CN113755364B - 产多杀菌素的放线菌及其在制备杀虫剂中的应用 - Google Patents

产多杀菌素的放线菌及其在制备杀虫剂中的应用 Download PDF

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种产多杀菌素的放线菌及其在制备杀虫剂中的应用，放线菌(Saccharopolysporasp.)WS‑25310的保藏编号为CCTCC NO：M 2020810。该放线菌WS‑25310经发酵的得到发酵液对农林害虫都有防效，尤其，放线菌WS‑25310发酵液对小菜蛾药后48h防效大于95％以上。

Description

产多杀菌素的放线菌及其在制备杀虫剂中的应用
技术领域
本发明涉及微生物杀虫剂领域，具体涉及一种产多杀菌素的放线菌及其在制备杀虫剂中的应用。
背景技术
多杀菌素(Spinosad)是由刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)经次级代谢产生的一种大环内酯类生物杀虫剂，其主要活性成分为A(spinosyn A)和D(spinosyn D)，分别约占85％和15％。多杀菌素杀虫谱广，对人、非靶标动物和环境极为安全，可生物降解，并且用药量少，持效期长，当浓度为1mg/L时能保护谷物至少4个月。多杀菌素可用于防治蔬菜、水果等农作物害虫，2016年多杀菌素单一品种全球销售额达到3.12亿美元，且被美国农药企业垄断。近几年来，生物农药产量每年以10％-20％的速度递增，销售额增长迅速，多杀菌素作为高效、环境友好型的生物农药具有广阔的市场前景。我国是农业大国，需要大量杀虫剂，年销售额达200多亿人民币。目前，该产品为美国陶氏益农公司独家生产，国内多杀菌素的研究还处于实验室阶段。
国外公司和学术界对多杀菌素的研究已经超过了30年，这段时间他们克服困难开发出了很多新的技术和手段来提高多杀菌素的产量，而我国在这方面的研究与他们还有显著的差距，至今还没有开发出一个具有显著竞争力的工业菌株和配套的生产工艺。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种产多杀菌素的放线菌及其在制备杀虫剂中的应用。
为实现上述目的，本发明所设计一种产多杀菌素的放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020810。
上述放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310已于2020年11月30日保藏于中国、武汉、武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏登记号为CCTCC NO：M2020810。
放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310的形态学特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析的结果，将其鉴定为刺糖多孢菌属WS-25310。具体鉴定结果如下：
(1)菌体的形态特征
放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310在ISP2培养基上生长良好，菌落为白色，背面颜色为浅红褐色,孢子链螺旋状，孢子椭球型。
(2)16SrDNA序列分析
经测序得放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310的16S rRNA基因序列，将所得序列与NCBI数据库进行BLAST。所得其结果与SaccharopolysporaphatthalungensisNRRLB-24798，Saccharopolysporahattusasensis CR3506，SaccharopolysporaspinosaNRRL18395的相似度分别为98.3％，98.8％，98.9％。
(3)菌株的生理生化特性：
放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310可以利用D-纤维二塘、L-天冬氨酸、蔗糖、L-焦谷氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、水苏糖、蜜三糖,棉子糖、α-D-乳糖、D-葡糖酸、β-甲酰-D-葡糖苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、糖质酸、奎宁酸、D-乳酸甲酯、糖质酸、肌苷、乳酸钠、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、D-天冬氨酸、L-苹果酸、亚硝酸钾、乙酰乙酸、乙酸、氨曲南。
本发明还提供了一种权利要求1所述放线菌WS-25310在制备防治农林害虫的杀虫剂中的应用。
进一步地，所述农林害虫为小菜蛾、草地贪夜蛾、棉铃虫、枸杞蓟马和梨木虱中的任意一种。
再进一步地，所述农林害虫为小菜蛾。
本发明还提供了一种防治小菜蛾的杀虫剂，所述杀虫剂中包含上述放线菌WS-25310发酵得到的菌液。
本发明的有益效果：
本发明筛选得到放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310，该放线菌WS-25310经发酵的得到发酵液对农林害虫(如小菜蛾、草地贪夜蛾、棉铃虫、枸杞蓟马和梨木虱)防效，尤其，放线菌WS-25310发酵液对小菜蛾药后48h防效大于95％以上。
附图说明
图1为菌株WS-25310菌丝及孢子(1000X)的显微图；
图2为菌株WS-25310(ISP2)正面平板
图3为菌株WS-25310(ISP2)反面平板；
