CN102020691A

CN102020691A - 七叶皂苷四种单体组分的高效液相色谱分离方法

Info

Publication number: CN102020691A
Application number: CN2010105060034A
Authority: CN
Inventors: 顾景凯; 吴秀君; 张梦亮; 张超; 崔相勇; 高峰
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2010-10-14
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2011-04-20

Abstract

本发明的七叶皂苷四种单体组分的高效液相色谱分离方法属于混合物的分离技术领域。以七叶皂苷提取物或原料药为原料，用甲醇和水混合溶剂溶解，采用反相高效液相色潽法，选择流动相的两相体系，可选用的两相体系有甲醇-水、乙腈-水，水相的pH控制在2-3之间；然后选择色谱柱，确定为C18柱；柱温：室温；检测波长：210nm；最后经旋转蒸发和干燥处理，得到固态的七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib、异七叶皂苷Ia和异七叶皂苷Ib。本发明在分离和后处理过程中都不会发生各单体之间的相互转化，得到的四种产品的纯度均大于99％；产物可以作为七叶皂苷标准品，并广泛用于药剂、药物分析和药理学等研究领域。

Description

七叶皂苷四种单体组分的高效液相色谱分离方法

技术领域

本发明属于混合物的分离技术领域，涉及一种七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib、异七叶皂苷Ia和异七叶皂苷Ib的高效液相色谱分离方法。

背景技术

七叶皂苷是从七叶树的干燥种子中提取得到的一组三萜皂苷类化合物的混合物，由于其具有抗炎、抗水肿及静脉保护作用，并且具有很好的耐受性，因而临床上广泛用于慢性静脉功能不全、痣和手术后水肿的治疗。七叶皂苷中含有很多种皂苷化合物，七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib和异七叶皂苷Ia、异七叶皂苷Ib是其中四种主要活性成分。它们互为同分异构体(见下图)，七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib的主要区别在于C₂₁位羟基上成酯的有机酸的不同，分别为巴豆油酸和当归酸，异七叶皂苷Ia、异七叶皂苷Ib分别是七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib的C₂₂位乙酰基转移到C₂₈位羟基上的异构体。这四种七叶皂苷单体组分分别属于两种类型，七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib为β-七叶皂苷，异七叶皂苷Ia、异七叶皂苷Ib为α-七叶皂苷，这两种类型七叶皂苷的熔点、比旋度、溶血指数和水溶解度均有明显不同。

其中的R₁、R₂、R₃分别是：

七叶皂苷	R₁	R₂	R₃
				七叶皂苷Ia	巴豆酰基	乙酰基	-H

七叶皂苷Ib	当归酰基	乙酰基	-H
				异七叶皂苷Ia	巴豆酰基	-H	乙酰基
异七叶皂苷Ib	当归酰基	-H	乙酰基

见载于文献的分离七叶皂苷中所含的成分(四种单体组分)的方法主要包括阳离子交换色谱方法(Josef et al.，欧洲专利，EP 3,110,711)和高效液相色谱方法(Feng Wei et al，Journal of Liquid Chromatography & Related Technologiesw，2005，28：763-773)。阳离子交换色谱方法只能分离两种类型七叶皂苷，即β-七叶皂苷钠和α-七叶皂苷，而不能分离出单体组分。高效液相色谱法是分离制备七叶皂苷单体组分的主要方法，但应对流动相的条件及温度条件等进行严格限制，因为七叶皂苷的化学结构很不稳定。据文献报道，在一定条件下，如β-七叶皂苷在100℃水中直接加热，或用0.1％NaOH调节至pH 6.0～6.9后在60～90℃加热，均可以转化成α-七叶皂苷(Sirtori CR，Pharmacological research，2001，44(3)：183-193)(Josef W et al.，欧洲专利，EP 1.571,263)。现有文献报道采用0.1％的乙酸水溶液作为水相、甲醇作为有机相梯度洗脱，其pH无法保证所得七叶皂苷单体的纯度。

