CN114875091A - 一种高效制备交链孢酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效制备交链孢酚的方法，该方法包括如下步骤：将互隔交链孢菌接种在PDA培养基上，黑暗条件下活化；取小块接种于新的培养基进行培养；在旋转涡旋仪上涡旋，收集提取液；提取液过滤、蒸干；乙酸乙酯提取、蒸干；两次中压制备；重结晶。本发明的高效制备交链孢酚的方法，简化了提取净化步骤，保护色谱柱，极大的提高了制备效率的同时显著降低成本。通过本发明的方法制备得到的交链孢酚产量高、纯度高，可作为标准品应用于食品中交链孢酚的检测、防控及其毒理学研究。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全领域，具体的说涉及一种高效制备交链孢酚的方法。
背景技术
交链孢酚(Alternariol，AOH)是由链格孢属(Alternaria spp.)真菌侵染农作物后在适宜温度和湿度下产生的一种二苯并-α-吡喃酮类链格孢霉毒素。它在1953年首次由Raistrick从微生物中分离得到，为白色粉末状固体，分子式：C14H10O5，分子量：258.23，易溶于甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亚砜等有机溶剂。
交链孢酚是在谷物、饲料及果蔬中存在的最普遍的链格孢霉毒素之一，可通过食物链对人类和动物健康造成严重危害。研究表明，交链孢酚主要通过造成机体的氧化应激产生ROS并与DNA拓扑异构酶相互作用，导致DNA单链和双链断裂，进而阻止细胞增殖，此外，交链孢酚在结构上类似于雌二醇，表现出雌激素效应并干扰类固醇生成。
欧洲食品安全局(EFSA)采用毒理学关注阈值(TTC)来评价交链孢酚对人体造成的潜在风险，其TTC值为2.5μg/kg body weight/day。但是目前尚无适用于食品和饲料中交链孢酚的限量标准，且交链孢酚的代谢分布研究较少，其进入动物体后的动力学规律仍不清楚，而研究AOH的毒理学及其在体内的迁移转化、分析检测和风险评估等需要用到大量的标准品。
目前，交链孢酚的制备方法主要为溶剂分配法、索氏抽提法和硅胶柱层析法等，但这些方法都很耗时且目标物纯度较低，不适用于大规模制备。Chu等以大米培养基为产毒基质，二氯甲烷为提取溶剂，首次采用半制备及制备液相分离纯化三种链格孢霉毒素，极大地提高了制备效率且目标物纯度达到95％，但该方法培养周期较长，提取溶剂毒性较大，制备步骤复杂，不适用于工业级制备。而且目前的交链孢酚标准品，价格昂贵约为1500元/mg。
因此，迫切需要开发新的交链孢酚的纯化制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效制备交链孢酚的方法，该方法包括如下步骤：将互隔交链孢菌接种在PDA培养基上，黑暗条件下活化培养；取小块接种于新的培养基进行培养；在旋转涡旋仪上涡旋，收集提取液；提取液过滤、蒸干；乙酸乙酯提取、蒸干；两次中压制备；重结晶。
具体的说，本发明的一种高效制备交链孢酚的方法，该方法包括如下步骤:
(1)将互隔交链孢菌(ATCC 66981，购自美国模式培养物集存库(Americantypeculture collection，ATCC))接种在PDA培养基上，20-40℃黑暗条件下活化培养3-10d；
(2)用无菌牙签从步骤(1)得到的PDA培养基菌丝边缘上取小块接种于新的培养基进行培养，培养的条件为：
③PDA或PDB培养基(培养基初始pH 4-7)在20-40℃黑暗条件下培养5-10d；或者是：
④大米或玉米培养基在20-40℃黑暗条件下培养20-40d；
(3)将步骤(2)得到的培养基转移到锥形瓶中，加入乙腈，在旋转涡旋仪以100-500rpm/min的速度涡旋1-5min，然后超声0.5-3h，重复此步骤2-5次，收集提取液；
