CN113854292B - 精氨酸和蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成抑制剂的联合应用 - Google Patents
精氨酸和蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成抑制剂的联合应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了精氨酸和蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成抑制剂的联合应用,精氨酸和蘑菇醇水溶液的浓度为2.5mmol/L及以上。本发明中的精氨酸为氨基酸类化合物,成本低,具有调节血糖,保护肝脏,延缓衰老的功能;蘑菇醇为食用香精,在我国来源广,成本低,对人体无害,具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气。精氨酸和蘑菇醇联合作用后,与单一物质相比,不仅可以显著提高抑制效果、减少活性成分用量,还能够有效降低真菌的耐药性,可以显著抑制PDA、玉米、小麦等不同培养基中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的生物合成,效果好,安全无毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体的说涉及精氨酸和蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成抑制剂的联合应用。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),又名呕吐毒素,主要由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)产生的单端孢霉烯族类毒素(图1),广泛存在于小麦、玉米等粮食作物中,具有很高的细胞毒性、免疫抑制毒性等,会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状,严重时损害造血系统造成死亡。
DON已成为中国小麦增产和质量安全的主要威胁,中国长江流域、黄淮流域等重要冬麦区流行年份受害小麦面积约700万hm2。2017年,我国部分地区饲料及饲料原料,发现脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出率高达98.3%。2019年,我国6省的360份市售谷类辅食样品中有217份检出DON,平均含量116.3μg/kg,最大值为1198.7μg/kg。众多研究结果表明粮食、饲料、食品中均普遍存在DON污染,对我国农业和人民造成了巨大的经济损失和健康威胁。
为防控DON污染,减少财产损失,保障人民健康和生命安全,开发能够高效抑制DON产生、安全、无毒的抑菌剂具有非常重要的意义。目前,已经发现阿魏酸、早熟素和胡椒酮等化合物具有抑制DON生物合成作用效果,但研究相对较少,且主要为单一化学成分,容易使真菌产生耐药性。
因此,需要研究开发更为安全有效的针对DON的抑制剂。
发明内容
本发明公开了精氨酸和蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成抑制剂的联合应用,其中精氨酸和蘑菇醇的摩尔质量比为1:10~10:1;优选的精氨酸和蘑菇醇的摩尔质量比为1:1;
其中,精氨酸和蘑菇醇联合应用时,精氨酸和蘑菇醇的浓度均不低于2.5mmol/L;精氨酸和蘑菇醇在水溶液中的浓度越高,对DON的抑制效果越好;
优选的精氨酸和蘑菇醇的浓度分别为2.5~1000mmol/L;
进一步优选的,用于农产品如小麦、玉米、花生、燕麦、黑麦等作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇生成抑制剂时,优选的精氨酸和蘑菇醇在水溶液中的浓度分别为50~1000mmol/L。
精氨酸和蘑菇醇联合应用时,可以一起配制成精氨酸蘑菇醇水溶液;也可以分别配制成精氨酸水溶液和蘑菇醇水溶液,使用时两种溶液一起使用。
精氨酸和蘑菇醇联合应用作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇生成抑制剂时,可以将精氨酸蘑菇醇水溶液(或者精氨酸水溶液与蘑菇醇水溶液一起)直接喷洒到农产品表面、或者直接加入基质等。
本发明中公开的精氨酸和蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成抑制剂的联合应用中,精氨酸为氨基酸类化合物,成本低,具有调节血糖,保护肝脏,延缓衰老的功能;蘑菇醇为食用香精,在我国来源广,成本低,对人体无害,具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气。精氨酸和蘑菇醇联合作用后,与单一物质相比,不仅可以显著提高抑制效果、明显降低活性成分用量,还能够有效降低真菌的耐药性,可以显著抑制PDA、玉米、小麦等不同培养基中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的生物合成,效果好,安全无毒副作用。
附图说明
图1不同浓度精氨酸和蘑菇醇联合应用对PDA培养基中DON生成的影响
