CN110746302B

CN110746302B - 一种紫锥菊中酚酸类化合物的分离制备方法

Info

Publication number: CN110746302B
Application number: CN201910984709.2A
Authority: CN
Inventors: 王晓; 马天宇; 王岱杰; 耿岩玲; 刘伟
Original assignee: Shandong Analysis and Test Center
Current assignee: Shandong Analysis and Test Center
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2019-10-16
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2039-10-16
Also published as: CN110746302A

Abstract

本发明涉及一种紫锥菊中酚酸类化合物的分离制备方法。首先利用pH区带逆流色谱中洗脱剂可以加快洗脱速度的性质进行了紫锥菊中酚酸类化合物的分段富集，然后再次利用pH区带逆流色谱从紫锥菊中分离得到了高纯度的咖啡酰酒石酸，阿魏酰酒石酸，香豆酰酒石酸，异阿魏酰酒石酸，咖啡酰酒石酸甲酯，菊苣酸(2,3‑O‑二咖啡酰酒石酸)，阿魏酸以及咖啡酸甲酯等8个酚酸类化合物。该方法提不仅保证了高进样量，还使含量较低的化合物在分段富集后凸显出来，在二次分离中得到更多的化合物，大大提高了分离效率。

Description

一种紫锥菊中酚酸类化合物的分离制备方法

技术领域

本发明属于紫锥菊中酚酸类化合物纯化分离领域，具体涉及一种紫锥菊中酚酸类化合物的分离制备方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

紫锥菊(Echinacea purpurea)是菊科紫锥菊属的多年生草本植物，原产于北美洲，现已在中国引种。紫锥菊在西方有悠久的药用历史，已被开发为酊剂，片剂，胶囊等多种剂型，多用于感染性疾病的治疗，如梅毒、疖子、脓肿、败血症以及上呼吸道感染等。其主要含有酚酸、烷基酰胺、黄酮及多糖类化合物，其中以菊苣酸为代表的酚酸类化合物具有提高免疫力、抗炎、抗菌抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，是紫锥菊中药用价值最高的一类化合物。

天然产物中化学成分的分离纯化方法通常是使用硅胶柱色谱、大孔树脂色谱等为代表的柱色谱实现分离，结合高效液相色谱制备纯化，然而其分离效率低、溶剂消耗大、样品回收率低等缺点是难以避免的。

pH区带逆流色谱是一种液-液色谱技术，根据化合物的pKa和极性的差异实现成分的分离。该技术分离效率高、重现性好、进样量大，且无固体固定相的不可逆吸附，已被广泛应用于有机酸、生物碱等可解离型化合物的分离制备，但现有的pH区带逆流色谱方法对于紫锥菊中多种酚酸类化合物的分离效率和产物纯度仍有待提高。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种紫锥菊中酚酸类化合物的分离制备方法，使用pH区带逆流色谱对紫锥菊中的酚酸类化合物进行分离纯化，从紫锥菊总酚酸粗提物中分离得到了菊苣酸等8种酚酸类化合物，图1为8个化合物I-VIII的化学结构式。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一种紫锥菊中酚酸类化合物的分离制备方法，包括：

紫锥菊总酚酸粗提物的制备；

将紫锥菊总酚酸粗提物分散溶剂体系X中，利用pH区带逆流色谱进行分段富集，收集2-3h内的洗脱液，回收浓缩后记为样品Fr.1；完成3h洗脱后直接吹出柱内的剩余溶剂作为样品Fr.2；

采用溶剂体系Ⅰ对样品Fr.1进行pH区带逆流色谱分离；

采用溶剂体系Ⅱ对样品Fr.2进行pH区带逆流色谱分离；

收集多种酚酸类化合物。

本研究中，首次将pH-ZRCCC运用到紫锥菊的酚酸类化合物的富集中，使低含量酚酸可以在接下来的纯化中凸显，从而高效地分离得到更多包括低含量酚酸在内的化合物，大大提高了分离效率。

研究表明：溶剂的选择对pH区带逆流色谱分离效果影响较大。因此，在一些实施例中，所述溶剂体系X由乙酸乙酯EtOAc—乙腈ACN—水H₂O组成，在静止分层后的上相加入三氟乙酸TFA作为固定相，下相加入氨水NH₃·H₂O作为流动相。在一些实施例中，所述溶剂体系Ⅰ由乙酸乙酯EtOAc—水H₂O组成，在静止分层后的上相中加入TFA作为固定相，在下相中加入NH₃·H₂O作为流动相。在一些实施例中，所述溶剂体系Ⅱ由乙酸乙酯EtOAc—正丁醇n-BuOH—乙腈ACN—水H₂O组成，在静止分层后的上相中加入TFA作为固定相，在下相中加入NH₃·H₂O作为流动相。以在保证高进样量的情况下更多的分离得到低含量化合物，使其更广泛的应用到酚酸类化合物的分离纯化中。

