CN104744260B - 一种采用高速逆流色谱从海刀豆中分离多酚单体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用高速逆流色谱分离海刀豆中多酚单体的方法，包括以下步骤：(1)将海刀豆用加速溶剂萃取法提取，得粗提物；(2)选取高速逆流色谱的溶剂系统；(3)将粗提物浓缩至膏状，用高速逆流色谱溶剂系统的下相溶解，得高速逆流色谱分离样液；(4)采用高速逆流色谱分离样液，收集各流分；(5)将各流分采用高效液相色谱分析，通过高效液相色谱的保留时间定性，收集与粗提物主要成分保留时间一致的流分即为多酚单体。该方法将加速溶剂萃取ASE与高速逆流色谱HSCCC联用实现海刀豆中多酚单体的分离纯化，其精密度和重现性相对传统的分离纯化方法得到了提升。且操作简单、耗时短、适用范围广、对环境污染小、易于工业推广。
Description
技术领域
本发明属于海刀豆提取技术领域，具体涉及一种采用高速逆流色谱从海刀豆中分离制备多酚单体的方法。
背景技术
海刀豆(Canavaliamaritime)属于豆科刀豆属，在我国沿海滩涂有广泛分布，其主要成分为黄酮类、多酚类、黄烷类、甾醇类化合物，具有抗肿瘤、细胞毒性、溶血脂等作用。2,3,4-三羟基-6-甲氧基-6-氧代-5-[(3,4,5-三羟基苯甲酰基)氧基]己酸是分布于海刀豆中的主要活性物质，是一种多酚单体，其分子式为C24H18N2O4，ChemSpiderID：8771037(http://www.chemspider.com/Molecular-Formula/C14H16O12)，结构式如下：
多酚的提取方法多采用微波辅助萃取法、超声提取法、索氏提取法等。然而，传统提取方法具有提取效率低、操作复杂、溶剂用量大、耗时长及污染严重等缺点。加速溶剂萃取(ASE)是在较高的温度(50～200℃)和较高的压力(10.3～20.6MPa)下采用有机溶剂实现对固体样品和半固体样品的提取。ASE突出的优点是有机溶剂用量少，快速(一般为15min)，自动化程度和萃取率高。与传统的提取方法相比，ASE可显著提高萃取率，减少分析时间并且降低环境污染，减少甚至消除由手工操作中个体差异所产生的误差，提高分析测试的灵敏度、准确度、重现性，这些优势已经使得ASE成为较好的样品前处理方法之一。
目前文献报道，海刀豆中活性成分提取方法为柱层析，如硅胶柱层析法。该方法不足之处是：分离周期长，回收率低，分离效果不理想。高速逆流色谱(HSCCC)是由Ito.Y.博士研制和开发的新型液液分配色谱技术，它是建立在一种特殊的流体动力学平衡的基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生一种不对称离心力，使互不相溶的两相溶剂不断混合，同时保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂反复进行着混合和静置的分配过程。流动相载着溶质(样品)不断穿过固定相，使样品在两相之间不断反复地进行分配，其分配频率高达每秒13次以上，由于样品中各组分在两相溶剂中的溶解度、分配能力不同，导致在螺旋管中的迁移速度也不同，因而使样品中的组分得到高效快速的分离。HSCCC不需要固体支撑体，因而避免了固体固定相不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等问题，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段，具有适用范围广、制备量大、操作简单、高效快速等优点，广泛应用于天然产物分离纯化、生物医药、环境分析、材料、化工、海洋生物和食品等领域，并已制备出包括黄酮类、蒽醌类、皂苷类、大环内酯类、儿茶素类、多酚类、糖蛋白类、多糖类在内的数百种单体成分。
目前未发现有采用加速溶剂萃取法和高速逆流色谱联用用于海刀豆中多酚单体分离的研究和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用高速逆流色谱从海刀豆中分离多酚单体的方法，该方法通过将加速溶剂萃取与高速逆流色谱联用，可以获得高提取率和高纯度的海刀豆多酚单体2,3,4-三羟基-6-甲氧基-6-氧代-5-[(3,4,5-三羟基苯甲酰基)氧基]己酸。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种采用高速逆流色谱分离海刀豆中多酚单体的方法，包括以下步骤：
