CN102127124B - 一种羟基红花黄色素a的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羟基红花黄色素A的制备方法，该方法利用高速逆流色谱从红花中快速大量制备高纯度羟基红花黄色素A，为红花制剂及羟基红花黄色素A的药理药效学研究提供了物质基础。通过该方法获得的产品羟基红花黄色素A纯度可以达到标准品的要求，该方法工艺简单，快速，量大，成本低，无环境污染，既适用批量的制备，也适用于小剂量的制备。
Description
技术领域
本发明涉及从红花中快速制备高纯度羟基红花黄色素A的方法。
背景技术
高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是新型的液-液分配色谱技术，它利用多层螺旋管同步行星式离心运动，在短时间内实现样品在互不相溶的两相溶剂系统中的高效分配，从而实现样品分离。HSCCC具有两大优点：首先，HSCCC聚四氟乙烯管中的固定相不需要载体，因而消除了液相色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，尤其适用于分离极性物质和具有生物活性的物质。其次，由于HSCCC与一般色谱的分离方式不同，每次的进样量比较大，可以达到毫克量级，甚至克量级，使其特别适用于制备性分离，而且仪器价格低、性能可靠、分析成本低、易于操作；近年来，HSCCC技术被广泛应用于中药和天然产物的研究。非常适用于化学标准品的制备。
红花为菊科红花属一年生草本植物红花(Carthamus tinctoriusL.)的干燥花。俗名草红花、红蓝花和红花草，在我国已有2100多年的栽培和药用历史。全国各地都有栽培，主产于新疆、河南、浙江和四川等省，其中新疆地产红花占全国总产量的80％，而新疆塔城红花又是新疆地区优质品种。红花作为我国的传统草药，具有活血通经、散瘀止痛、降血压和降血脂的功效，用于治疗痛经、跌打损伤、冠心病、心绞痛和高血压等疾。该植物的化学成分包括黄酮类、木脂素类、有机酸类和烷基二醇类及多炔类化合物等250余种。
羟基红花黄色素A(HYSA)是其主要的水溶性成分，属于查耳酮类化合物，在植物中含量较高、为红花中的具有药理效应代表性的主要成分。大量研究表明红花黄色素A具有活血通经、化瘀止痛之功效，对冠心病、高血压、脑梗塞、糖尿病并发症等有疗效，并具有抑制免疫、抗炎、抗肿瘤等广泛作用。
鉴于羟基红花黄色素A制剂及含羟基红花黄色素A制剂的大量应用，目前关于羟基红花黄色素A的研究报道中，尚未发现快速制备高纯度的羟基红花黄色素A方法。本发明采用近年来发展迅速的高速逆流色谱技术，大量快速制备的羟基红花黄色素A的方法，并采用该方法获得了高纯度的羟基红花黄色素A的单体化合物，其化学结构是为：
发明内容
本发明的目的在于，提供一种羟基红花黄色素A的制备方法，该方法利用高速逆流色谱从红花中快速大量制备高纯度羟基红花黄色素A，为红花制剂及羟基红花黄色素A的药理药效学研究提供了物质基础。通过该方法获得的产品羟基红花黄色素A纯度可以达到标准品的要求，该方法工艺简单，快速，量大，成本低，无环境污染，既适用批量的制备，也适用于小剂量的制备。
本发明所述的一种羟基红花黄色素A的制备方法，按下列步骤进行：
a、提取：取红花的干燥花，加入10-20倍重量的去离子水，温度80℃水浴浸泡10-60分钟，用水回流提取2次，合并提取液，减压浓缩至提取液体积的50％，得到提取液；
b、分离：将提取液加入3-10％吸附澄清剂壳聚糖或101果汁澄清剂或ZTCⅡ天然澄清剂除杂后，上大孔吸附树脂，待流出液Molish反应呈阴性时，用浓度为5-50％乙醇进行洗脱，得到红花粗提物；
或将提取液直接上大孔吸附树脂，待流出液Molish反应呈阴性时，用浓度为5-50％乙醇进行洗脱，得到红花粗提物；
c、高速逆流色谱法分离：采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由两相或三相组分形成的溶剂，分别是正丁醇或正戊醇与盐酸组成两相，或正丁醇或正戊醇和甲醇、乙酸乙酯或乙醇和盐酸组成三相，其中各组分体积比为1-3∶0-2∶0.5-2；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上层相溶液作为固定相，下层相溶液作为流动相，将粗提物溶于上层相和下层相的混合溶液中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱，再由进样阀进入粗提物溶于上层和下层的混合溶液，保留时间为100-200分钟，使用的高速逆流色谱仪流速范围为1-3ml/min，转速范围为700-1000转数，根据检测器谱图或高效液相色谱的检测结果接收目标成分羟基红花黄色素A；
e、纯化除酸：将高速逆流得到的样品羟基红花黄色素A进行柱层析，柱子的径高比为1∶50-100，超纯水以0-3ml/min的流速洗脱，收集橙黄色色带流份，于温度30-80℃条件下浓缩干燥，即可得到羟基红花黄色素A干粉。
步骤b大孔吸附树脂为D-4020或AB-8或D-141或D-201或HPD500型号。
步骤c中盐酸为0.05-0.2mol/L。