在一些实施例中，所述样品Fr.1具体回收方法为：将回收的洗脱液浓缩并用水稀释，然后酸化、萃取；最后，将有机相浓缩，即得。富集所得的低含量酚酸在样品中的浓度大大提高，可以被pH区带逆流色谱二次分离识别到。

由于本申请的目标化合物为酚酸类化合物，为了使其具有合适的分配系数K，以利于分离，本申请对不同溶剂体系和配比进行了系统摸索和尝试，发现：在一些实施例中，所述EtOAc-ACN-H₂O的体积比为4：1：5～5.1；在一些实施例中，所述EtOAc—H₂O的体积比为1：1～1.1；在一些实施例中，所述EtOAc—n-BuOH—ACN—H₂O的体积比为3：1：1：5～5.1，提高了各酚酸类化合物的分离效率和纯度。

研究表明：洗脱液的浓度大小决定了分析物在馏分中的富集浓度，保留剂和洗脱液的浓度大小则决定了分析物的保留时间。在一些实施例中，所述溶剂体系中TFA的浓度为5-10mM，NH₃·H₂O的浓度为5-30mM。以通过增加洗脱剂的浓度以加快洗脱速率。

本申请对溶剂体系的配制方法的具体配制方法并不作特殊的限定。在一些实施例中，所述溶剂体系的配制方法为：将各溶剂混合均匀后，静置分层，取上相加入三氟乙酸作为固定相，取下相加入氨水作为流动相；脱气，即得，以提高配制效率和溶剂体系的稳定性。

本发明还提供了任一上述的方法分离得到的酚酸类化合物，所述酚酸类化合物包括：咖啡酰酒石酸，阿魏酰酒石酸，香豆酰酒石酸，异阿魏酰酒石酸，咖啡酰酒石酸甲酯，菊苣酸(2,3-O-二咖啡酰酒石酸)，阿魏酸以及咖啡酸甲酯。

本发明还提供了上述的酚酸类化合物在制造治疗感染性疾病的药物中的应用，所述感染性疾病包括：梅毒、疖子、脓肿、败血症、上呼吸道感染。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种新的分离策略，即使用pH区带逆流色谱首先对紫锥菊总酚酸提取物进行高进样量下的分段富集，然后进一步使用pH区带逆流色谱纯化得到8种酚酸。研究结果表明，pH区带逆流色谱技术可以在保证高进样量的情况下更多的分离得到低含量化合物，使其更广泛的应用到酚酸类化合物的分离纯化中。

(2)本申请的提取方法简单、分离度好、纯度高、具有普适性，易于规模化生产。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1.紫锥菊中8个酚酸化合物的化学结构图。

图2.紫锥菊中总酚酸(crude sample)、分段富集所得两部分样品(Fr.1sample,Fr.2sample)以及单一化合物(I-VIII)的高效液相色谱图。实验条件：Compass C18色谱柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm)；流动相，乙腈(A)—0.1％甲酸水溶液(B)：0—15min，12％–30％A；15—20min，30％–38％A；20—25分钟，38％–100％A。柱温，25℃；流速1.0mL/min；紫外线检测波长，330nm。

图3.紫锥菊的酚酸粗提物以及样品Fr.1和Fr.2的pH区带逆流色谱图。

(a).EtOAc—n-BuOH—H₂O(4：1：5，v/v/v)(10mM TFA作为保留酸，30mM NH₃·H₂O作为洗脱碱)，进样量为3g；(b).EtOAc—H₂O(1：1，v/v)，(10mM TFA作为保留酸，10mM NH₃·H₂O作为洗脱碱)，Fr.1进样量为500mg，保留率为34.3％；(c).EtOAc—n-BuOH—ACN—H₂O(3：1：1：5，v/v/v/v)，(10mM TFA作为保留酸，10mM NH₃·H₂O作为洗脱碱)，Fr.2进样量为600mg，保留率为22.9％；实验条件：流速，2.0mL/min；转速800rpm；紫外线检测波长254nm。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对目前紫锥菊中酚酸类化合物分离效率低、溶剂消耗大、样品回收率低的问题。因此，本发明提出一种利用pH区带逆流色谱技术分段富集并纯化紫锥菊中酚酸类化合物的新方法。首先利用pH区带逆流色谱中洗脱剂可以加快洗脱速度的性质进行了紫锥菊中酚酸类化合物的分段富集，然后再次利用pH区带逆流色谱从紫锥菊中分离得到了高纯度的咖啡酰酒石酸，阿魏酰酒石酸，香豆酰酒石酸，异阿魏酰酒石酸，咖啡酰酒石酸甲酯，菊苣酸(2,3-O-二咖啡酰酒石酸)，阿魏酸以及咖啡酸甲酯等8个酚酸类化合物。该方法提不仅保证了高进样量，还使含量较低的化合物在分段富集后凸显出来，在二次分离中得到更多的化合物，大大提高了分离效率。