图4为菌株WS-25310基于16SrRNA基因序列比对结果以ThermomonosporaalbaJCM3077(AF002260.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树；
图5为WS-25310基因组圈图；
图6为0.5mg/L,0.25mg/L,0.125mg/L,0.0625mg/L,0.03125mg/L浓度标准品峰面积图；
图7为0.03125mg/L浓度标准品UPLC-MS峰面积图；
图8为0.03125mg/L浓度标准品t＝5.538处质谱图(M/Z＝732Spinosad A)；
图9为0.03125mg/L浓度标准品t＝5.799处质谱图(M/Z＝746Spinosad D)；
图10为标准品紫外吸收峰图；
图11为标准品多杀菌素A浓度与峰面积的关系图；
图12为标准品多杀菌素D浓度与峰面积的关系图；
图13为WS-25310菌株提取样品UPLC-MS图谱及其多杀菌素代谢产物峰面积；
图14为WS-25310菌株样品多杀菌素A的MS图(M/Z＝732)；
图15为WS-25310菌株样品多杀菌素A的MS图(M/Z＝732，t＝5.499，5.47)；
图16为WS-25310菌株样品多杀菌素D的MS图(M/Z＝746，t＝5.771)；
图17为WS-25310菌株样品多杀菌素D的MS图(M/Z＝746，t＝5.816，5.771)；
图18为人工饲料法测定不同菌株发酵液对小菜蛾的杀虫活性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310的分离和筛选
放线菌(Saccharopolyspora sp.)WS-25310采集自中国湖北省武汉市磨山山坡杂树林根际土，采用土壤放线菌培养基分离纯化获得。
实施例2放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310的菌种鉴定
(1)菌体的形态特征
放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310在ISP2培养基上生长良好，菌落为白色，背面颜色为浅红褐色,孢子链螺旋状，孢子椭球型(图1～3)。
(2)16SrRNA序列分析
经测序得放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310的16S rRNA基因序列(如SEQID NO：1)，将所得序列与NCBI数据库进行BLAST。所得其结果与SaccharopolysporaphatthalungensisNRRL B-24798，Saccharopolysporahattusasensis CR3506，Saccharopolysporaspinosa NRRL18395的相似度分别为98.3％，98.8％，98.9％(见表1和图4)。
表1菌株WS-25310 16S rRNA基因测序BLAST结果
Figure BDA0003204138670000051
(3)放线菌(Saccharopolyspora sp.)WS-25310的基因组
多杀菌素菌株WS-25310全基因组测序，并获得了其全基因组序列。通过制备WS-25310的DNA，采用3代测序，获得WS-25310全基因组，其全长为7，789，343bp，结果见图5。
放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310已于2020年11月30日保藏于中国、武汉、武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏登记号为CCTCC NO：M 2020810。
(4)菌株的生理生化特性：
放线菌(Saccharopolysporasp.)WS-25310可以利用D-纤维二塘、L-天冬氨酸、蔗糖、L-焦谷氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、水苏糖、蜜三糖,棉子糖、α-D-乳糖、D-葡糖酸、β-甲酰-D-葡糖苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、糖质酸、奎宁酸、D-乳酸甲酯、糖质酸、肌苷、乳酸钠、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、D-天冬氨酸、L-苹果酸、亚硝酸钾、乙酰乙酸、乙酸、氨曲南(表2)。
表2菌株WS-25310生理生化特性-碳源利用
Figure BDA0003204138670000061
Figure BDA0003204138670000071
实施例3多杀菌素的标准曲线构建
1.材料与方法
1.1试验材料：
多杀菌素标准品Spinosad(A and D)购买自A2S公司，96.6±1％。
1.2试验方法：
准确争取一定量的多杀菌素标准品，采用色谱甲醇依次稀释配成0.5mg/L,0.25mg/L,0.125mg/L,0.0625mg/L,0.03125mg/L,0.015625mg/L。
1.3样品液质联用分析
参照万中义等(2019，2020)，张亚妮等(2018)，吴兆圆等(2018)色谱条件：
采用UPLC-MS仪：Waters Xevo TQD UPLC-MS(Waters Corporation,U.S.A.)；
色谱柱waters
Figure BDA0003204138670000081
EH C18 column(2.1i.d.×100mm,1.7μm,Ireland)；
样品分析时间为13min；
UPLC-MS条件：电喷雾电离(ESI)，毛细管电压为3.5kV，
锥孔电压为50V，离子源温度为150℃，脱溶剂温度为450℃，
脱溶剂气体流速为1000L/h，锥孔气体流速为50L/h。
流速：0.45mL/min；梯度洗脱，进样体积为1μL。