(4)将步骤(3)得到的提取液用纱布过滤到旋蒸瓶中，旋转蒸发仪30-60℃下旋蒸，直至液体全部蒸干；
(5)将蒸干后的固体用纯水复溶转移到分液漏斗中，加入乙酸乙酯(乙酸乙酯与水的比例为1：0.5-3(v/v))，剧烈摇晃20-100次左右，静置等待液体分层，收集上层溶液，重复此步骤2-5次，将萃取后收集的液体再次旋蒸浓缩至干，得到固体物质；
(6)将步骤(5)收集的固体物质经甲醇/乙腈或其它有机溶剂溶解后过0.22μm滤膜，使用中压制备液相仪，依次进行两次中压制备：
一次制备条件：Unitary C18制备色谱柱，10mm×250mm，5μm或其它等效柱；流动相A为0.1-1％的甲酸-水或者0.1-1％的乙酸水，B为甲醇或乙腈(或其它有机相)，流速为5-30mL/min，检测波长为256nm，进样量为1mL，收集10～25min馏分液，将馏分液30-60℃旋蒸浓缩至干，再次复溶后进行二次制备；
二次制备条件：Unitary C18制备色谱柱，10mm×250mm，5μm或其它等效柱；流动相A为0.1-1％的甲酸-水或者0.1-1％的乙酸水，B为甲醇或乙腈(或其它有机相)，流速为5-30mL/min，检测波长为256nm，进样量为1mL，收集10～25min馏分液，30-60℃水浴旋蒸后置于冷冻真空干燥机干燥，获得淡黄色固体；
(7)将(6)获得的淡黄色固体通过甲醇、乙腈、丙酮或其它有机溶剂进行重结晶，吸去上清液，重复3-20次，直到上清液澄清透明得到结晶后的交链孢酚。
更为具体的说，本发明的一种高效制备交链孢酚的方法，包括如下步骤：
(1)将互隔交链孢菌接种在PDA培养基上，28℃黑暗条件下活化培养5d；
(2)用无菌牙签从步骤(1)得到的PDA培养基菌丝边缘上取小块接种于新的培养基进行培养，培养的条件为：
PDA培养基，培养基初始pH 6.4，在28℃黑暗条件下培养8d；
(3)将步骤(2)得到的培养基转移到锥形瓶中，加入乙腈，在旋转涡旋仪以200rpm/min的速度涡旋2min，然后超声1h，重复此步骤3次，收集提取液；
(4)将步骤(3)得到的提取液用纱布过滤到旋蒸瓶中，旋转蒸发仪50℃下旋蒸，直至液体全部蒸干；
(5)将蒸干后的固体用纯水复溶转移到分液漏斗中，加入等体积的乙酸乙酯，剧烈摇晃，静置等待液体分层，收集上层溶液，重复此步骤2-5次，将萃取后收集的液体再次旋蒸浓缩至干，得到固体物质；
(6)将步骤(5)收集的固体物质经甲醇或乙腈溶解后过0.22μm滤膜，使用中压制备液相仪，依次进行两次中压制备，获得淡黄色固体；
一次制备条件：Unitary C18制备色谱柱，10mm×250mm，5μm；流动相A为0.1％的甲酸-水，B为甲醇，流速为20mL/min，检测波长为256nm，进样量为1mL，收集15～17.5min馏分液，将馏分液50℃旋蒸浓缩至干，再次复溶后进行二次制备；
二次制备条件：Unitary C18制备色谱柱，10mm×250mm，5μm；流动相A为0.1％的甲酸-水，B为甲醇，流速为20mL/min，检测波长为256nm，进样量为1mL，收集18.4～19.7min馏分液，50℃水浴旋蒸后置于冷冻真空干燥机干燥，获得淡黄色固体；
(7)将(6)获得的淡黄色固体通过甲醇、乙腈或丙酮进行重结晶，吸去上清液，重复2-5次，直到上清液澄清透明得到结晶后的交链孢酚。
将制备得到的交链孢酚通过超高效液相色谱(UPLC-PDA)面积归一法和定量核磁检测其纯度。
本发明提供了一种简单快速、价格低廉、纯度高且可大量制备交链孢酚的方法。该方法选择产毒量高、杂质较少和培养时间短的PDA培养基为产毒培养基，然后经过提取、萃取后通过制备液相分离纯化及重结晶，最终获得了纯度较高的目标化合物。该工艺操作简单、制备效率快，可大幅度降低生产成本，同时纯度达到99％以上，可作为标准品应用于食品中交链孢酚的检测、防控及其毒理学研究。
与现有技术相比，本发明有以下有益的技术效果：