以下通过具体的实施例对本申请的技术方案进行说明。

实施例1：

1实验部分

1.1仪器与试剂

本研究中pH区带逆流色谱分离所使用的仪器主要包括TBE-300C高速逆流色谱仪，TBP-5002输液泵，DC-0506低温恒温槽(以上仪器均购于上海同田生物技术股份有限公司)，8823B紫外检测器(北京宾达英创科技有限公司)，3057-11便携式记录仪(重庆川仪自动化股份有限公司)以及UB-7pH计(丹佛仪器有限公司)；样品的分析与鉴定主要基于Waterse2695高效液相色谱仪，配有2998PDA检测器，四元泵，柱温箱以及自动进样器(美国沃特世科技有限公司)，布鲁克ADVANCE DPX 400核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司)。

紫锥菊的提取、分离所使用的试剂均为分析纯，购于天津市富宇精细化工有限公司，分析用试剂购于天津市康科德科技有限公司，水为使用Milli-Q超纯水系统所制得的超纯水(德国默克密理博有限公司)。

紫锥菊药材采集于山东中医药大学药圃，经周凤琴教授鉴定为紫锥菊(Echinaceapurpurea)的干燥地上部分。

1.2实验方法

1.2.1紫锥菊总酚酸及回收样品的制备

将3.5kg的紫锥菊粉碎，50％乙醇回流提取3次，每次使用50％乙醇20L，提取2小时。合并提取液，减压浓缩，加水复溶至1200mL。取等体积的石油醚萃取三次，去除脂溶性成分。然后用盐酸将水相pH调到2.0，加入等体积乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯相，减压回收乙酸乙酯，得紫锥菊总酚酸粗提物40.2g。

分段富集后所得样品的回收方法如下。将回收的洗脱液浓缩并用水稀释，然后用盐酸将样品溶液酸化至pH2.0并用等体积的乙酸乙酯萃取三次。将有机相浓缩用于进一步的pH区带逆流色谱的制备纯化。

1.2.2溶剂体系及样品溶液的制备

根据所选的溶剂体系将溶剂按照比例分别倒入分液漏斗中，振荡后静置12小时，分层后取上相加入一定浓度的三氟乙酸作为固定相，取下相加入一定浓度的氨水作为流动相。将上述两相溶剂超声2分钟，以溶解酸碱并排出气泡。

将紫锥菊总酚酸粗提物及分段所得的各段样品分别置于试管中，加入8mL含有三氟乙酸的上相和等体积的不加氨水的下相，超声溶解，作为pH区带逆流色谱的样品溶液。

1.2.3酚酸类化合物的分配系数K的测定

研究表明，目标化合物具有合适的分配系数K是pH区带逆流色谱分离成功的关键，pH区带逆流色谱中化合物K值的测定方法如下。首先将10mg样品加入试管中并用5mL上相和等体积下相各充分溶解，将氨水加入到样品溶液中以调节溶液pH为10，振荡。溶剂体系达到平衡后，取上、下相各5μl分别使用高效液相色谱分析。碱性溶剂体系中化合物的分配系数K_base的计算方法为上相中的目标化合物的峰面积(A_U)除以下相中目标化合物的峰面积(A_L)。如果K_base<<1，则将三氟乙酸加入上述样品溶液中以调节pH到2左右，上、下相各取5μl经高效液相色谱进行分析。酸性条件下的分配系数K_acid的计算方法同样为A_U/A_L。

