CN113875754B - 蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途，蘑菇醇使用时配制成浓度为10mmol/L及以上浓度的水溶液。本发明中所用的蘑菇醇为食用香精，在我国来源广，成本低，对人体无害，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气。蘑菇醇可以有效抑制PDA、玉米、小麦等不同培养基中三种镰刀菌毒素的生物合成，效果好，安全无毒副作用。

Description

蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途。
研究背景
镰刀菌毒素是镰刀菌属真菌产生的多种有毒次生代谢产物，主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、伏马毒素B1(FB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等。DON，又名呕吐毒素，主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)产生，广泛存在于小麦，玉米等粮食作物中，具有很高的细胞毒性、免疫抑制毒性,会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。FB1是由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)在一定温度和湿度条件下产生的有毒次级代谢产物，主要污染玉米、大米、小麦等谷物及其制品。FB1具有较强的神经毒性、肺毒性、肝脏毒性、肾脏毒性和免疫毒性等，还可能诱发食道癌、肝癌、胃癌等疾病，严重威胁人畜健康，国际上把FB1作为2B级致癌物。ZEN又称为F-2毒素，由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、雪腐镰刀菌(Fusariumnivale)等产生，主要存在于玉米、小麦、高粱、大米等谷物中。ZEN具有细胞毒性、生殖毒性和致畸性，可以对肝脏和肾脏造成损伤；同时ZEN可以破坏免疫系统，严重时可诱导产生肿瘤。
DON、FB1和ZEN已成为中国粮食增产和质量安全的重要威胁，在粮食、饲料、食品中镰刀菌毒素污染较普遍，且三种镰刀菌在不同农产品中往往同时存在，对我国农业和人民造成了巨大的经济损失和健康威胁。鉴于镰刀菌毒素的强烈毒性和广泛分布性，国内外已经制定了不同农产品、食品和饲料中镰刀菌毒素的限量标准。
为更好的防控镰刀菌毒素污染，减少财产损失，保障人民健康和生命安全，开发能够高效抑制镰刀菌毒素产生、安全、无毒的抑制剂具有非常重要的经济价值和社会意义。
Figure BDA0003336558300000021
发明内容
本发明提供了蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途；
具体的说，蘑菇醇使用时可配制成浓度为10mmol/L及以上浓度的水溶液；蘑菇醇水溶液的浓度越高，其对镰刀菌毒素的生物合成抑制效果就越好；优选的蘑菇醇水溶液的浓度为10-500mmol/L；
进一步优选的，蘑菇醇水溶液用于农产品如小麦、玉米等作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇生成抑制剂时，优选的蘑菇醇水溶液浓度为200-500mmol/L；
蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇生成抑制剂时，可以将蘑菇醇水溶液直接喷洒到农产品表面、或者直接加入基质等。
本发明提供的蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途，使用的蘑菇醇为食用香精，在我国来源广，成本低，对人体无害，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气。蘑菇醇可以有效抑制PDA培养基以及玉米、小麦等农产品中三种镰刀菌毒素的生物合成，抑制效果好，安全无毒副作用。使用过程简单，普通人员简单培训即可使用，有益于大规模推广。
附图说明
图1不同浓度蘑菇醇对PDA培养基中DON、FB1、ZEN生物合成的抑制作用
图2不同浓度蘑菇醇对小麦中DON、FB1、ZEN生物合成的抑制作用
图3不同浓度蘑菇醇对玉米中DON、FB1、ZEN生物合出的抑制作用
具体实施方式
下列实施例中需要用到的实验材料、实验方法及其验证
(1)试剂
葡萄糖、琼脂(上海源叶生物科技有限公司)；乙腈、甲醇、乙酸铵(美国Merck公司)；蘑菇醇(上海国药集团化学试剂有限公司)；DON标准品、FB1标准品、ZEN标准品(纯度大于99％,美国Romer公司)。
(2)仪器
超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；TRIPLE QUADTM 5500三重四级杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)；HSC-24B氮吹仪(上海楚定分析仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；AL104分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；SK8210LHC超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)；BJ-800A食品粉碎机(杭州德清拜杰电器有限公司)；SX-500高压灭菌锅(日本TOMY公司)；MGC-300H人工气候箱(上海一恒科学仪器有限公司)；GZX-CF101-2-BS电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；Heraeus MultifugeX3高速离心机(美国Thermo Fisher scientific公司)
(3)菌株培养基