(1)互隔交链孢菌ATCC 66981在最佳培养条件下得到交链孢酚的产量高达2096.1mg/kg；
(2)高产交链孢酚的培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)时，培养时间短；
(3)获得的AOH高含量培养基杂质含量少，简化提取净化步骤，保护色谱柱，极大的提高了制备效率，显著降低成本。
(4)采用反相制备色谱法结合重结晶法纯化得到高纯度的交链孢酚，显著提升了标准物质的纯度的同时提高了制备效率。
附图说明
图1为制备品AOH的红外光谱图
图2为制备品AOH的核磁氢谱
图3为制备品AOH的碳谱
图4为制备品AOH的紫外吸收波谱图
图5为ESI+和ESI-模式下制备品AOH的飞行时间质谱图
图6为AOH收集液的液相色谱图
具体实施方式
实施例一：
下列实施例中所用的PDA培养基为：4g PDA粉末加100mL水溶解而成(PDA粉末：北京陆桥技术有限责任公司)
1、产毒培养
将互隔交链孢菌株(ATCC 66981，购自美国模式培养物集存库(American typeculture collection，ATCC))接种在PDA培养基上，28℃黑暗条件下活化培养5d，用无菌牙签从培养基边缘上取小块接种于新的PDA培养基中，培养基初始pH 6.4，培养条件为培养温度28.0℃、培养时间8d。
2、培养基中AOH含量测定
培养基通过UPLC XEVOTQ-S超高效液相色谱-串联质谱联用仪(美国Waters公司)进行测定，交链孢酚的产量高达2096.1mg/kg。
3、样品提取
将上述PDA培养基转移到1L的锥形瓶中，加入900mL乙腈，在旋转涡旋仪以200rpm/min的速度涡旋2min，然后超声1h，重复此步骤三次。将提取液用四层纱布(100目)过滤到旋蒸瓶中，50℃旋转蒸发仪浓缩，直至液体全部蒸干。
4、萃取
将旋蒸干的固体用水复溶(溶解至无物体颗粒)转移到分液漏斗中，加入等体积的乙酸乙酯，剧烈摇晃50次左右，静置等待液体分层，将上清液(乙酸乙酯层)收集，重复此步骤3次，将萃取后的液体再次旋蒸浓缩至干，得到固体物质。
5、将上述固体物质进行两次中压制备
5.1一次制备
色谱条件：Unitary C18制备色谱柱(10mm×250mm，5μm，浙江华谱新创科技有限公司)；流动相A为0.1％(v/v)甲酸-水，B为甲醇；流速20mL/min；进样量1000μL。洗脱梯度见表1。
表1一次制备梯度洗脱条件
馏分采集条件：经Unitary C18制备色谱柱分离使杂质和目标物AOH完全分离，在15～17.5min时间段(表2)收集AOH馏分，防止杂质和目标物交叉污染。将馏分液50℃旋蒸浓缩至干，再次复溶后进行二次制备。
表2 AOH馏分收集时间
5.2二次制备条件
色谱条件：Unitary C18制备色谱柱(10mm×250mm，5μm，浙江华谱新创科技有限公司)；流动相A为0.1％(v/v)甲酸-水，B为甲醇；流速20mL/min；进样量1000μL。洗脱梯度见表3。
表3二次制备梯度洗脱条件
馏分采集条件：经Unitary C18制备色谱柱二次制备使杂质和目标物AOH进一步分离，在固定时间段(18.4～19.7min)收集AOH馏分(表4)，防止杂质和目标物交叉污染。收集馏分液，50℃水浴旋蒸后置于冷冻真空干燥机干燥，获得淡黄色固体。
表4AOH馏分收集时间
6、重结晶
将获得的淡黄色固体通过甲醇重结晶后得到结晶后的交链孢酚。
7、冷冻干燥
将获得的结晶后的AOH固体进一步置于-80℃保存过夜后置冷冻干燥机干燥，直至完全冻干，将固体粉末取出，-20℃保存。
实施例二
对实施例一制备得到的AOH进行定性分析及纯度测定
1、红外光谱鉴定
红外光谱是表征化合物主要组成基团的有力手段。实施例一制备的AOH的FT-IR光谱如图1所示，FT-IR光谱中出现了几个主要吸收带，分别是在3444、3183、1661、1612、1421、1164和794cm-1，表明实施例一所制备的化合物为AOH。