发明内容

本发明目的在于提供一种从含七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib和异七叶皂苷Ia、异七叶皂苷Ib的七叶皂苷提取物或原料药中分离纯化七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib和异七叶皂苷Ia、异七叶皂苷Ib的高效液相色谱方法，严格限定了分离制备过程中流动相的成分及其pH值的范围，从而保证所得产物的纯度；该方法设备要求低、纯化费用低。

本发明所述的七叶皂苷单体组分就是七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib和异七叶皂苷Ia、异七叶皂苷Ib。本发明的主要特征在于首次对七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib和异七叶皂苷Ia、异七叶皂苷Ib的相互转化条件进行了研究，严格限定了分离过程中的流动相的pH，从而避免了单体组分间的转化和保证了所得产物的纯度。

本实验室的前期研究表明，在pH＞3或pH＜2的条件下，β-七叶皂苷与α-七叶皂苷可发生相互转化，因此pH是决定是否能够得到七叶皂苷单体组分的一个主要因素。

本发明的分离、检测方法采用反相高效液相色潽法，首先选择流动相的两相体系，可选用的两相体系有甲醇-水、乙腈-水，水相的pH控制在2～3之间；然后选择色谱柱，确定为C18柱；柱温：室温；检测波长：210nm。

具体的分离七叶皂苷单体组分的技术方案如下所述。

一种七叶皂苷四种单体组分的高效液相色谱分离方法，所述的四种单体组分是七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib、异七叶皂苷Ia和异七叶皂苷Ib；分离过程是将配制原料注入定量环，经色谱柱进行分离，由紫外检测器在线检测，按检测的物质峰分段收集四种单体组分的分馏液；最后将分馏液分别进行旋转蒸发和干燥处理，得到固态产物；其特征在于，

所述的配制原料，是以七叶皂苷提取物或原料药为原料，用甲醇和水混合溶剂溶解，其中混合溶剂按体积比甲醇∶水＝4∶3；

所述的流动相，是以甲醇和体积浓度为0.6％的乙酸水溶液相混合作流动相，其中按体积比甲醇∶乙酸水溶液＝59～61∶39～41；流动相的pH＝2.0～3.0；

所述的色谱柱，使用C18色谱柱，粒径5μm。

在上述的分离七叶皂苷单体组分的技术方案中，所述的配制原料，最好用0.45μm滤膜过滤制得配制原料；所述的色谱柱，可以选柱温为室温；所述的流动相，最佳选择按体积比甲醇∶0.6％的乙酸水溶液＝60∶40；所述的在线检测物质峰，可以选择检测波长为210nm。

在上述的分离七叶皂苷单体组分的技术方案中，所述的旋转蒸发，是将收集到的四种单体组分的分馏液分别在减压条件下旋转蒸发，旋转蒸发仪水浴温度为45℃，真空度0.08～0.09MPa，得到单体组分的浓缩液；所述的干燥处理，是将旋转蒸发得到的浓缩液氮气吹干或冷冻干燥。

本发明具体的检测七叶皂苷单体组分的技术方案如下所述。

在分段收集产物之后对四种单体组分进行检测，检测方法是高效液相色谱法；具体的液相条件是：色谱柱为C18柱，5μm粒径；流动相为乙腈和体积浓度0.04％的三氟乙酸水溶液，乙腈和三氟乙酸水溶液的体积比为33～37∶63～67，流动相pH＝2.0～3.0；检测波长为210nm；进样流速为1.0mL/min，进样量为20μL。

上述分离、检测方法中，七叶皂苷提取物或原料药要用甲醇-水混合溶剂溶解，而不能用甲醇或乙腈溶解。

采用上述反相高效液相色谱法分离条件分离纯化出七叶皂苷Ia、Ib和异七叶皂苷Ia、Ib四种有效成分，在分离过程中及后续处理过程中都不会发生各单体之间的相互转化，得到的四种产品的纯度均大于99％。