2.结果与分析
通过UPLC-MS实验方法求出多杀菌素A浓度与峰面积的关系式为Y＝78732X+1735，R2＝0.999，Y代表峰面积，X代表浓度；多杀菌素D浓度与峰面积的关系式为Y＝30709X+162.6，R2＝0.999，Y代表峰面积，X代表浓度；同时该办法测定标注品多杀菌素A的保留时间在5.40左右，紫外吸收为245.9,分子量M/Z＝732；多杀菌素D的保留时间在t＝5.70左右，紫外吸收为245.9nm，分子量M/Z＝746，见图6-12，表3，表4。
表3多杀菌素A浓度与峰面积的关系
Figure BDA0003204138670000082
表4多杀菌素D浓度与峰面积的关系
Figure BDA0003204138670000091
实施例4不同菌株中多杀菌素的含量测定
1.材料与方法
1.1供试菌株
CGMCC4.1365；CGMCC4.1365购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京)；WS-25310为自行采集分离纯化保藏。
1.2供试培养基
Bennett’s琼脂固体培养基，其组成为：酵母提取物1g，牛肉提取物1g；NZ aminetype A酶水解干酪素2g；葡萄糖10g；琼脂15g；搅拌溶解于900mL去离子水，调节pH7.0，去离子水调至1000mL。灭菌条件为1×105Pa，121℃灭菌25min。
斜面培养基：采用国际链霉菌计划(ISP)推荐的培养基配方ISP-2。其组成为：葡萄糖4g，麦芽浸粉10g，酵母浸粉4g，琼脂15～20g，水1 000mL。灭菌条件为1×105Pa，121℃灭菌30min。
种子培养基：也称为A培养基。采用ISP-2培养基，但不加琼脂。每瓶另加1～2滴纯大豆油作消泡剂。灭菌条件为1×105Pa，121℃灭菌30min。
发酵培养基：采用A及B两种培养基，其中A培养基与种子培养基相同，B培养基组成为：甘露醇10g，葡萄糖10g、棉籽蛋白20g、酵母浸粉5g，水1 000mL。灭菌条件为1×105Pa，121℃灭菌30min。
上述摇瓶培养基装量为100mL/500mL带挡板三角瓶，培养基灭菌前pH调至7.0，灭菌条件为1×105Pa，灭菌30min，见万中义等(2019)。
1.3菌株摇瓶发酵代谢产物检测样品制备
挑选各菌株孢子堆，采用划线法接种各供试菌株，采用Ben’s平板培养，28度，培养10d后供试验，采用直径0.5cm打孔器制备菌饼；将每个500mL三角瓶(装有100mL液体培养基)中接入1个菌饼，各供试菌株28度摇瓶培养4d后，采用100mL乙酸乙酯180rpm震荡萃取1h。静置分层后，收集上清。按上述步骤连续萃取3次。上清液采用旋转蒸发仪抽真空低温浓缩至干，采用1mL甲醇洗脱。洗脱液12000rpm离心2分钟后，取上清采用UPLC-MS液质联用仪检测。
1.4色谱条件
同上。
1.5各供试菌株摇瓶发酵液中多杀菌素含量计算公示
多杀菌素A含量
Figure BDA0003204138670000101
多杀菌素D含量
Figure BDA0003204138670000102
2.结果与分析
2.1不同菌株中多杀菌素含量
经过UPLC-MS检测分析得WS-25310、CGMCC4.1365供试菌株发酵液多杀菌素A含量分别为16.98μg/mL、5.04μg/mL；多杀菌素D含量分别为4.09μg/mL、0.97μg/mL。UV(MeOH)λmax为245.9nm；ESI－MS(阳离子)，732.7、746.7[M+1]+，见表5，图13～17。
表5不同菌株中多杀菌素含量测定
Figure BDA0003204138670000103
实施例5WS-25310菌株发酵液对小菜蛾的生物活性测定
选取小菜蛾(Plutellaxylostella)3龄幼虫作为测试对象，3龄幼虫由湖北省生物农药工程研究中心提供。小菜蛾采用人工饲料表面涂布法参见张亚妮等(2018)，采用24孔板，每孔接入各菌株A培养基摇瓶发酵4d发酵液100μL，吹干后接入试虫，每孔接入10-15头幼虫，每个样品处理均采用3次重复，每个重复接种4个孔试虫，合计50-60头幼虫，设清水对照处理。在样品中接入供试幼虫，在人工气候室中培养，于药后24h、36h、48h、60h四个时间段分别检测结果。活性结果采用目测法进行，记录幼虫存活及死亡数量，当无法辨认试虫死活状态时则采用毛笔触动幼虫，以毛笔触动不动视为死亡，记录数据，采用excel2013、DPS、SPSS进行死亡率计算及数据统计分析。
采用小菜蛾3龄幼虫，测试WS-25310、CGMCC4.1365、WS-25376三个不同菌株发酵液药后24h、36h、48h、60h的杀虫活性。试验结果表明WS-25310室内活性最高，药后24h，平均校正防效达到88.51±2.80％，平均防效显著高于WS-25376及CGMCC4.1365；药后36h，平均校正防效达到94.24±1.99％，显著高于其他2个菌株防效；药后48h，平均校正防效达到96.11±2.05％，显著高于其他2个菌株防效；药后60h，平均校正防效达到99.41±1.02％，高于其他两个菌株防效。三个不同菌株WS-25310、CGMCC4.1365、WS-25376发酵液药后24h平均校正防效分别为88.51±2.80％、74.37±1.24％、72.56±2.97％；药后36h平均校正防效分别为94.24±1.99％、85.17±1.85％、81.45±1.01％；药后48h平均校正防效分别为96.11±2.05％、88.64±2.55％、88.08±0.91％；药后60h平均校正防效分别为99.41±1.02％、94.26±1.99％、92.96±1.86％，见表6和图18。
表6不同多杀菌素菌株发酵液对小菜蛾的室内生物测定
Figure BDA0003204138670000111