2、核磁共振鉴定
NMR是分析与鉴定化合物结构的一种较为有效的手段，常常被用于制备样品鉴定及纯度测定。将实施例一中制备得到的AOH固体粉末溶于DMSO-d6(纯度99.9％，上海阿达玛斯试剂有限公司)，1H和13C核磁图谱分别如图2和图3所示，进一步证明制备品为AOH。
3、紫外鉴定
如图4所示，制备品在255.7nm、299.4nm和338.9nm有紫外吸收，进一步证明实施例一的制备品为AOH。
4、飞行时间质谱鉴定
LC-Q-TOF/MS条件：ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm，美国Waters公司)；流动相A为乙腈，B为水(含有3mmol/L乙酸铵和0.1％v/v的甲酸)，梯度洗脱：0～2min，5％B～15％B；2～10min，15％B～60％B；10～15min，60％B～90％B；15～16min，90％B～90％B；16～16.5min，90％B～5％B；16.5～18min，5％B～5％B。流速0.4mL/min，进样量为8μL。雾化气压采用电喷雾ESI离子源，离子源温度550℃，喷雾电压3.5kV(ESI+)和5.5kV(ESI–)；去簇电位和碰撞能量分别为80V和10V；扫描范围100～900(m/z)；碎裂电压为1.5V，扫描力3500Pa；鞘气压45Pa；辅助气压15Pa。
将实施例一获得的AOH在正负离子模式进行全扫描，均得到单一且高峰度的色谱峰。然后进一步对特征峰在正离子模式和负离子模式下进行母离子扫描，在正离子模式下，化合物的主要分子离子峰为259.04[M+H]+，主要分子离子峰的主要二级碎片213.04、185.04、128.05；在负离子模式下，化合物的主要分子离子峰为257.04[M-H]-，主要分子离子峰的主要二级碎片213.05、212.04、147.04，进一步证明制备品为AOH(图5)。
5、超高效液相色谱仪配二极管阵列检测器(UPLC-PDA)全扫描
色谱条件：ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm，美国Waters公司)；流动相A为乙腈，B为纯水；0～8min，40％A～60％A；8.0～8.5min，60％A～90％A；8.5～10.5min，90％A～90％A；10.5～11.0min，90％A～40％A；11～15min，40％A～40％A；流速0.3mL/min；进样量5μL；紫外检测器；波长210nm～400nm。
通过UPLC-PDA全扫描制备得到的AOH制备品进行纯度分析，结果发现通过面积归一法测得AOH的纯度达到99％以上(图6)。
6、定量核磁测定纯度
称取10mg实施例一制备得到的AOH和10mg苯甲酸(国家标准物质GBW06117，纯度99.99％，中国计量科学研究院)于核磁管中，然后加入550μL DMSO-d6(纯度99.9％，上海阿达玛斯试剂有限公司)充分溶解，将核磁管进行核磁共振仪(AC-80，Bruker Biospin GmbH，德国)测定，仪器频率为500Hz。利用MestReNova 14软件(西班牙Mestrelab Research公司)进行数据处理，得到AOH的纯度为99.3％。
综上所述，实施例一的高效制备交链孢酚的方法，培养周期仅为8天且PDA培养基提取液中杂质较少，保护色谱柱，提高了制备效率，可大幅度降低生产成本，同时纯度达到99％以上，可作为标准品应用于食品中交链孢酚检测、防控及其毒理学研究。
Claims (3)
1.一种高效制备交链孢酚的方法，其特征在于该方法具体包括如下步骤:
(1)将互隔交链孢菌接种在PDA培养基上，20-40℃黑暗条件下活化培养3-10d；
(2)用无菌牙签从步骤(1)得到的PDA培养基菌丝边缘上取小块接种于新的培养基进行培养，培养的条件为：
