CN113796386A - 精氨酸作为链格孢毒素生物合成抑制剂的应用 - Google Patents

精氨酸作为链格孢毒素生物合成抑制剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了精氨酸作为链格孢毒素生物合成抑制剂的应用。本发明中的精氨酸为氨基酸类化合物，成本低，对人体具有调节血糖，保护肝脏，延缓衰老的功能。精氨酸使用时配制成浓度为1mmol/L及以上浓度的水溶液，可以有效抑制PDA培养基以及黄桃等瓜果蔬菜中链格孢毒素的生物合成，效果好，安全无毒副作用。

Description

精氨酸作为链格孢毒素生物合成抑制剂的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及精氨酸作为链格孢毒素生物合成抑制剂的应用。
技术背景
链格孢毒素是链格孢菌属产生的一类有毒次生代谢产物，主要包括链格孢酚(AOH)、交链格孢酚单甲醚(AME)、细交链格孢菌酮酸(TeA)和腾毒素(TEN)等，在黄桃等瓜果蔬菜中广泛存在，严重影响了我国瓜果蔬菜的质量安全和人民的健康。链格孢毒素主要由互生交链孢(Alternaria alternata)和细交链孢霉(Alternaria tenuis)产生，具有致突变性、致癌性和基因毒性等多种毒性。TeA能够与其他链格孢毒素产生协同作用，产生更大的毒性。此外，TEN还具有植物毒性，能通过降低植物细胞内ATP酶活性来抑制光合磷酸化，并与植物萎黄病密切相关。
AOH、AME、TeA、TEN已成为中国蔬菜、水果质量安全的主要威胁：2014年，对320个番茄、洋葱和红色软质水果样品的检测结果发现，97个检出了AOH，79个检出了AME，检出率分别为30.3％和24.7％。2016年，在重庆市柑橘主产果园中发现链格孢毒素的总检出率为27.43％，TeA检出含量最高，为66.55μg/kg。2017年，从新疆红枣缩果病样品和枣果黑斑病样品中分离出的139株菌株中，链格孢菌131株，占94.25％，是这两种病害的主要致病菌。鉴于链格孢毒素的强烈毒性和广泛分布性，欧洲食品安全局(EFSA)采用毒理学关注阈值(TTC)来评价链格孢霉毒素对人体造成的潜在风险，AOH和AME的TTC值为2.5ng/kg bodyweight/day,TeA和TEN的TTC值为1500ng/kg body weight/day。
为更好的防控链格孢毒素污染，减少财产损失，保障人民健康和生命安全，开发能够高效抑制链格孢毒素产生，且安全、无毒的抑菌剂具有非常重要的经济价值和社会意义。
Figure BDA0003336556850000021
发明内容
本发明提供了精氨酸作为链格孢毒素合成抑制剂的应用；
具体的说，精氨酸使用时可配制成浓度为1mmol/L及以上浓度的水溶液；
更具体的说，精氨酸水溶液浓度为1-1000mmol/L；
进一步优选的精氨酸水溶液浓度为10-500mmol/L；
进一步优选的，精氨酸水溶液用于瓜果蔬菜如西红柿、红枣、黄桃等作为链格孢毒素合成抑制剂时，优选的精氨酸水溶液浓度为50-500mmol/L；
精氨酸作为链格孢毒素合成抑制剂时，可以将精氨酸水溶液直接喷洒到蔬菜或水果表面、或者直接加入基质等。
本发明提供的精氨酸作为链格孢毒素合成抑制剂的用途，其具备以下优点：
(1)本发明首次发现了精氨酸在不同基质中可以有效抑制链格孢毒素的生成；
(2)本发明的精氨酸属于商品化产品来源广、价格低廉，形成的抑制剂成本低，能够大规模应用。
(3)本发明的精氨酸属于人体必需氨基酸，对人畜安全性好，对环境无污染；
(4)本发明的抑制剂使用简单，普通人员简单培训即可使用，有益于大规模推广；
(5)精氨酸抑制链格孢毒素生物合成的活性为首次提出，与现有的其它抑制剂相比，精氨酸抑制效果更为显著、成本更低、对生物体无危害，且不易产生抗药性。
附图说明
图1不同浓度精氨酸对PDA培养基中链格孢霉毒素生成的影响
图2不同浓度精氨酸对黄桃培养基中链格孢霉毒素生成的影响
其中，A、AOH；B、AME；C、TeA；D、TEN
具体实施方式
下列为各实施例中所用的实验方法：
(1)试剂
葡萄糖、琼脂(上海源叶生物科技有限公司)；乙腈、甲醇、乙酸铵(美国Merck公司)；精氨酸(上海国药集团化学试剂有限公司)；AOH标准品、AME标准品、TeA标准品、TEN标准品(纯度大于99％,美国Romer公司)
(2)仪器
超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；TRIPLE QUADTM 5500三重四级杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)；HSC-24B氮吹仪(上海楚定分析仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；AL104分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；SK8210LHC超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)；BJ-800A食品粉碎机(杭州德清拜杰电器有限公司)；SX-500高压灭菌锅(日本TOMY公司)；MGC-300H人工气候箱(上海一恒科学仪器有限公司)；GZX-CF101-2-BS电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；Heraeus MultifugeX3高速离心机(美国Thermo Fisher scientific 公司)