1.2.4pH区带逆流色谱的分离过程

将上相以40mL/min的速度泵入并充满高速逆流色谱仪分离柱，然后将样品溶液从进样环注入分离柱，调节分离柱的转速至800rpm，同时将下相以2.0mL/min的速度泵入分离柱。将事先打开预热的紫外检测器调整到254nm，启动记录仪记录pH区带逆流色谱图。手动收集洗脱液，并用pH计测定分离过程中pH值的变化。分离结束后，用空气压缩机将分离柱中的溶剂吹至量筒中，计算固定相的保留率。固定相保留率为分离柱中剩余固定相体积与分离柱总体积的比值。

1.2.5高效液相色谱分析与化合物结构鉴定

将紫锥菊的总酚酸粗提物和pH区带逆流色谱分离所得洗脱馏分使用高效液相色谱进行分析。HPLC分析条件为Compass C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(A)–0.1％甲酸水溶液(B)：0–15min，12％–30％A；15–20min，30％–38％A；20–21min，38％–100％A；21–30min，100％。流速1.0mL/min，检测波长330nm，进样量10μL。

pH区带逆流色谱分离所得纯组分经¹H-NMR和¹³C-NMR鉴定。

2结果与讨论

2.1样品的高效液相色谱分析

图2是紫锥菊总酚酸、分段富集所得两部分样品以及单一化合物的高效液相色谱图。基于330nm处的峰面积归一化，在样品Fr.1中五个目标化合物I-V的百分比分别为46.0％(峰I)，6.7％(峰II)，9.1％(峰III)，4.1％(峰IV)和4.7％(峰V)，而化合物VI-VIII在样品Fr.2中分别占52.0％(峰VI)，10.5％(峰VII)和3.6％(峰VIII)。

2.2pH区带逆流色谱溶剂体系的优化

2.2.1使用pH区带逆流色谱的分段富集方法

根据紫锥菊酚酸粗提物的紫外吸收光谱本申请发现除了几个主要峰之外，样品中还含有许多低含量酚酸，使用pH区带逆流色谱难以完成一步纯化。因此，迫切需要一种分离时间短且进样量大的方法进行分段富集，然后再进行二次分离完成酚酸的纯化。据报道，增加流动相中洗脱剂的浓度可以提高矩形平台中化合物的浓度，从而缩短分离时间。因此，本申请考虑通过增加洗脱剂的浓度以加快洗脱速率的方法实现酚酸粗提物的分段富集。首先使用由EtOAc—ACN—H₂O(4：1：5，v/v/v)组成的两相溶剂系统(上相加入10mM TFA，下相加入30mM NH₃·H₂O)用于3g酚酸粗提物的分段富集，其pH区带逆流色谱图如图3(a)所示。完成分段富集后，收集2-3h内的洗脱液如1.2节所述回收，所得样品的质量为0.63g，记为样品Fr.1；收集3小时后的洗脱液，回收浓缩后得到0.6g样品，记为样品Fr.2。结合HPLC分析(图2)，发现样品Fr.1主要包含酚酸粗提物HPLC色谱图的前12.5min内的峰，而Fr.2含有12.5min后的色谱峰。所以在之后的分段富集实验中，本申请可以在完成3h洗脱后直接吹出柱内的剩余溶剂作为样品Fr.2，而不必完成整个富集过程，这样一次分段富集时间可以缩短到3小时。以上研究表明将pH区带逆流色谱应用到粗提物的分段富集中的方法是高效且可行的，富集所得的低含量酚酸在样品中的浓度大大提高，可以被pH区带逆流色谱二次分离识别到。因此，分段富集所得的样品Fr.1和Fr.2将用于接下来的pH区带逆流色谱纯化中。

2.2.2通过pH区带逆流色谱制备纯化酚酸

首先计算了样品Fr.1和Fr.2中的目标化合物I-VIII在所选溶剂体系中的分配系数K，如表1所示所有溶剂体系均可提供合适的K值。用于样品Fr.1分离的溶剂体系由EtOAc—H₂O(1：1，v/v)组成，其中上相加入10mM TFA，下相加入10mM NH₃·H₂O，进样量500mg，pH区带逆流色谱图如图3(b)所示。化合物I-V在6h内成功分离，通过HPLC分析测定，纯度分别为96.1％，93.8％，92.4％，95.2％和96.1％(图2)。分别收集这五部分洗脱液并在真空冷冻干燥器中干燥，得到化合物I47.3mg，化合物II5.2mg，化合物III3.5mg，化合物IV4.4mg，化合物V5.6mg。