图2不同浓度精氨酸和蘑菇醇联合应用对小麦培养基中DON生成的影响
图3不同浓度精氨酸和蘑菇醇联合应用对玉米培养基中DON生成的影响
具体实施方式
下列实施例中所用的实验材料、实验方法及方法验证。
一、实验方法
(1)试剂
葡萄糖、琼脂(上海源叶生物科技有限公司);乙腈、甲醇、乙酸铵(美国Merck公司);精氨酸、蘑菇醇(上海国药集团化学试剂有限公司);DON标准品(纯度大于99%,美国Romer公司)。
(2)仪器
超高效液相色谱仪(美国Waters公司);TRIPLE QUADTM 5500三重四级杆质谱仪(美国AB SCIEX公司);HSC-24B氮吹仪(上海楚定分析仪器有限公司);Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司);AL104分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司);SK8210LHC超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司);BJ-800A食品粉碎机(杭州德清拜杰电器有限公司);SX-500高压灭菌锅(日本TOMY公司);MGC-300H人工气候箱(上海一恒科学仪器有限公司);GZX-CF101-2-BS电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司);Heraeus MultifugeX3高速离心机(美国Thermo Fisher scientific公司)
(3)菌株培养基
PDA培养基:去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液,加入葡萄糖20g、琼脂16g,用蒸馏水定容至1000mL,115℃高压灭菌30分钟,降温到55℃左右倒平板,每平板20mL。
PDB液体培养基:去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液,加入葡萄糖20g,用蒸馏水定容至1000mL,115℃高压灭菌30分钟。
玉米培养基:称取50g优质玉米至250mL三角瓶,加入20mL蒸馏水混匀,用透气封口膜密封瓶口,浸泡过夜,高压灭菌(121℃,30min),冷却后将玉米摇散待用。
小麦培养基:称取50g优质小麦至250mL三角瓶,加入20mL蒸馏水混匀,用透气封口膜密封瓶口,浸泡过夜,高压灭菌(121℃,30min),冷却后将小麦摇散待用。
(4)产毒菌株活化
将禾谷镰刀菌菌株F4582(购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ)接种于PDA培养基,28℃黑暗培养7天后,接种至PDB液体培养基中,25℃下150r/min震荡继续培养5天。取孢子液,显微镜观察孢子浓度,用无菌水调整至105个/mL,用于后续接种。
(5)菌株接种和培养
将100μL培养好的孢子液接种至PDA培养基,黑暗中培养9天后观察到培养基菌丝生已长满整个培养皿,整体呈现出黄色,中间稍有些砖红色,中心的老菌丝有些塌陷,边缘的菌丝紧贴在培养皿上。
将100μL培养好的孢子液接种至小麦和玉米培养基中,接种第1周,每天振荡三角瓶1次,使孢子液与培养基充分接触。黑暗中培养28天后观察到三角瓶中长有黄色和白色的菌丝。
(6)样品测定
提取和检测方法参考了GB5009.111。
DON提取方法:将PDA培养基、小麦和玉米于50℃烘箱干燥,粉碎混匀后,准确称取2g粉碎样品于50mL离心管,加入10mL乙腈/水(84/16,v/v),旋涡震荡1min,浸泡5min后,超声提取1小时。4000r/min离心10min后,取5mL上清液,在40℃下氮气吹干,1mL的5mmol/L乙酸铵水溶液/甲醇(80:20,v:v)溶解残渣,涡旋30s,超声1min,涡旋30s,充分溶解后,适量稀释,过0.22μm滤膜,UPLC-MS/MS测定。
超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测条件
色谱柱:Agilent Poroshell 120EC-C18色谱柱(100mm×3.0mm,2.7mm);流动相:A为5mmol/L乙酸铵溶液,B为甲醇;梯度洗脱程序:0~0.5mim,10%A;4min,90%A;4.5min,90%A;4.7min,10%A;6min,10%A;流速0.4mL/min;进样量3μL;柱温40℃。
采用电喷雾电离源(ESI)正离子模式扫描;雾化气、辅助气均为高纯空气,碰撞气为高纯氮气;雾化气:50Psi;辅助气:50Psi;雾化温度:500.0℃;喷雾电压:5500V;喷雾电压气帘气:35Psi;碰撞气:8Psi:通过多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式对目标化合物准确定量。DON母离子(m/z)为297.3,定量子离子(m/z)为203.0,碰撞电压为38eV,定性子离子(m/z)为175.1,碰撞电压为28eV。
二、方法学验证