①PDA或PDB培养基，培养基初始pH 4-7，在20-40℃黑暗条件下培养5-10d；
或者是：
②大米或玉米培养基在20-40℃黑暗条件下培养20-40d；
(3)将步骤(2)得到的培养基转移到锥形瓶中，加入乙腈，在旋转涡旋仪以100-500rpm/min的速度涡旋1-5min，然后超声0.5-3h，重复此步骤2-5次，收集提取液；
(4)将步骤(3)得到的提取液用纱布过滤到旋蒸瓶中，旋转蒸发仪30-60℃下旋蒸，直至液体全部蒸干；
(5)将蒸干后的固体用纯水复溶转移到分液漏斗中，加入乙酸乙酯，乙酸乙酯与水的比例为1：0.5-3，v/v，剧烈摇晃20-100次左右，静置等待液体分层，收集上层溶液，重复此步骤2-5次，将萃取后收集的液体再次旋蒸浓缩至干，得到固体物质；
(6)将步骤(5)收集的固体物质经甲醇或乙腈溶解后过0.22μm滤膜，使用中压制备液相仪，依次进行两次中压制备，获得淡黄色固体；
(7)将(6)获得的淡黄色固体通过甲醇、乙腈或丙酮进行重结晶，吸去上清液，重复0-10次，直到上清液澄清透明得到结晶后的交链孢酚。
2.根据权利要求1所述的高效制备交链孢酚的方法，其中两次中压制备的条件为：
一次制备条件：Unitary C18制备色谱柱，10mm×250mm，5μm或其它等效柱；流动相A为0.1-1％的甲酸-水或者0.1-1％的乙酸-水(v/v)，B为甲醇或乙腈，流速为5-30mL/min，检测波长为256nm，进样量为1mL，收集10～25min馏分液，将馏分液30-60℃旋蒸浓缩至干，再次复溶后进行二次制备；
二次制备条件：Unitary C18制备色谱柱，10mm×250mm，5μm或其它等效柱；流动相A为0.1-1％的甲酸-水或者0.1-1％的乙酸-水，B为甲醇或乙腈，流速为5-30mL/min，检测波长为256nm，进样量为1mL，收集10～25min馏分液，30-60℃水浴旋蒸后置于冷冻真空干燥机干燥，获得淡黄色固体。
3.根据权利要求1或2任一项所述的高效制备交链孢酚的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)将互隔交链孢菌接种在PDA培养基上，28℃黑暗条件下活化培养5d；
(2)用无菌牙签从步骤(1)得到的PDA培养基菌丝边缘上取小块接种于新的培养基进行培养，培养的条件为：
PDA培养基，培养基初始pH 6.4，在28℃黑暗条件下培养8d；
(3)将步骤(2)得到的培养基转移到锥形瓶中，加入乙腈，在旋转涡旋仪以200rpm/min的速度涡旋2min，然后超声1h，重复此步骤3次，收集提取液；
(4)将步骤(3)得到的提取液用纱布过滤到旋蒸瓶中，旋转蒸发仪50℃下旋蒸，直至液体全部蒸干；
(5)将蒸干后的固体用纯水复溶转移到分液漏斗中，加入等体积的乙酸乙酯，剧烈摇晃，静置等待液体分层，收集上层溶液，重复此步骤2-5次，将萃取后收集的液体再次旋蒸浓缩至干，得到固体物质；
(6)将步骤(5)收集的固体物质经甲醇或乙腈溶解后过0.22μm滤膜，使用中压制备液相仪，依次进行两次中压制备，获得淡黄色固体；
一次制备条件：Unitary C18制备色谱柱，10mm×250mm，5μm；流动相A为0.1％(v/v)的甲酸-水，B为甲醇，流速为20mL/min，检测波长为256nm，进样量为1mL，收集15～17.5min馏分液，将馏分液50℃旋蒸浓缩至干，再次复溶后进行二次制备；
二次制备条件：Unitary C18制备色谱柱，10mm×250mm，5μm；流动相A为0.1％(v/v)的甲酸-水，B为甲醇，流速为20mL/min，检测波长为256nm，进样量为1mL，收集18.4～19.7min馏分液，50℃水浴旋蒸后置于冷冻真空干燥机干燥，获得淡黄色固体；
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