迄今为止，尚无七叶皂苷Ia、Ib和异七叶皂苷Ia、Ib四种单一组分的纯品出售，本发明利用反相高效液相色谱法制备七叶皂苷单体组分具有很好的产业前景，可以作为七叶皂苷标准品，并广泛用于药剂、药物分析和药理学等研究领域。

附图说明

图1是本发明七叶皂苷单体组分分离的高效液相色谱图。

图2是本发明七叶皂苷Ia纯度分析高效液相色谱图。

图3是本发明七叶皂苷Ib纯度分析高效液相色谱图。

图4是本发明异七叶皂苷Ia纯度分析高效液相色谱图。

图5是本发明异七叶皂苷Ib纯度分析高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明作进一步详述，但本发明并不仅限于此。

在以下实施例中用到的仪器和试剂有，高效液相色谱仪，配有DAD检测器；手动进样器；定量环；二元泵；旋转蒸发仪；循环水式多用真空泵；核磁共振仪；液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)，配有电喷雾离子化源。甲醇、乙腈为色谱纯，乙酸和三氟乙酸为分析纯，水为二次蒸馏水。

实施例1：原料的前处理

称取一定量的七叶皂苷提取物或原料药，用甲醇-水(4∶3，v/v)混合溶剂溶解，0.45μm滤膜过滤，4℃冰箱中保存备用。

七叶皂苷提取物可以是使用现有技术从七叶树的干燥种子中提取得到的一组三萜皂苷类化合物的混合物。原料药可以是山东绿叶制药股份有限公司的精氨酸七叶皂苷钠原料药，该原料药中这四种组分的百分含量大于90％，但是各组分的比例每批原料药不完全相同。

溶剂对样品分离度和稳定性有较大影响，在乙腈溶液中，七叶皂苷提取物或原料药不稳定；在甲醇溶液中，七叶皂苷提取物或原料药稳定，但是高效液相色谱分析时分离度大大降低；在水溶液中，七叶皂苷提取物或原料药不稳定，但甲醇的加入可以增加其稳定性，且不影响分离度。因此，选择甲醇-水(4∶3，v/v)混合溶液作为溶剂。

实施例2：流动相的确定

选择了几种不同组成的流动相来分离七叶皂苷提取物或原料药中所含多种七叶皂苷成分，包括甲醇-不同浓度乙酸水溶液系统，甲醇-乙腈-不同浓度乙酸水溶液系统以及乙腈-不同浓度三氟乙酸水溶液系统等，其中甲醇-0.6％乙酸水溶液和乙腈-0.04％三氟乙酸水溶液所组成的流动相均可使多种组分达到良好分离，但乙腈系统在蒸馏浓缩过程中样品发生明显的相互转化和降解。因此最终选择甲醇-0.6％乙酸水溶液作为制备样品时的流动相系统，而为节省检测分析时间，选择乙腈-0.04％三氟乙酸水溶液所组成的流动相为检测样品时的流动相。

考察了pH值对七叶皂苷各组分分离度及稳定性的影响，结果表明，在pH＜2或pH＞3时，在分馏组分浓缩过程中，会发生样品的转化(七叶皂苷Ia与异七叶皂苷Ia，七叶皂苷Ib与异七叶皂苷Ib的相互转化)，因此流动相的pH要介于2～3之间。

实施例3：反相高效液相色潽法分离七叶皂苷原料中的四种单体组分

对其中四种主要成分进行制备时，其液相条件具体为：半制备柱：HypersilC18柱，10×250mm I.D.，5μm粒径；流动相：甲醇-0.6％乙酸(pH＝2.0)(60∶40，v/v)；检测波长：210nm；流速：2.3mL/min，进样量：100μL；柱温：室温。

HPLC分离步骤：

取配制好的七叶皂苷提取物或原料药溶液，进样100μL，根据在线检测信号，分段收集不同的物质峰。将收集到的分馏液在减压条件下旋转蒸发，旋转蒸发仪水浴温度为45℃，真空度为0.09MPa。将蒸馏得到的浓缩液用氮气在室温条件下吹干，得到各分馏组分的固体。