对于样品Fr.2的分离，所使用的两相溶剂体系为EtOAc—n-BuOH—ACN—H₂O(3：1：1：5，v/v/v/v)，在上相中加入10mM TFA，在下相中加入10mM NH₃·H₂O，进样量600mg。pH区带逆流色谱图如图3(c)所示，结合HPLC分析本申请发现，三个目标化合物VI-VIII伴随着三个矩形平台的出现而被成功洗脱，分离时间约为9小时，保留率为22.9％。最后，得到35.8mg化合物VI，21.2mg化合物VII和4.9mg化合物VIII，纯度分别为96.3％，95.6％和95.0％(图2)。

表1

样品Fr.1and Fr.2中目标化合物I-VIII在两相溶剂体系中的分配系数K_acid与K_base

2.3化学结构鉴定

结合以上8个纯化峰的¹H-NMR和¹³C-NMR谱图并参考文献鉴定得，本申请从紫锥菊中经pH区带逆流色谱分离得到8个高纯度化合物，分别为咖啡酰酒石酸(I)，阿魏酰酒石酸(II)，香豆酰酒石酸(III)，异阿魏酰酒石酸(IV)，咖啡酰酒石酸甲酯(V)，菊苣酸(2,3-O-二咖啡酰酒石酸)(VI)，阿魏酸(VII)以及咖啡酸甲酯(VIII)。

3总结

本申请提出了一种新的分离策略，即使用pH区带逆流色谱首先对紫锥菊总酚酸提取物进行高进样量下的分段富集，然后进一步使用pH区带逆流色谱纯化得到8种酚酸。研究结果表明，pH区带逆流色谱技术可以在保证高进样量的情况下更多的分离得到低含量化合物，使其更广泛的应用到酚酸类化合物的分离纯化中。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种紫锥菊中酚酸化合物的分离制备方法，其特征在于，包括：

紫锥菊总酚酸粗提物的制备；

将紫锥菊总酚酸粗提物分散溶剂体系X中，利用pH区带逆流色谱进行分段富集，收集2-3h内的洗脱液，回收浓缩后记为样品Fr. 1；完成3 h洗脱后直接吹出柱内的剩余溶剂作为样品Fr. 2；

采用溶剂体系Ⅰ对样品Fr. 1进行pH区带逆流色谱分离；

采用溶剂体系Ⅱ对样品Fr. 2进行pH区带逆流色谱分离；

收集酚酸化合物；所述酚酸化合物为：咖啡酰酒石酸，阿魏酰酒石酸，香豆酰酒石酸，异阿魏酰酒石酸，咖啡酰酒石酸甲酯，菊苣酸，阿魏酸以及咖啡酸甲酯；

所述溶剂体系X由乙酸乙酯EtOAc—乙腈ACN—水H₂O组成，在静止分层后的上相加入三氟乙酸TFA作为固定相，下相加入氨水NH₃∙H₂O作为流动相；

所述溶剂体系Ⅰ由乙酸乙酯EtOAc—水H₂O组成，在静止分层后的上相中加入TFA作为固定相，在下相中加入NH₃∙H₂O作为流动相；

所述溶剂体系Ⅱ由乙酸乙酯EtOAc—正丁醇n-BuOH—乙腈ACN—水H₂O组成，在静止分层后的上相中加入TFA作为固定相，在下相中加入NH₃∙H₂O作为流动相。

2.如权利要求1所述的紫锥菊中酚酸化合物的分离制备方法，其特征在于，所述样品Fr. 1具体回收方法为：将回收的洗脱液浓缩并用水稀释，然后酸化、萃取；最后，将有机相浓缩，即得。

3.如权利要求1所述的紫锥菊中酚酸化合物的分离制备方法，其特征在于，所述溶剂体系X中EtOAc-ACN-H₂O的体积比为4：1：5~5.1。

4.如权利要求1所述的紫锥菊中酚酸化合物的分离制备方法，其特征在于，所述溶剂体系Ⅰ中EtOAc—H₂O的体积比为1：1~1.1。

5.如权利要求1所述的紫锥菊中酚酸化合物的分离制备方法，其特征在于，所述溶剂体系Ⅱ中EtOAc—n-BuOH—ACN—H₂O的体积比为3：1：1：5~5.1。

6.如权利要求1所述的紫锥菊中酚酸化合物的分离制备方法，其特征在于，所述溶剂体系X中TFA的浓度为5~10 mM，NH₃∙H₂O的浓度为5~30mM。

7.如权利要求1所述的紫锥菊中酚酸化合物的分离制备方法，其特征在于，各溶剂体系的配制方法为：将各溶剂混合均匀后，静置分层，取上相加入三氟乙酸作为固定相，取下相加入氨水作为流动相；脱气，即得。