通过考察线性、检出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit ofquantitation,LOQ)、回收率和精密度来评价所建立PDA、小麦和玉米培养基中DON分析方法的灵敏度、准确性和重复性。用空白基质溶液稀释标准工作液得到浓度为1、2、5、10、20、50、100和200μg/L的基质标准溶液,以毒素浓度为横坐标、峰面积为纵坐标,建立DON的基质标准曲线并用于样品浓度测定。以定性离子通道的3倍信噪比(signal-to-noise ratio,S/N)确定目标毒素的LOD;以定量离子通道的10倍信噪比确定目标毒素的LOQ。采用加标回收试验法考察回收率和精密度:选取空白PDA、小麦和玉米培养基样品分别按照添加浓度5、50和100μg/kg加入适量的标准工作液,每个浓度选取5个平行样。回收率为测定值和理论值的百分比,日内精密度和日间精密度分别为同1天和连续5天测定结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。
实验结果显示PDA培养基、小麦和玉米中DON在各自范围内线性关系良好,相关系数(R2)均大于0.990。PDA中DON的定量限为1μg/kg,检出限为0.4μg/kg;小麦中DON的定量限为2μg/kg,检出限为1μg/kg;玉米中DON的定量限为5μg/kg,检出限为2μg/kg。加标回收试验结果表明,PDA中DON回收率范围为88.7%~102.9%(n=5),精密度(RSD%)范围为5.6%~11.5%(n=5);小麦中DON的回收率范围为82.3%~98.3%(n=5),精密度(RSD%)范围为6.9%~11.0%(n=5);玉米中DON的回收率范围为84.6%~101.4%(n=5),精密度(RSD%)范围为5.6%~11.5%(n=5)。以上数据表明,采用的分析方法灵敏、准确、可靠,满足PDA、小麦和玉米籽粒等不同基质中DON的准确定量。
实施例1
PDA培养基中精氨酸和蘑菇醇对DON生物合成的联合抑制作用
量取适量精氨酸和蘑菇醇同时溶于10mL无菌超纯水,过滤除菌后加入90mL灭菌后的PDA培养基,使得最终精氨酸和蘑菇醇的添加浓度分别达到0、1、2.5、5和10mmol/L。对照组采用单一精氨酸或蘑菇醇,浓度分别为0、5、10、20和50mmol/L。平行5份。接种100μL禾谷镰刀菌F4582孢子液,于28℃黑暗培养9天,UHPLC-MS/MS检测DON的产量。
结果表明(图1),当精氨酸和蘑菇醇的浓度不低于2.5mmol/L时即可有效抑制DON的生物合成(P<0.05),抑制效果随着精氨酸和蘑菇醇浓度的升高而增强,当精氨酸和蘑菇醇浓度达到10mmol/L时几乎完全抑制DON的产生。与单独的精氨酸和蘑菇醇相比(50mmol/L时才能完全抑制DON的产生),两种物质对于PDA中DON的生物合成具有明显的联合抑制作用。
实施例2
小麦中精氨酸和蘑菇醇对DON合成的联合抑制作用
量取适量精氨酸和蘑菇醇同时溶于无菌超纯水,配制成精氨酸和蘑菇醇浓度分别为0、5和50mmol/L的精氨酸和蘑菇醇混合溶液,过滤除菌。准确称取50g小麦于250mL无菌锥形瓶中,120℃高压灭菌30分钟后分别加入不同浓度的20mL精氨酸和蘑菇醇溶液。对照组采用单一精氨酸或蘑菇醇,浓度分别为0、10和100mmol/L。用无菌透气封口膜密封锥形瓶,摇匀后加入100μL禾谷镰刀菌F4582孢子液于28℃黑暗培养28天,检测DON的产量。平行5份。
结果显示(图2),当精氨酸和蘑菇醇的浓度为(50mmol/L)时即可显著抑制DON的合成(P<0.05)。与单独的精氨酸、蘑菇醇相比(单独的精氨酸、蘑菇醇在100mmol/L时对DON无明显的抑制效果),两种物质对小麦中DON的生物合成具有明显的联合抑制作用。
实施例3
玉米中精氨酸和蘑菇醇对DON生物合成的抑制作用
量取适量精氨酸和蘑菇醇同时溶于无菌超纯水,配制成精氨酸和蘑菇醇浓度分别为0、5和50mmol/L的精氨酸和蘑菇醇混合溶液,过滤除菌。准确称取50g玉米于250mL无菌锥形瓶中,120℃高压灭菌30分钟后分别加入不同浓度的混合液。对照组采用单一精氨酸或蘑菇醇,浓度分别为0、10和100mmol/L。用无菌透气封口膜密封锥形瓶,摇匀后加入100μL禾谷镰刀菌F4582孢子液于28℃黑暗培养28天,检测DON的产量。平行5份。
结果显示(图3),当混合液中精氨酸和蘑菇醇的浓度达到50mmol/L时即可显著抑制DON的合成(P<0.05)。与单独的精氨酸、蘑菇醇相比(单独的精氨酸、蘑菇醇在100mmol/L时对玉米中DON的生物合成无明显的抑制效果),两种物质对玉米中DON的生物合成具有明显的联合抑制作用。
Claims (3)
1.精氨酸和蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成抑制剂的联合应用,其特征在于其中精氨酸和蘑菇醇的摩尔质量比为1:1,精氨酸和蘑菇醇的浓度分别为5~1000mmol/L。
2.根据权利要求1所述的精氨酸和蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成抑制剂的联合应用,其中精氨酸和蘑菇醇的浓度分别为50~1000mmol/L。
3.根据权利要求1或2任一项所述的精氨酸和蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成抑制剂的联合应用,其中精氨酸和蘑菇醇联合应用时,一起配制成精氨酸蘑菇醇水溶液;或者分别配制成精氨酸水溶液和蘑菇醇水溶液,使用时两种溶液一起使用。
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