步骤e柱层析中的填料，选用葡聚糖凝胶LH-20、LH-60或G-25。
本发明中所用药材红花均购自新疆塔城，品种为塔原一号。
附图说明
图1为本发明通过高速逆流色谱分离羟基红花黄色素A的逆流色谱图。
图2为本发明通过高速逆流色谱批量分离羟基红花黄色素A的逆流色谱图。
图3为羟基红花黄色素A的质谱图。
图4为羟基红花黄色素A的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1
a、提取：取红花的干燥花20g，加入200g的去离子水，温度80℃水浴浸泡60分钟，用水回流提取2次，合并提取液，减压浓缩至提取液体积的50％，得到提取液；
b、分离：将提取液直接上大孔吸附树脂D-4020，待流出液Molish反应呈阴性时，用浓度5％乙醇洗脱，至羟基红花黄色素A成分结束为止，得到红花粗提物；
c、高速逆流色谱法分离：采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正丁醇、甲醇和0.15mol/L的盐酸组成，各组分体积比为2∶1∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上层相溶液作为固定相，下层相溶液作为流动相，将粗提物溶于上层和下层的混合溶液中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱，再由进样阀进入粗提物溶于上层和下层的混合溶液，保留时间为200分钟，使用的高速逆流色谱仪流速范围为1ml/min，转速范围为750转数，根据检测器谱图或高效液相色谱的检测结果接收目标成分羟基红花黄色素A；
e、纯化除酸：将高速逆流得到的样品羟基红花黄色素A上葡聚糖凝胶LH-60，柱子的径高比为1∶70，超纯水以2.5ml/min的流速洗脱，收集橙黄色色带流份，于温度80℃条件下浓缩干燥，即可得到羟基红花黄色素A干粉201mg，经检测纯度为97％。
实施例2
a、提取：取红花的干燥花20g，加入400g的去离子水，温度80℃水浴浸泡10分钟，用水回流提取2次，合并提取液，减压浓缩至提取液体积的50％，得到提取液；
b、分离：将提取液加入3％壳聚糖，上大孔吸附树脂AB-8，待流出液Molish反应呈阴性时，用浓度20％乙醇洗脱，至羟基红花黄色素A成分结束为止，得到红花粗提物；
c、高速逆流色谱法分离：采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正戊醇、乙醇和0.05mol/L的盐酸组成，各组分体积比为3∶2∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上层相溶液作为固定相，下层相溶液作为流动相，将粗提物溶于上层相和下层相的混合溶液中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱，再由进样阀进入粗提物溶于上层相和下层相的混合溶液，保留时间为150分钟，使用的高速逆流色谱仪流速范围为1.5ml/min，转速范围为800转数，根据检测器谱图或高效液相色谱的检测结果接收目标成分羟基红花黄色素A；
e、纯化除酸：将高速逆流得到的样品羟基红花黄色素A上葡聚糖凝胶LH-20，柱子的径高比为1∶50，超纯水以2ml/min的流速洗脱，收集橙黄色色带流份，于温度50℃条件下浓缩干燥，即可得到羟基红花黄色素A干粉185mg，经检测纯度在97.7％。
实施例3
a、提取：取红花的干燥花20g，加入300g的去离子水，温度80℃水浴浸泡20分钟，用水回流提取2次，合并提取液，减压浓缩至提取液体积的50％，得到提取液；
b、分离：将提取液加入10％101果汁澄清剂，上大孔吸附树脂D-141，待流出液Molish反应呈阴性时，用浓度30％乙醇洗脱，至羟基红花黄色素A成分结束为止，得到红花粗提物；
c、高速逆流色谱法分离：采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正戊醇和0.2mol/L的盐酸组成，各组分体积比为2∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上层相溶液作为固定相，下层相溶液作为流动相，将粗提物溶于上层相和下层相的混合溶液中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱，再由进样阀进入粗提物溶于上层相和下层相的混合溶液，保留时间为140分钟，使用的高速逆流色谱仪流速范围为1.7ml/min，转速范围为700转数，根据检测器谱图或高效液相色谱的检测结果接收目标成分羟基红花黄色素A；
e、纯化除酸：将高速逆流得到的样品羟基红花黄色素A上葡聚糖凝胶LH-20，柱子的径高比为1∶60，超纯水以3ml/min的流速洗脱，收集橙黄色色带流份，于温度70℃条件下浓缩干燥，即可得到羟基红花黄色素A干粉199mg，经检测纯度在98.2％。
实施例4
a、提取：取红花的干燥花20g，加入260g的去离子水，温度80℃水浴浸泡50分钟，用水回流提取2次，合并提取液，减压浓缩至提取液体积的50％，得到提取液；