Figure BDA0003204138670000121
注：25310、25376、41365为WS-25310、WS-25376、CGMCC4.1365简称，同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，同列数据后不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 湖北省生物农药工程研究中心
<120> 产多杀菌素的放线菌及其在制备杀虫剂中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1444
<212> DNA
<213> 放线菌 WS-25310(Saccharopolysporasp. WS-25310)
<400> 1
gagggtgctt accatgcaag tcgaacgctg aagcatcttc gggtgtggat gagtggcgaa 60
cgggtgagta acacgtgggt aatctgccct gcactctggg ataagccttg gaaacggggt 120
ctaataccgg atatgacaca ctgccgcatg gtggtgtgtg gaaagttccg gcggtgcagg 180
atgggcccgc ggcctatcag cttgttggtg gggtgatggc ctaccaaggc gacgacgggt 240
agccggcctg agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300
gaggcagcag tggggaatct tgcgcaatgg gcgaaagcct gacgcagcaa cgccgcgtgg 360
gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcgacatcg acgaagcctt cgggtgacgg 420
taggtgtaga agaagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc 480
gagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag agctcgtagg cggtttgtcg cgtcggccgt 540
gaaaacctgc agcttaactg tgggcttgcg gtcgatacgg gcagacttga gttcggcagg 600
ggagactgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg 660
cgaaggcggg tctctgggcc gatactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag 720
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgttgggcg ctaggtgtgg ggatgggttc 780
cactgtttcc gtgccgtagc taacgcatta agcgccccgc ctggggagta cggccgcaag 840
gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt ggattaattc 900
gatgcaacgc gaagaacctt acctgggttt gacatgcact agacagcctc agagatgggg 960
tttcccttgt ggttggtgta caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgccccatg ttgccagcgg gttatgccgg 1080
ggactcgtgg gggactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1140
atgcccctta tgcccagggc ttcacacatg ctacaatggc cggtacagag ggtggcgata 1200
tcgtgaggtg gagcgaatcc cttaaagccg gtctcagttc ggatcggggt ctgcaactcg 1260
accccgtgaa gtcggagtcg ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc 1320
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacgtc atgaaagtcg gtaacacccg aagcccatgg 1380
cccaaccctt gtggggggag tggtcgaagg tgggactggc gattgggacg aagtcgtaac 1440
aaga 1444

Claims (4)

1.一种产多杀菌素的Saccharopolyspora sp. WS-25310，其保藏编号为CCTCC NO：M2020810。
2.一种权利要求1所述Saccharopolyspora sp. WS-25310在制备防治农林害虫的杀虫剂中的应用，其特征在于：所述农林害虫为小菜蛾、草地贪夜蛾、棉铃虫、枸杞蓟马和梨木虱中的任意一种。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述农林害虫为小菜蛾。
4.一种防治小菜蛾的杀虫剂，其特征在于：所述杀虫剂中包含权利要求1所述Saccharopolyspora sp. WS-25310发酵得到的菌液。
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