典型的检测分析色谱图见图1。

实施例4：反相高效液相色潜法检测七叶皂苷的四种单体组分

对实施例1所得四种样品进行检测时，其液相条件具体为：色谱柱：HypersilC18柱，4.6×150mm I.D.，5μm粒径；流动相：乙腈-0.04％三氟乙酸水溶液(pH＝2.0)(35∶65，v/v)；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min，进样量：20μL；柱温：室温。

液相色谱图见图2～5，图2是七叶皂苷Ia液相色谱图，图3是七叶皂苷Ib液相色谱图，图4是异七叶皂苷Ia液相色谱图，图5是异七叶皂苷Ib液相色谱图。

实施例5：四种组分的鉴定和纯度测定

通过DAD、HPLC-MS、¹H NMR分析与文献数据对照，确定产物归属：

产物1：最大吸收波长210nm；ESI-MS(m/z)1131；¹H NMR(C₅D₅N)：6.99(3″″)、1.53(4″″)、1.70(4″″)；

产物2：最大吸收波长210nm；ESI-MS(m/z)1131；¹H NMR(C₅D₅N)：2.00(3″″)、5.84(4″″)、1.93(4″″)；

产物3：最大吸收波长210nm；ESI-MS(m/z)1131；¹H NMR(C₅D₅N)：6.90(3″″)、1.84(4″″)、1.69(4″″)；

产物4：最大吸收波长210nm；ESI-MS(m/z)1131；¹H NMR(C₅D₅N)：1.92(3″″)、5.78(4″″)、1.86(4″″)；

确定产物1、产物2、产物3、产物4分别为七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib和异七叶皂苷Ia、异七叶皂苷Ib。

四种组分的纯度测定：

在获得七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib和异七叶皂苷Ia、异七叶皂苷Ib的单体后，采用HPLC面积归一化法对四种产物的纯度进行了测定(见图2～5)，所得四种产物的纯度均大于99％。

Claims

1.一种七叶皂苷四种单体组分的高效液相色谱分离方法，所述的四种单体组分是七叶皂苷Ia、七叶皂苷Ib、异七叶皂苷Ia和异七叶皂苷Ib；分离过程是将配制原料注入定量环，经色谱柱进行分离，由紫外检测器在线检测，按检测的物质峰分段收集四种单体组分的分馏液；最后将分馏液分别进行旋转蒸发和干燥处理，得到固态产物；其特征在于，

所述的流动相，是以甲醇和体积浓度为0.6％的乙酸水溶液相混合作流动相，其中按体积比甲醇∶乙酸水溶液＝29～31∶19～21；流动相的pH＝2.0～3.0；

所述的色谱柱，使用C18色谱柱，粒径5μm。

2.按照权利要求1所述的七叶皂苷四种单体组分的高效液相色谱分离方法，其特征在于，所述的色谱柱，柱温为室温；所述的流动相，按体积比甲醇∶乙酸水溶液＝3∶2；所述的在线检测物质峰，检测波长为210nm。

3.按照权利要求1或2所述的七叶皂苷四种单体组分的高效液相色谱分离方法，其特征在于，所述的旋转蒸发，是将收集到的四种单体组分的分馏液分别在减压条件下旋转蒸发，旋转蒸发仪水浴温度为45℃，真空度为0.08～0.09MPa得到单体组分的浓缩液；所述的干燥处理，是将旋转蒸发得到的浓缩液氮气吹干或冷冻干燥。

4.按照权利要求1或2所述的七叶皂苷四种单体组分的高效液相色谱分离方法，其特征在于，所述的配制原料，用0.45μm滤膜过滤制得配制原料。

5.一种七叶皂苷四种单体组分的高效液相色谱检测方法，具体的液相条件是：色谱柱为C18柱，5μm粒径；流动相为乙腈和体积浓度0.04％的三氟乙酸水溶液，乙腈和三氟乙酸水溶液的体积比为33～37∶63～67，流动相pH＝2.0～3.0；检测波长为210nm；进样流速为1.0mL/min，进样量为20μL。