b、分离：将提取液加入8％ZTCⅡ天然澄清剂，上大孔吸附树脂D-201，待流出液Molish反应呈阴性时，用浓度10％乙醇洗脱，至羟基红花黄色素A成分结束为止，得到红花粗提物；
c、高速逆流色谱法分离：采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正丁醇和0.12mol/L的盐酸组成，各组分体积比为1∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上层相溶液作为固定相，下层相溶液作为流动相，将粗提物溶于上层相和下层相的混合溶液中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱，再由进样阀进入粗提物溶于上层相和下层相的混合溶液，保留时间为100分钟，使用的高速逆流色谱仪流速范围为1.2ml/min，转速范围为900转数，根据检测器谱图或高效液相色谱的检测结果接收目标成分羟基红花黄色素A；
纯化除酸：将高速逆流得到的样品羟基红花黄色素A上葡聚糖凝胶LH-20，柱子的径高比为1∶75，超纯水以1ml/min的流速洗脱，收集橙黄色色带流份，于温度60℃条件下浓缩干燥，即可得到羟基红花黄色素A干粉225mg，经检测纯度在99.1％。
实施例5
a、提取：取红花的干燥花20g，加入380g的去离子水，温度80℃水浴浸泡30分钟，用水回流提取2次，合并提取液，减压浓缩至提取液体积的50％，得到提取液；
b、分离：将提取液加入5％ZTCⅡ天然澄清剂，上大孔吸附树脂AB-8，待流出液Molish反应呈阴性时，用浓度50％乙醇洗脱，至羟基红花黄色素A成分结束为止，得到红花粗提物；
c、高速逆流色谱法分离：采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正丁醇、甲醇和0.08mol/L的盐酸组成，各组分体积比为1∶1∶0.5；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上层相溶液作为固定相，下层相溶液作为流动相，将粗提物溶于上层相和下层相的混合溶液中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱，再由进样阀进入粗提物溶于上层相和下层相的混合溶液，保留时间为100分钟，使用的高速逆流色谱仪流速范围为3.0ml/min，转速范围为1000转数，根据检测器谱图或高效液相色谱的检测结果接收目标成分羟基红花黄色素A；
e、纯化除酸：将高速逆流得到的样品羟基红花黄色素A上葡聚糖凝胶G-25，柱子的径高比为1∶100，超纯水以3ml/min的流速洗脱，收集橙黄色色带流份，于温度40℃条件下浓缩干燥，即可得到羟基红花黄色素A干粉185mg，经检测纯度在97.8％。
Claims (1)
1.一种羟基红花黄色素A的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、提取：取红花的干燥花，加入15-20倍重量的去离子水，温度80℃水浴浸泡30-60分钟，用水回流提取2次，合并提取液，减压浓缩至提取液体积的50％，得到提取液；
b、分离：将提取液加入质量比3-10％吸附澄清剂壳聚糖或101果汁澄清剂或ZTC II天然澄清剂除杂，上大孔吸附树脂，待流出液Molish反应呈阴性时，用浓度为20-50％乙醇进行洗脱，得到红花粗提物，其中大孔吸附树脂为D-4020或AB-8或D-141或D-201或HPD500型号；
或将提取液直接上大孔吸附树脂，待流出液Molish反应呈阴性时，用浓度为20-50％乙醇进行洗脱，得到红花粗提物，其中大孔吸附树脂为D-4020或AB-8或D-141或D-201或HPD500型号；
c、高速逆流色谱法分离：采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由两相或三相组分形成的溶剂，分别是正丁醇或正戊醇与盐酸组成两相，或正丁醇或正戊醇和甲醇或乙醇和盐酸组成三相，其中各组分体积比为1-3∶0-2∶0.5-2，盐酸为0.05-0.2mol/L；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上层相溶液作为固定相，下层相溶液作为流动相，将粗提物溶于上层相和下层相的混合溶液中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱，再由进样阀进入粗提物溶于上层和下层的混合溶液，保留时间为100-200分钟，使用的高速逆流色谱仪流速范围为1-3ml/min，转速范围为700-1000转数，根据检测器谱图或高效液相色谱的检测结果接收目标成分羟基红花黄色素A；
e、纯化除酸：将高速逆流得到的样品羟基红花黄色素A进行柱层析，柱子的径高比为1∶50-100，超纯水以0-3ml/min的流速洗脱，收集橙黄色色带流份，于温度30-80℃条件下浓缩干燥，即可得到羟基红花黄色素A干粉，其中柱层析中的填料选用葡聚糖凝胶LH-20或LH-60或G-25型号。
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