(3)菌株培养基
PDA培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g、琼脂16g，用蒸馏水定容至1000mL，115℃高压灭菌30min，降温到55℃左右倒平板，每平板20mL。
PDB液体培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1000mL，115℃高压灭菌30分钟。
黄桃培养基：称取50g优质黄桃至250mL三角瓶，加入10mL蒸馏水混匀，用透气封口膜密封瓶口，高压灭菌(121℃，30min)，冷却后将黄桃摇散待用。
(4)产毒菌株活化
将链格孢属(Alternaria ochroleuca)CBSX2菌株(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，互隔交链孢ATCC 66981(购自美国模式培养物集存库ATCC)接种于PDA培养基，28℃黑暗培养7天后，接种至PDB液体培养基中，25℃下150r/min震荡继续培养5天。取孢子液，显微镜观察孢子浓度，用无菌水调整至105个/mL，用于后续接种。
(5)菌株接种
将100μL培养好的孢子液接种至PDA培养基，黑暗中培养9天后观察到培养基菌丝生已长满整个培养皿，链格孢属CBSX2和互隔交链孢ATCC 66981菌株整体呈现出黑色，外圈稍有些白色，中心处菌丝生长茂盛。
将100μL培养好的孢子液接种至50g灭菌黄桃的三角瓶中，接种第1周，每天振荡三角瓶1次，使孢子液与培养基充分接触。黑暗中培养28天后观察到三角瓶中长有黑色的菌丝。
(6)样品测定
AOH、AME、TeA、TEN提取方法：将PDA培养基和黄桃于50℃烘箱干燥，粉碎混匀后，准确称取2g粉碎样品于50mL离心管，加入10mL乙腈/水(84/16，v/v)，旋涡震荡1min，浸泡5min后，超声提取1小时。4000r/min离心10min后，取5mL上清液，在40℃下氮气吹干，1mL的5mmol/L乙酸铵水溶液/甲醇(80:20，v:v)溶解残渣，涡旋30s，超声1min，涡旋30s，充分溶解后，适量稀释，过0.22μm滤膜，UPLC-MS/MS测定。
超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测条件
AOH、AME、TeA、TEN色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(100mm×3.0mm，2.7mm)；流动相A为5mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5mim，10％A；3min，70％A；5min，90％A；6min，90％；6.1min，10％A；8min，10％A；流速0.4mL/min；进样量3μL；柱温40℃。
AOH、AME、TeA、TEN的具体质谱参数如下标1所示：
表1AOH、AME、TeA、TEN的质谱参数
Figure BDA0003336556850000051
(7)方法学验证
通过考察线性、检出限(limit of detection，LOD)和定量限(limit ofquantitation，LOQ)、回收率和精密度来评价所建立PDA和黄桃培养基中AOH、AME、TeA、TEN分析方法的灵敏度、准确性和重复性。用空白基质溶液稀释标准工作液得到1、2、5、10、20、50、100和200μg/L浓度的基质标准溶液，以毒素浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，建立AOH、AME、TeA、TEN的基质标准曲线并用于样品浓度测定。以定性离子通道的3倍信噪比(signal-to-noise ratio，S/N)确定目标毒素的LOD、定量离子通道的10倍信噪比确定目标毒素的LOQ。采用加标回收试验法考察回收率和精密度，选取空白PDA和黄桃培养基样品分别按照添加浓度5、50和100μg/kg加入适量的标准工作液，每个浓度选取5个平行样。回收率为测定值和理论值的百分比，日内精密度和日间精密度分别为同一天和连续5天测定结果的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。
实验结果显示PDA和黄桃培养基中AOH、AME、TeA、TEN在各自范围内线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.990。PDA中AOH的定量限为2μg/kg，检出限为0.6μg/kg；黄桃中AOH的定量限为0.28μg/kg，检出限为0.11μg/kg。加标回收试验结果表明，PDA中AOH回收率范围为74.6％～93.7％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为3.6％～9.2％(n＝5)；黄桃中AOH的回收率范围为85.1％～101.2％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为1.9％～9.7％(n＝5)。
