CN102093325B - 一种高纯度高车前素和泽兰黄酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用高速逆流色谱法从荔枝草中分离高纯度高车前素和泽兰黄酮的制备方法，包括：(1)配制合适的溶剂体系，静置分层后得上相下相；(2)选择上相为固定相，下相为流动相，先用固定相充满逆流色谱仪柱子，调节主机转速为600-1000rpm，将流动相以0.5-5.0ml/min的流速泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；(3)根据检测器紫外图谱接收目标成分，浓缩、结晶，即得。本方法适用各种型号高速逆流色谱仪和各种含量毛蕊异黄酮的制备，具有分离量大，回收率高，操作简便的特点。
Description
技术领域
本发明属于天然黄酮类物质制备领域，特别涉及一种高纯度高车前素和泽兰黄酮的制备方法。
背景技术
荔枝草(Salvia plebeia R.Br.)系唇形科鼠尾草属植物地上部分，又名蛤蟆草、雪见草、过冬青等。一年生或二年生直立草本植物，全国分布于除西北以外的其它地区，主产于江苏，浙江，安徽等省。荔枝草粗提物对CCl4和D-GlaN诱发大鼠急性肝损伤有保护作用，Oshima等发现荔枝草中的高车前素、高车前苷和泽兰黄酮对CCl4和D-GlaN诱发大鼠肝细胞毒性有保护作用(1mg/kg，p＜0.001，Ferrandiz等的研究表明高车前素对溴苯诱导的老鼠肝损伤和肝脂质过氧化有保护作用，在高剂量时对溴苯诱导的还原型谷胱甘肽缺失也有抵抗作用，并推断其保肝功能可能与抗氧化作用相关。曳野宏从荔枝草中分离了四种黄酮类化合物，其中泽兰黄酮、高车前素、高车前苷对肝中毒有显著活性，泽兰黄素没有活性。高车前苷对半乳糖胺肝细胞中毒的抑制作用也比对四氯化碳肝细胞中毒的抑制作用强。该方法用传统柱层析分离，成本高，重复性差，不适合规模生产。
高车前素，泽兰黄酮的结构式如下：
1 R1＝H，R2＝H； 3 R1＝OH，R2＝H；
2 R1＝H，R2＝Glu；4 R1＝OH，R2＝Glu；
5 R1＝H，R2＝Glc
1高车前素 3泽兰黄酮
高速逆流色谱技术(High-SpeedCountercurrent Chromatography，HSCCC)是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，其原理是利用螺旋柱在行星式的运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱。传统的液相色谱技术进行制备量分离时，分配效率低，溶剂消耗量大，而且固态支持体或载体会带来样品被吸附、损耗和变性等问题；而HSCCC能保证较高峰型分辨率，具有操作简便，分离量大，样品无损耗，分离效率高，理论回收率为100％，重现性好和分离环境缓和等优点，现已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题提供一种高纯度高车前素和泽兰黄酮的制备方法。该方法明克服传统分离技术的缺陷，采用高速逆流色谱法(HSCCC)制备天然异黄酮的方法，该方法操作简便，回收率高，分离量大。
本发明的一种高纯度高车前素和泽兰黄酮的制备方法包括如下步骤：
(1)将A组分、B组分、C组分和D组分按体积比0.5-5∶0.5-5∶1-5∶2-10混合后置于分液漏斗中，摇匀静置分层，待平衡20-40分钟后，将上相和下相分开，即得该溶剂体系；其中A组分为二氯甲烷、三氯甲烷或四氯甲烷；B组分为三氯甲烷、四氯甲烷或正丁醇；C组分为乙醇或甲醇；D组分为水；
(2)选择上相为固定相，下相为流动相，先用固定相充满逆流色谱仪柱子，调节主机转速为600-1000rpm，将流动相以0.5-5.0ml/min的流速泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；
(3)根据检测器紫外图谱接收目标成分，将流分进行浓缩、结晶，得到高车前素和泽兰黄酮。
上述溶剂体系优选为三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水体系。
所述步骤(2)中所进的样品的制备方法为：将荔枝草提取物溶于上相和下相中。
所述步骤(1)中的溶剂体系为二氯甲烷-三氯甲烷-甲醇-水，该四组分的体积比依次为：0.5∶4∶3∶2；所述步骤(2)中的主机转速750rpm，流动相泵入柱内的流速为4.0ml/min。
所述步骤(1)中的溶剂体系为三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，该四组分的体积比依次为：1∶1∶1∶7；所述步骤(2)中的主机转速850rpm，流动相泵入柱内的流速为5.0ml/min。
所述步骤(1)中的溶剂体系为三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，该四组分的体积比依次为：4∶0.8∶4∶9；所述步骤(2)中的主机转600rpm，流动相泵入柱内的流速为1.0ml/min。
所述步骤(1)中的溶剂体系为三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，该四组分的体积比依次为：5∶5∶4.5∶10；所述步骤(2)中的主机转速700rpm，流动相泵入柱内的流速为2.0ml/mm。
所述步骤(1)中的溶剂体系为三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，该四组分的体积比依次为：2∶3∶1∶7；所述步骤(2)中的主机转速800rpm，流动相泵入柱内的流速为3.0ml/min。
所述步骤(1)中的溶剂体系为三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，该四组分的体积比依次为：0.8∶4∶5∶8；所述步骤(2)中的主机转速1000rpm，流动相泵入柱内的流速为4.0ml/min。
所述步骤(1)中的溶剂体系为三氯甲烷-四氯甲烷-乙醇-水，该四组分的体积比依次为：0.5∶4∶2∶6；所述步骤(2)中的主机转速950rpm，流动相泵入柱内的流速为0.5ml/min。
所述步骤(1)中的溶剂体系为四氯甲烷-正丁醇-乙醇-水，该四组分的体积比依次为：3∶0.5∶1∶8；所述步骤(2)中的主机转速650rpm，流动相泵入柱内的流速为3.0ml/min。
采用高速逆流色谱制备方法，它包括选择构成固定相，流动相的溶解体系；先用固定相充满逆流色谱仪柱子，调节主机转速，将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；根据检测器紫外图谱接收目标成分。首先选择一个溶剂体系的两相组合，溶剂体系由四个组分构成。
上述体系上相为固定相，下相为流动相。且经一次分离得到高车前素和泽兰黄酮纯品，纯度在98％以上。
实验条件适合温度20-40℃，在上述温度范围内，温度较高时，出峰时间略有提前，分离效果变化不大，对峰形无多大影响。
主机转速和流速需控制在一定范围内，按体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相和下相分开，采用TBE-300B高速逆流色谱仪，该机型柱体积为300ml，进样圈为20ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为600-1000rpm，以0.5-5.0ml/min的流速将流动相泵入柱内。
分离和收集到的目标成分，浓缩到一定纯度后再进行结晶得到单体。高纯度是指纯度≥98％。
本发明采用了高速逆流色谱分离技术克服了固态支持物或载体不可逆吸附、损耗和变性，使被分离物回收率高理论达100％，本发明实际达到95％以上，又因为采用优选的溶剂体系，控制实验条件温度、调整主机转速和流速的工艺条件，可以高效率的分离，获得高纯度的高车前素和泽兰黄酮(达到98％以上)。
有益效果