(1)选取海刀豆，采用加速溶剂提取法提取后，获得海刀豆粗提物；
(2)选取高速逆流色谱的溶剂系统；
(3)将步骤(1)获得的海刀豆粗提物浓缩至膏状，用高速逆流色谱溶剂系统的下相溶解，得到高速逆流色谱分离样液；
(4)采用高速逆流色谱分离步骤(3)的高速逆流色谱分离样液，并收集各流分；
(5)将步骤(1)获得的海刀豆粗提物用高效液相色谱分析，确定最大色谱峰的保留时间；
(6)将步骤(4)收集的各流分采用高效液相色谱分析，收集与步骤(5)中最大色谱峰的保留时间一致的流分，即为多酚单体。
在上述采用高速逆流色谱从海刀豆中分离多酚单体的方法中：
步骤(1)中海刀豆采用加速溶剂提取法提取前，先经干燥处理，干燥处理可以采用本领域常规的干燥方式，如烘干，晾干，晒干等；然后再将海刀豆粉碎，采用加速溶剂萃取法提取。
步骤(1)中采用加速溶剂萃取法提取时，萃取溶剂为体积百分含量为50～90％的甲醇，萃取温度为50～130℃，萃取压力为10.3～20.6MPa，循环次数为1～5次，每次萃取时间为5～25min，萃取池容积为10～66mL，具体可以为10mL、34mL或66mL等。
当加速溶剂提取的各项参数为以下参数时，多酚单体萃取率最高，采用加速溶剂提取法提取时，萃取溶剂为体积百分含量为70％的甲醇，萃取温度为130℃，萃取压力为10.3MPa，循环次数2次，每次萃取时间为15min，萃取池容积为10mL。
步骤(2)中高速逆流色谱的溶剂系统优选为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，其中正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比优选为2:5:2:5，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比是经过大量的筛选试验，最终优化获得的参数。
步骤(4)中采用高速逆流色谱分离时，分离条件优选为：流速为1.0～3.0mL/min，转速为700～900rpm/min(反转)，检测波长为283nm。
步骤(4)中采用高速逆流色谱分离时，以溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相。
采用高速逆流色谱分离时，固定相的保留率大约为76.2％。该固定相的保留率是根据体积比为2:5:2:5的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系来确定的。
步骤(5)～(6)中高效液相色谱分析的条件为：AthenaC18-WP，4.6mm×250mm，5μm；流动相为甲醇-0.2％冰醋酸，二者的体积比为20：80；检测器88232UV紫外检测仪，检测波长283nm；流速1mL/min；柱温30℃；进样量20μL。
采用上述高效液相色谱及参数时，海刀豆粗提物中最大色谱峰的保留时间在16.4分钟附近。多酚单体的保留时间也在16.4min附近。
步骤(6)中多酚单体的纯度大于95％。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明提供的采用高速逆流色谱分离海刀豆中多酚单体的方法，包括以下步骤：
制备步骤(1)：将干燥的海刀豆粉碎；
制备步骤(2)：精确称取一定量海刀豆，采用加速溶剂萃取法提取海刀豆中多酚单体，得粗提物，提取条件如下：萃取溶剂为体积百分含量为50～90％的甲醇，萃取温度为50～130℃，萃取压力为10.3MPa～20.6Mpa，循环次数为1～5次，每次萃取时间为5～25min，萃取池为10mL、34mL或66mL；
制备步骤(3)：选取高速逆流色谱的溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:5:2:5，v:v:v:v)；