PDA中AME的定量限为2μg/kg，检出限为1μg/kg；黄桃中AME的定量限为0.18μg/kg，检出限为0.07μg/kg。加标回收试验结果表明，PDA中AME回收率范围为83.1％～106.7％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为2.7％～11.2％(n＝5)；黄桃中AME的回收率范围为88.7％～106.1％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为3.3％～6.0％(n＝5)。
PDA中TeA的定量限为5μg/kg，检出限为2μg/kg；黄桃中TeA的定量限为0.2μg/kg，检出限为0.07μg/kg。加标回收试验结果表明，PDA中TeA回收率范围为76.2％～88.5％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为1.5％～6.7％(n＝5)；黄桃中TeA的回收率范围为76.6％～102.0％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为0.7％～11.2％(n＝5)。
PDA中TEN的定量限为0.1μg/kg，检出限为0.02μg/kg；黄桃中TEN的定量限为0.05μg/kg，检出限为0.02μg/kg。加标回收试验结果表明，PDA中TEN回收率范围为75.1％～101.7％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为2.8％～13.7％(n＝5)；黄桃中TEN的回收率范围为89.2％～100.8％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为0.7％～1.6％(n＝5)。
以上数据表明，采用的分析方法灵敏、准确、可靠，满足PDA培养基和黄桃中AOH、AME、TeA、TEN的准确定量，可以采用该方法对精氨酸对PDA培养基和黄桃中AOH、AME、TeA、TEN生物合成的抑制作用进行研究。
实施例1
PDA培养基中精氨酸对AOH、AME、TeA、TEN合成的抑制作用
量取适量精氨酸溶于10mL无菌超纯水，过滤除菌后加入90mL灭菌后的PDA培养基，使得最终添加浓度分别达到0、0.1、1、50和100mmol/L。混匀倒板后，接种100μL的菌种孢子液，于28℃恒温恒湿培养箱黑暗培养培养9天，采用上述UHPLC-MS/MS技术检测AOH、AME、TeA、TEN的产量。每个浓度设置平行5份。
结果表明(图1)，与对照组相比(精氨酸浓度0mmol/L)，当精氨酸的浓度达到1mmol/L及以上时，对TeA的生物合成有明显的抑制效果(P<0.01)，抑制率达到97.1％；当精氨酸的浓度不低于50mmol/L时，即可有效抑制AME的生物合成(P<0.05)，产量下降66.7％，抑制效果随着精氨酸浓度的升高而增强；当精氨酸浓度达到50mmol/L时，AOH、TEN的生物合成量明显减少(P<0.05)；当精氨酸浓度达到100mmol/L时几乎完全抑制AOH、AME、TeA、TEN的产生。
实施例2
黄桃中精氨酸对AOH、AME、TeA、TEN合成的抑制作用
量取适量精氨酸溶于无菌超纯水，分别配制浓度分别为10mmol/L、100mmol/L、200mmol/L和500mmol/L的精氨酸溶液，过滤除菌。准确称取50g黄桃于250mL无菌锥形瓶中，120℃高压灭菌30min后分别加入不同浓度的20mL精氨酸溶液，对照组加入20mL无菌超纯水。用无菌透气封口膜密封锥形瓶，摇匀后加入100μL各菌种孢子液于28℃恒温恒湿培养箱黑暗培养培养28天，检测AOH、AME、TeA、TEN的产量。每个浓度设置平行5份。
结果显示(图2)，与对照组相比，当精氨酸的浓度达到10mmol/L以上时，对AOH、AME的生物合成有明显的抑制效果(P<0.01)，抑制率分别达到83.4％和85.9％；当精氨酸的浓度为100mmol/L时即可显著抑制TeA、TEN的合成(P<0.01)，TeA、TEN产量分别下降79.7％和95.0％；当精氨酸的浓度达到500mmol/L基本可完全抑制AOH、AME、TeA和TEN的产生。

Claims (4)

1.精氨酸作为链格孢毒素生物合成抑制剂的应用，其特征在于精氨酸使用时配制成浓度为1mmol/L及以上浓度的水溶液。
2.根据权利要求1所述的精氨酸作为链格孢毒素生物合成抑制剂的应用，其中精氨酸水溶液浓度为1-1000mmol/L。
3.根据权利要求1所述的精氨酸作为链格孢毒素生物合成抑制剂的应用，其中精氨酸水溶液浓度为10-500mmol/L。
4.根据权利要求1所述的精氨酸作为链格孢毒素生物合成抑制剂的应用，其中精氨酸水溶液用于瓜果蔬菜作为链格孢毒素合成抑制剂时，精氨酸水溶液浓度为50-500mmol/L。
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