1、本发明采用了高速逆流色谱分离技术，保证较高峰形分辨度，分离量大、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂、操作简便。
2、本发明适合从各种工艺途径制备的荔枝草提取物中获得高纯度的高车前素和泽兰黄酮(达到98％以上)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
选取三氯甲烷-四氯甲烷-乙醇-水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化荔枝草黄酮类成分。实验条件适合温度为25℃，先按0.5∶4∶2∶6体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取100mg荔枝草粗样溶解于10ml上相和10ml下相组成的溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为950rpm，以0.5ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到高车前素和泽兰黄酮流分，浓缩冻干后进行结晶，其HPLC纯度达到98.8％。
实施例2
选取四氯甲烷-正丁醇-乙醇-水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化荔枝草黄酮类成分。实验条件适合温度为30℃，先按3∶0.5∶1∶8体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取150mg荔枝草粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为650rpm，以3.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到高车前素和泽兰黄酮流分，浓缩后进行结晶，其HPLC纯度达到98.5％。
实施例3
选取二氯甲烷-三氯甲烷-甲醇-水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化荔枝草黄酮类成分。实验条件适合温度为22℃，先按0.5∶4∶3∶2体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取150mg荔枝草粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为750rpm，以4.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到高车前素和泽兰黄酮流分，浓缩后进行结晶，其HPLC纯度达到99.1％。
实施例4
选取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化荔枝草黄酮类成分。实验条件适合温度为40℃，先按1∶1∶1∶7体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取100mg荔枝草粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为850rpm，以5.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到高车前素和泽兰黄酮流分，浓缩后进行结晶，其HPLC纯度达到99.5％。
实施例5
选取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化荔枝草黄酮类成分。实验条件适合温度为20℃，先按4∶0.8∶4∶9体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取100mg荔枝草粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为600rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到高车前素和泽兰黄酮流分，浓缩后进行结晶，其HPLC纯度达到98.9％。
实施例6
选取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化荔枝草黄酮类成分。实验条件适合温度为25℃，先按5∶5∶4.5∶10体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取100mg荔枝草粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为700rpm，以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到高车前素和泽兰黄酮流分，浓缩后进行结晶，其HPLC纯度达到98％以上。
实施例7
选取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化荔枝草黄酮类成分。实验条件适合温度为32℃，先按2∶3∶1∶7体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取100mg荔枝草粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以3.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到高车前素和泽兰黄酮流分，浓缩后进行结晶，其HPLC纯度达到98％以上。
实施例8
选取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化荔枝草黄酮类成分。实验条件适合温度为35℃，先按0.8∶4∶5∶8体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取100mg荔枝草粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为1000rpm，以4.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到高车前素和泽兰黄酮流分，浓缩后进行结晶，其HPLC纯度达到98％以上。
Claims (1)
1.一种高纯度高车前素和泽兰黄酮的制备方法，包括：
选取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化荔枝草黄酮类成分；实验条件适合温度为40℃，先按1∶1∶1∶7体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层；待平衡一段时间后，将上相和下相分开；采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站；称取100mg荔枝草粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用；进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为850rpm，以5.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到高车前素和泽兰黄酮流分，浓缩后进行结晶，其HPLC纯度达到99.5％。
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| 蒋毅,等,.荔枝草活性成分的研究.《医药工业》.1987,第18卷(第8期),第349-350页. * |
| 黄宝康,等,.高速逆流色谱技术在天然产物分离及中药质控中的应用.《中药材》.2001,第24卷(第10期),第775-761页. * |
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