制备步骤(4)：将步骤(2)得到的粗提物浓缩至膏状，用HSCCC溶剂系统的下相溶解，得溶解液，以待逆流分离；
制备步骤(5)：高速逆流色谱溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相；
制备步骤(6)：将步骤(4)所得的溶解液经过高速逆流色谱分离，分离条件为：流速1.0～3.0mL/min，转速(反转)750～850rpm/min，检测波长283nm，按照出峰情况收集各流分；
制备步骤(7)：将步骤(6)所得的分离流分和步骤(2)所得粗提物进样高效液相色谱，HPLC条件为：AthenaC18-WP，4.6mm×250mm，5μm；流动相为甲醇-0.2％冰醋酸，二者的体积比为20：80；检测器88232UV紫外检测仪，检测波长283nm；流速1mL/min；柱温30℃；进样量20μL。
制备步骤(8)：根据步骤(1)粗提物HPLC谱图中最大色谱峰的保留时间，收集与其保留时间一致的流分，即为多酚单体纯品，该多酚单体纯度大于95％。
本发明具有如下优点：
(1)本发明首先在国内建立了海刀豆中多酚单体的分离纯化工艺，得到纯度大于95％的2,3,4-三羟基-6-甲氧基-6-氧代-5-[(3,4,5-三羟基苯甲酰基)氧基]己酸；
(2)本发明采用加速溶剂萃取法提取海刀豆中多酚单体，相对于传统的提取方法，具有提取效率高、操作简便、溶剂用量少、提取时间短等优点，不仅能降低环境污染且自动化程度高，还能减少甚至消除由手工操作中个体差异所产生的误差，能提高分析测试的灵敏度、准确度、重现性；
(3)本发明中采用的提取溶剂选用甲醇，成本低，安全性好，污染低，易于回收；
(4)本发明采用高速逆流色谱分离，克服了传统固相载体带来的样品吸附、损失与污染的不良影响；HSCCC因其独特的分离原理，在分离不同种类物质时只需更换溶剂系统，而不是色谱柱，避免了柱效下降等问题，降低了耗材价格，易于工业推广；
(5)本发明首次设计了采用加速溶剂萃取结合高速逆流色谱法分离纯化海刀豆中多酚单体，为其他多酚单体的研究奠定了基础；
(6)采用本发明的分离方法，可从海刀豆中分离出纯度较高的多酚单体，该方法操作简单，适用范围广，制备量大，对环境污染小，易于工业推广，也可为其他植物中活性物质的分离纯化提供参考依据，具有很好的应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例1中加速溶剂萃取粗提物的色谱图；
图2是本发明实施例1中高速逆流色谱分离色谱图；
图3是本发明实施例1中高速逆流色谱分离所得流分I的色谱图；
图4是多酚单体飞行时间质谱图。
具体实施方式
实施例1
(1)精确称取5.0g干燥海刀豆，粉碎后，采用加速溶剂萃取法提取海刀豆中多酚单体，得粗提物；
表1单因素试验因素与水平设计
最终确定提取条件优化如下：提取溶剂70％(体积百分含量)甲醇，萃取温度130℃，循环次数2次，每次萃取时间15min，萃取池体积10mL，由于萃取压力对萃取率影响较小，因此本试验采用的萃取压力为10.3MPa。
(2)选取高速逆流色谱的溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:5:2:5，v:v:v:v)。
高速逆流色谱的溶剂系统是通过以下方式获得的：
分配系数K在0.5到2之间时则可使样品实现较好的分离。分配系数K的测定方法：配备一定比例的溶剂系统(见下表2)，分层，得到上相、下相备用。精确称量2.0g海刀豆粉末，用上述优化的ASE条件进行萃取，得到海刀豆粗提物。抽滤，浓缩至膏状。先用5mL下相溶解，然后加入5mL上相，充分震荡，待静置分层后，将上相有机相浓缩后用色谱纯甲醇定容到原体积，过膜，用HPLC法测定上相中目标峰面积AU；下相过膜后直接进样，测定目标峰面积为AL，则分配系数K＝AU/AL。
