少了提取过程中雷公藤内酯二醇的损失，同时减少了柱层析的上样负荷，降低了成本，通过一次简单柱层析，得到雷公藤内酯二醇粗品。为了减少高速逆流色谱的进样负荷，提高生产效率，将雷公藤内酯二醇粗品用高速逆流色谱常用的四元两相溶剂体系进行分配，能够进一步除杂，富集雷公藤内酯二醇。最后通过高速逆流色谱（HSCCC）精制得到质量纯度在95%以上的雷公藤内酯二醇精品。

实施例1

1kg干燥的雷公藤叶磨成粉末，先用含水10%的乙醇水溶液搅拌回流提取三次，每次提取0.5小时，每次乙醇水溶液用量为6L，合并乙醇水溶液提取液，蒸去乙醇得到水悬浮液。向水悬浮物中加1倍体积的正己烷搅拌混合，过滤，滤液分层1小时，分液，上相为有机相，下相为水相。取下相，加入2倍水相体积的有机混合溶剂（乙酸乙酯和甲醇组成的体积比为20:1），搅拌混合、并静置分层12小时，取上相蒸干得到有机相萃取物。有机相萃取物上硅胶柱层析，用体积比为1:2的正己烷和乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液浓缩蒸干得雷公藤内酯二醇粗品。雷公藤内酯二醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水所构成的四元两相体系分配，其体积比为1:10:1:10（10毫升：100毫升：10毫升：100毫升），分液，下相蒸干得到雷公藤内酯二醇富集物。雷公藤内酯二醇富集物用高速逆流色谱精制，所用的两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，其体积比为2:5:2:5，上相为固定相下相为流动相，仪器操作转速为500r/min，流速为5mL/min，收集含雷公藤内酯二醇部分浓缩蒸干得到雷公内酯二醇精品50mg，质量纯度96%。

实施例2

1kg干燥的雷公藤叶磨成粉末，先用含水20%的乙醇水溶液搅拌回流提取两次，每次提取2小时，每次乙醇水溶液用量为10L，合并乙醇水溶液提取液，蒸去乙醇得到水悬浮液。向水悬浮物中加2倍体积的60-90℃石油醚拌混合，过滤，滤液分层6小时，分液，上相为有机相，下相为水相。取下相，加入1倍水相体积的有机混合溶剂（乙酸乙酯和甲醇组成的体积比为10:1），搅拌混合、并静置分层12小时，取上相蒸干得到有机相萃取物。有机相萃取物上硅胶柱层析，用体积比为1:2.5的正己烷和乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液浓缩蒸干得雷公藤内酯二醇粗品。雷公藤内酯二醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水所构成的四元两相体系分配，其体积比为2:8:2:8（20毫升：80毫升：20毫升：80毫升），分液，下相蒸干得到雷公藤内酯二醇富集物。雷公藤内酯二醇富集物用高速逆流色谱精制，所用的两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，其体积比为1:4:1:4，上相为固定相下相为流动相，仪器操作转速为500r/min，流速为5mL/min，收集含雷公藤内酯二醇部分浓缩蒸干得到雷公内酯二醇精品40mg，质量纯度97%。

实施例3

1kg干燥的雷公藤叶磨成粉末，先用含水30%的乙醇水溶液搅拌回流提取两次，每次提取1小时，每次乙醇水溶液用量为8L，合并乙醇水溶液提取液，蒸去乙醇得到水悬浮液。向水悬浮物中加3倍体积的正庚烷拌混合，过滤，滤液分层12小时，分液，上相为有机相，下相为水相。取下相，加入1倍水相体积的有机混合溶剂（乙酸乙酯和甲醇组成的体积比为5:1），搅拌混合、并静置分层8小时，取上相蒸干得到有机相萃取物。有机相萃取物上硅胶柱层析，用体积比为1:3的正己烷和乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液浓缩蒸干得雷公藤内酯二醇粗品。雷公藤内酯二醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水所构成的四元两相体系分配，其体积比为1:9:1:9（10毫升：90毫升：10毫升：90毫升），分液，下相蒸干得到雷公藤内酯二醇富集物。雷公藤内酯二醇富集物用高速逆流色谱精制，所用的两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，其体积比为1:6:1:6，上相为固定相下相为流动相，仪器操作转速为500r/min，流速为7mL/min，收集含雷公藤内酯二醇部分浓缩蒸干得到雷公内酯二醇精品45mg，质量纯度96%。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯二醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：

5）将上述四元分配物上高速逆流色谱进行精制，所用的溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为1～2:4～6:1～2:4～6，置于分液漏斗中，摇匀、静置分层，平衡后，将上、下相分开；用上相作固定相，下相作流动相；或者下相作为固定相，上相作为流动相，控制仪器转速为500r/min，流速为4～7mL/min，根据检测器的谱图分步收集目标物，减压浓缩得到雷公藤内酯二醇精品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中的乙醇水溶液为含水体积浓度10～30%的乙醇，回流提取为2～4次，每次提取0.5～2小时，每次每克雷公藤叶粉末用含水体积浓度10～30%的乙醇6～10毫升。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2）中的过滤后滤液分层是采用静置放置1～12小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中的有机混合溶剂为乙酸乙酯和甲醇的混合物，其体积比为20～5:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中的正己烷和乙酸乙酯的混合物中的正己烷可采用60～90℃石油醚或庚烷进行替换。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中的硅胶柱层析的具体参数为：每克有机相萃取物吸附在一克硅胶上，每克有机相萃取物需硅胶填料50～100克，需用体积比为1:2～3的正己烷和乙酸乙酯的混合物250～500毫升洗脱。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤5）中上相作固定相，下相作流动相时，用上相充满整个高速逆流色谱中色谱柱，调整高速逆流色谱主机正转，将下相从柱子的首端泵入柱内进行洗脱，待整个体系建立动态平衡后由进样阀进样。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤5）中用下相作为固定相，上相作为流动相，用下相充满整个高速逆流色谱中色谱柱，调整高速逆流色谱主机正转，将上相从柱子的尾端泵入柱内进行洗脱；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样。