PDA培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g、琼脂16g，用蒸馏水定容至1000mL，115℃高压灭菌30分钟，降温到55℃左右倒平板，每平板20mL。
PDB液体培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1000mL，115℃高压灭菌30分钟。
玉米培养基：称取50g优质玉米至250mL三角瓶，加入20mL蒸馏水混匀，用透气封口膜密封瓶口，浸泡过夜，高压灭菌(121℃，30min)，冷却后将玉米摇散待用。
小麦培养基：称取50g优质小麦至250mL三角瓶，加入20mL蒸馏水混匀，用透气封口膜密封瓶口，浸泡过夜，高压灭菌(121℃，30min)，冷却后将小麦摇散待用。
(4)产毒菌株活化
将禾谷镰刀菌菌株F4582(购至德国微生物菌种保藏中心DSMZ)，串珠镰刀菌3.6924(购至中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc)，禾谷镰刀菌F1096(购至德国微生物菌种保藏中心DSMZ)接种于PDA固体培养基，28℃黑暗培养7天后，接种至PDB液体培养基中，25℃下150r/min震荡继续培养5天。取孢子液，显微镜观察孢子浓度，用无菌水调整至105个/mL，用于后续接种。
(5)菌株接种
将100μL孢子液接种至PDA培养基，黑暗中培养9天后观察到培养基菌丝生已长满整个培养皿。禾谷镰刀菌菌株F4582整体呈现出黄色，中间稍有些砖红色，中心的老菌丝有塌陷，边缘的菌丝紧贴在培养皿上；串珠镰刀菌3.6924整体呈现出透明状，中间稍有些白色；禾谷镰刀菌F1096整体呈现出白色，中心处菌丝生长茂盛。
将100μL培养好的孢子液接种至小麦和玉米培养中，接种第1周，每天振荡三角瓶1次，使孢子液与培养基充分接触。黑暗中培养28天后观察到三角瓶中长有黄色和白色的菌丝。
(6)样品前处理
DON、ZEN：将PDA、小麦和玉米培养基于50℃烘箱干燥，粉碎混匀后，准确称取2g粉碎样品于50mL离心管，加入10mL乙腈/水(84/16，v/v)，旋涡震荡1min，浸泡5min后，超声提取1小时。4000r/min离心10min后，取5mL上清液，在40℃下氮气吹干，加入1mL的5mmol/L乙酸铵水溶液/甲醇(80:20，v:v)，涡旋30s，超声1min，涡旋30s，充分溶解后，适量稀释，过0.22μm滤膜。
FB1：将PDA、小麦和玉米培养基于50℃烘箱干燥，粉碎混匀后，准确称取2g粉碎样品于50mL离心管，加入10mL乙腈/水(50/50，v/v)，旋涡震荡1min，浸泡5min后，超声提取1小时。4000r/min离心10min后，取5mL上清液，在40℃下氮气吹干，1mL的乙腈/水(50/50，v/v)溶解残渣，涡旋30s，超声1min，涡旋30s，充分溶解后，适量稀释，过0.22μm滤膜。
(7)超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测条件
DON检测：色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18色谱柱(100mm×3.0mm，2.7mm)；流动相：流动相A为5mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5mim，10％A；4min，90％A；4.5min，90％A；4.7min，10％A；6min，10％A；流速0.4mL/min；进样量3μL；柱温40℃。
FB1、ZEN检测：色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18色谱柱(100mm×3.0mm，2.7mm)；流动相：FB1流动相A为0.1％的甲酸溶液；ZEN流动相A为5mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5mim，10％A；3min，70％A；5min，90％A；6min，90％；6.1min，10％A；8min，10％A；流速0.4mL/min；进样量3μL；柱温40℃。
DON、FB1、ZEN的具体质谱参数见表2。
表2 DON、FB1、ZEN的质谱参数
Figure BDA0003336558300000051
(8)方法学验证
通过考察线性、检出限(limit of detection，LOD)和定量限(limit ofquantitation，LOQ)、回收率和精密度来评价所建立PDA、小麦和玉米培养基中DON、FB1、ZEN分析方法的灵敏度、准确性和重复性。用空白基质溶液稀释标准工作液得到浓度为1、2、5、10、20、50、100和200μg/L的基质标准溶液，以毒素浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，建立DON、FB1、ZEN的基质标准曲线并用于样品测定。以定性离子通道的3倍信噪比(signal-to-noise ratio，S/N)确定目标毒素的LOD、定量离子通道的10倍信噪比确定目标毒素的LOQ。采用加标回收试验法考察回收率和精密度，选取空白PDA、小麦和玉米培养基样品分别按照添加浓度5、50和100μg/kg加入适量的标准工作液，每个浓度选取5个平行样。回收率为测定值和理论值的百分比，日内精密度和日间精密度分别为同一天和连续5天测定结果的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。
实验结果显示PDA培养基、小麦和玉米中DON、FB1、ZEN在各自范围内线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.990。PDA中DON的定量限为1μg/kg，检出限为0.4μg/kg；小麦中DON的定量限为2μg/kg，检出限为1μg/kg；玉米中DON的定量限为5μg/kg，检出限为2μg/kg。PDA中DON回收率范围为88.7％～102.9％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为5.6％～11.5％(n＝5)；小麦中DON的回收率范围为82.3％～98.3％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为6.9％～11.0％(n＝5)；玉米中DON的回收率范围为84.6％～101.4％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为5.6％～11.5％(n＝5)。