按照K值测定方法，得出多酚单体的最佳HSCCC溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:5:2:5,v:v:v:v)，结果如表2所示。由表可知，当溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:1:1,v:v:v:v)时，K值可达0.064，当溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:5:3:5,v:v:v:v)时，K值有所降低，为0.46，而0.5<K<2.0时，才能使多酚单体实现很好的分离，因此选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:5:2:5,v:v:v:v)作为分离多酚单体的最佳HSCCC溶剂体系。
表2不同溶剂体系的K值
以溶剂系统上相为固定相，下相为流动相。其中固定相的保留率约为76.2％，固定性保留率＝(V总-V下相)/V总。
(3)将粗提物浓缩至浸膏状，用HSCCC溶剂系统流动相溶解，得到高速逆流色谱分离样液；
(4)采用高速逆流色谱分离步骤(3)的高速逆流色谱分离样液，并收集各流分，分离条件为：流速2.0mL/min，转速850rpm/min，检测波长283nm。
(5)将步骤(1)获得的海刀豆粗提物用高效液相色谱分析，确定最大色谱峰的保留时间，HPLC条件为：AthenaC18-WP，4.6mm×250mm，5μm；流动相甲醇-0.2％冰醋酸，二者的体积比为20：80；检测器88232UV紫外检测仪；检测波长283nm；流速1mL/min；柱温30℃；进样量20μL。
将ASE萃取获得的海刀豆粗提物用高效液相色谱分析，其在16.4min附近有一个较大的色谱峰I(如图1中所示)；
(6)将步骤(4)收集的各流分采用高效液相色谱分析，收集与步骤(5)确定的最大色谱峰的保留时间一致的流分，即为多酚单体。
将逆流收集的各流分(如图2中所示)，逐一进行HPLC分析，发现流分I在液相色谱保留时间为16.4附近(如图3所示)，采用飞行时间质谱结果显示，其质谱图如图4中所示，馏分I的化学式为2,3,4-三羟基-6-甲氧基-6-氧代-5-[(3,4,5-三羟基苯甲酰基)氧基]己酸，结构式为C14H16O12，飞行时间质谱拟合的结构式如下：
该结构式与背景技术中ChemSpiderID：8771037的结构式和分子式相一致。
经检测分离出的多酚产品的纯度为98.8％，纯度根据面积归一法计算。测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率。
实施例2
(1)精确称取5.00g海刀豆，采用加速溶剂萃取法提取海刀豆中多酚单体，提取条件如下：提取溶剂为体积百分含量为90％的甲醇，萃取温度为90℃，循环次数为2次，萃取压力为20.6MPa，每次萃取时间25min，萃取池体积为66mL；
(2)选取高速逆流色谱的溶剂系统：其中正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为2:5:2:5，并以溶剂系统上相为固定相，下相为流动相，其中固定相的保留率约为76.2％；
(3)将粗提物浓缩至浸膏状，用HSCCC溶剂系统流动相溶解，得到高速逆流色谱分离样液；
(4)采用高速逆流色谱分离步骤(3)的高速逆流色谱分离样液，并收集各流分：分离条件为：流速3.0mL/min，转速900rpm/min，检测波长283nm；
(5)将步骤(1)获得的海刀豆粗提物用高效液相色谱分析，确定最大色谱峰的保留时间大约在16.4min附近；
高效液相色谱分析的条件为：AthenaC18-WP，4.6mm×250mm，5μm；流动相甲醇-0.2％冰醋酸(20：80，v:v)；检测器88232UV紫外检测仪；检测波长283nm；流速1mL/min；柱温30℃；进样量20μL；
(6)将步骤(4)收集的各流分采用高效液相色谱分析，高效液相色谱分析条件同步骤(5)，收集与步骤(5)确定的最大色谱峰的保留时间一致的流分，即为多酚单体，分离出的多酚单体的纯度为95.3％。
实施例3
制备步骤(1)：将干燥的海刀豆粉碎；
制备步骤(2)：精确称取海刀豆，采用加速溶剂萃取法提取海刀豆中多酚单体，得粗提物，提取条件如下：萃取溶剂为体积百分含量为50％的甲醇，萃取温度为50℃，循环次数为5次，萃取压力为10.3MPa，每次萃取时间为5min，萃取池为10mL；
制备步骤(3)：选取高速逆流色谱的溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:5:2:5，v:v:v:v)；
制备步骤(4)：将步骤(2)得到的粗提物浓缩至膏状，用HSCCC溶剂系统的下相溶解，得溶解液，以待逆流分离；
制备步骤(5)：高速逆流色谱溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相；
制备步骤(6)：将步骤(4)所得的溶解液经过高速逆流色谱分离，分离条件为：流速1.0mL/min，转速(反转)750rpm/min，检测波长283nm，按照出峰情况收集各流分；
制备步骤(7)：将步骤(2)所得粗提物进样高效液相色谱，确定最大色谱峰的保留时间大约在16.4min附近；
高效液相色谱分析的条件为：AthenaC18-WP，4.6mm×250mm，5μm；流动相甲醇-0.2％冰醋酸(20：80，v:v)；检测器88232UV紫外检测仪；检测波长283nm；流速1mL/min；柱温30℃；进样量20μL；
(8)将步骤(6)收集的各流分采用高效液相色谱分析，高效液相色谱分析条件同步骤(6)，收集与步骤(6)确定的最大色谱峰的保留时间一致的流分，即为多酚单体，分离出的多酚单体的纯度大于95％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种采用高速逆流色谱分离海刀豆中多酚单体的方法，其特征包括以下步骤：
(1)选取海刀豆，采用加速溶剂萃取法提取后，获得海刀豆粗提物；
(2)选取高速逆流色谱的溶剂体系；
(3)将步骤(1)获得的海刀豆粗提物浓缩至膏状，用高速逆流色谱溶剂体系的下相溶解，得到高速逆流色谱分离样液；
(4)采用高速逆流色谱分离步骤(3)的样液，并收集各流分；
(5)将步骤(1)获得的海刀豆粗提物用高效液相色谱分析，确定最大色谱峰的保留时间；
(6)将步骤(4)收集的各流分采用高效液相色谱分析，收集与步骤(5)中最大色谱峰的保留时间一致的流分，即为多酚单体；所述多酚单体为2,3,4-三羟基-6-甲氧基-6-氧代-5-[(3,4,5-三羟基苯甲酰基)氧基]己酸；
步骤(1)中采用加速溶剂萃取法提取时，萃取溶剂为体积百分含量为50～90％的甲醇，萃取温度为50～130℃，萃取压力为10.3MPa～20.6MPa，循环次数为1～5次，每次萃取时间为5～25min，萃取池容积为10～66mL；
步骤(2)中高速逆流色谱的溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，其中正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为2:5:2:5；
步骤(4)中采用高速逆流色谱分离时，分离条件为：流速为1.0～3.0mL/min，转速为700～900rpm/min，检测波长为283nm。
2.根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱分离海刀豆中多酚单体的方法，其特征是：步骤(4)中采用高速逆流色谱分离时，以溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相。
3.根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱分离海刀豆中多酚单体的方法，其特征是：步骤(5)～(6)中高效液相色谱分析的条件为：AthenaC18-WP，4.6mm×250mm，5μm；流动相为甲醇-0.2％冰醋酸，二者的体积比为20：80；检测器88232UV紫外检测仪，检测波长283nm；流速1mL/min；柱温30℃；进样量20μL。
4.根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱分离海刀豆中多酚单体的方法，其特征是：步骤(6)中多酚单体的纯度大于95％。
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