PDA中FB1的定量限为1μg/kg，检出限为0.5μg/kg；小麦中FB1的定量限为0.5μg/kg，检出限为0.2μg/kg；玉米中FB1的定量限为5μg/kg，检出限为2μg/kg。加标回收试验结果表明，PDA中FB1回收率范围为79.2％～97.8％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为2.5％～13.6％(n＝5)；小麦中FB1的回收率范围为79.4％～110.5％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为4.3％～11.8％(n＝5)；玉米中FB1的回收率范围为83.7％～99.2％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为5.5％～11.1％(n＝5)。
ZEN在PDA、小麦和玉米中的定量限均为1μg/kg，检出限均为0.3μg/kg。PDA中ZEN回收率范围为72.8％～89.8％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为3.3％～11.3％(n＝5)；小麦中ZEN的回收率范围为93.6％～101.7％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为1.5％～12.9％(n＝5)；玉米中ZEN的回收率范围为94.7％～113.4％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为6.6％～9.4％(n＝5)。
以上数据表明，采用的分析方法灵敏、准确、可靠，可实现PDA、小麦和玉米籽粒中DON、FB1、ZEN三种镰刀菌毒素的的准确定量。
实施例1
PDA培养基中蘑菇醇对DON、FB1、ZEN合成的抑制作用
量取适量蘑菇醇溶于10mL无菌超纯水，过滤除菌后加入90mL灭菌后的PDA培养基，使得最终添加浓度分别达到0、0.1、1、10、50和100mmol/L。混匀倒板后，接种100μL各菌种孢子液，于28℃恒温恒湿培养箱黑暗培养培养9天，采用UHPLC-MS/MS技术检测DON、FB1、ZEN的产量。平行5份。
结果表明(图1)，与对照组相比(蘑菇醇浓度0mmol/L)，当蘑菇醇的浓度达到0.1mmol/L以上时，对ZEN的生物合成有明显的抑制效果(P<0.05)，抑制率达到86.1％；当蘑菇醇的浓度不低于10mmol/L时，即可有效抑制DON的生物合成(P<0.05)，产量下降89.4％，抑制效果随着蘑菇醇浓度的升高而增强；当蘑菇醇浓度达到50mmol/L时，FB1的生物合成量明显减少(P<0.05)，抑制率达83.5％；当蘑菇醇浓度达到100mmol/L时几乎完全抑制DON、FB1、ZEN的产生。
实施例2
小麦中蘑菇醇对DON、FB1、ZEN生物合成的抑制作用
量取适量蘑菇醇溶于无菌超纯水，分别配制浓度分别为1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L、200mmol/L和500mmol/L的蘑菇醇溶液，过滤除菌。准确称取50g小麦于250mL无菌锥形瓶中，120℃高压灭菌30分钟后分别加入20mL不同浓度的蘑菇醇溶液，对照组加入20mL无菌超纯水。用无菌透气封口膜密封锥形瓶，摇匀后加入100μL各菌种孢子液于28℃黑暗培养28天，检测DON、FB1、ZEN的产量。平行5份。
结果显示(图2)，与对照组相比，当蘑菇醇的浓度为(200mmol/L)时即可显著抑制DON的合成(P<0.01)，DON的产量下降88.8％；当蘑菇醇的浓度达到500mmol/L可明显抑制FB1和ZEN的产生，抑制率达93.2％和99.7％。
实施例3
玉米中蘑菇醇对DON、FB1、ZEN合成的抑制作用
量取适量蘑菇醇溶于无菌超纯水，分别配制浓度分别为1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L、200mmol/L和500mmol/L的蘑菇醇溶液，过滤除菌。准确称取50g玉米于250mL无菌锥形瓶中，120℃高压灭菌30分钟后分别加入不同浓度的20mL蘑菇醇溶液，对照组加入20mL无菌超纯水。用无菌透气封口膜密封锥形瓶，摇匀后加入100μL各菌种孢子液于28℃黑暗培养28天，检测DON、FB1、ZEN的产量。平行5份。
结果显示(图3)，与对照组相比，当蘑菇醇的浓度达到100mmol/L时即可显著抑制DON的合成(P<0.01)，DON的产量下降73.5％，抑制效果随着蘑菇醇浓度的升高而增强，当蘑菇醇浓度达到200mmol/L时，DON的产量下降95.7％；当蘑菇醇浓度达到500mmol/L时，可完全抑制FB1、ZEN的产生，产量分别下降99.1％和99.5％。

Claims (1)

1.蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途，其特征在于，
所述三种镰刀菌毒素分别为脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮；
其中当镰刀菌毒素为脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，蘑菇醇使用时配制成浓度为200-500mmol/L的水溶液；
当镰刀菌毒素为伏马毒素B1或玉米赤霉烯酮时，蘑菇醇使用时配制成浓度为500mmol/L的水溶液。
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