CN116179416A - 一株高产群体感应抑制活性放线菌新菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产群体感应抑制活性产物放线菌新菌Streptomyces sp.D67及应用。通过从新疆库木塔格沙漠土壤中分离得到的一株放线菌Streptomyces sp.D67属于链霉菌属新菌，将菌株进行代谢发酵获得高产群体感应抑制活性产物粗提物，最高达到540mg/L。该菌株粗提物对紫色杆菌CV026具有较强的群体感应抑制活性，能显著抑制铜绿假单胞菌群集泳动特性，对其生物膜、绿脓菌素和鼠李糖脂的产生具有显著抑制活性，当粗提液浓度为5mg/mL时，最高抑制率分别可达47％、40.9％和27％，链霉菌D67粗提液TLC生物显影和抑菌活性结果表明该粗提液中具有多种群体感应抑制活性分子和抑菌化合物，具有被开发制备功能性药物及农业生物防控良好的应用前景，可以广泛应用于医药和农业行业中。

Description

一株高产群体感应抑制活性放线菌新菌株及其应用
技术领域：
本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体的涉及一株高产群体感应抑制活性放线菌新菌株及其粗提液应用的技术领域。
背景技术：
群体感应(Quorum sensing,QS)是指微生物能自发产生、释放一些特定的信号分子，并能感知其浓度变化，调节微生物的群体行为。群体感应抑制剂(Quorum sensinginhibitor,QSI)是一种可以阻断群体感应通路的化学物质。现有研究表明，群体感应可调控基因表达，并参与许多重要的生物学过程，如孢子形成、毒力和生物膜形成等，可引起动植物发病、食物腐败等。群体感应抑制剂可通过对群体感应信号分子合成酶抑制，或产生信号分子类似物竞争结合转录蛋白受体等，阻断群体感应通路，而不会给病原菌带来明显的生存压力，从而延缓了病原菌抗药性的增加，为病原菌防治和相关新药物的开发提供了新思路。因此，筛选安全、高效和较为专一的群体感应抑制剂，也成为涉及人畜健康、农业植保、食品保鲜等国计民生研究的重要课题和研究热点。
在动物病原菌中，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一种革兰氏阴性菌致病菌，广泛存在于土壤、水、空气、人体皮肤、呼吸道和肠道等。它可以造成人类伤口感染、角膜炎，肺部囊性纤维化等疾病；同时它也是多重和泛抗生素耐药细菌ESKAPE组的成员之一，这与其群体感应通路中可以产生大量的生物膜、绿脓菌素、鼠李糖脂以及蛋白酶等物质有关，从而使相关疾病的治愈面临很大挑战。植物病原菌中，梨火疫欧文氏杆菌可引起梨火疫病，寄主范围很广，能为害梨、苹果、山楂、木旬子、李子等40多个属220多种植物，也可产生生物膜等致病原因子，均与群体感应相关。相关研究表明，相关植物病原菌株群体感应受阻，病原菌致病性降低，甚至丧失，为相关病原菌的防治提供新思路。
放线菌一直是天然活性代谢产物的重要来源，自1929年英国人弗菜明发现青霉素以来，据不完全统计，微生物来源天然活性产物33500种，其中放线菌来源13700种，约占41％，而链霉菌属来源的占其80％左右。沙漠极端环境具有极端干旱、强烈太阳紫外线辐射和昼夜周期极端温度变化等特征，孕育着丰富的极端环境微生物，其中，放线菌是其重要组成部分之一。相关研究表明，干旱区放线菌代谢产物表现出耐高温、易溶解的特性，在医药健康、农牧生产、食品加工等领域有广泛地应用前景。库木塔格沙漠位于新疆东部，其夏季炎热干燥，最高气温达到49.6℃，地表温度最高可达82.5℃，而冬季一般最低气温-10℃，极端低温可达-29℃，其生态环境极其特殊，为挖掘相关放线菌和开发相关群体感应抑制活性产物提供了理论依据。然而，国内鲜有该区域放线菌和开发相关群体感应抑制活性产物的报道，需要不断挖掘和寻找更好优良的菌种和应用。
发明内容：
针对现有的群体感应抑制剂能利用的新菌较少，且效率不高等技术问题，本发明旨在于提供一株高产群体感应抑制活性放线菌新菌Streptomyces sp.D67及其在群体感应抑制中的应用。本发明从新疆库木塔格沙漠土壤中分离得到的一株放线菌Streptomycessp.D67属于链霉菌属中新菌，该菌株具有群体感应抑制剂活性，且具有抑制欧文氏菌产生生物膜，铜绿假单胞菌产生生物膜、绿脓菌素、鼠李糖脂、蛋白酶等群体感应能力。将菌株进行代谢发酵获得高产群体感应抑制活性产物粗提物，最高产量可达540mg/L。通过抑菌活性、群体感应抑制活性以及对铜绿假单胞菌群集泳动特性、生物膜、绿脓菌素和鼠李糖脂代谢等特性对其进行验证，该菌株粗提液对紫色杆菌CV026具有较强的群体感应抑制活性，能显著抑制铜绿假单胞菌群集泳动特性，对铜绿假单胞菌生物膜、绿脓菌素和鼠李糖脂的产生具有显著抑制活性，并呈明显的浓度依赖性。Streptomyces sp.D67粗提液浓度为5mg/mL时，其对铜绿假单胞菌生物膜、绿脓菌素和鼠李糖脂的最高抑制率分别可达47％、40.9％和27％，新菌Streptomycessp.D67粗提液TLC生物显影和抑菌活性结果表明该粗提液中具有多种群体感应抑制活性分子和抑菌化合物，具有被开发制备功能性药物及农业生物防控良好的应用前景，可以广泛应用于医药和农业行业中。
为了达到以上技术效果，本发明通过如下技术方案实现。
本发明提供一株高产群体感应抑制活性的放线菌新菌Streptomyces sp.D67，所述Streptomyces sp.D67属于链霉菌属中新菌，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为CCTCC NO：M 20221542。
本发明提供的放线菌新菌Streptomyces sp.D67是从新疆库木塔格地区土样中筛选分离，经16S rRNA基因序列系统发育分析和形态学分析，链霉菌D67属于链霉菌属。通过对该菌株基因测序，所得序列在NCBI网站进行BLAST比对分析，Streptomyces sp.D67的16SrRNA基因序列与该属标准模式菌Streptomyces ardesiacus NBRC 15402T、StreptomycesheliomyciniNBRC 15899T和Streptomyces pluripotens MUSC 135T的同源性最高，相似度分别为98.39％、98.11％和98.03％。选取同源性较高的序列构建16S rRNA系统发育树，Streptomyces sp.D67与Streptomycespluripotens MUSC 135T(CP021080)亲缘更近聚在一个分支。经过系列多相分类鉴定，Streptomyces sp.D67与Streptomyces ardesiacusNBRC 15402T、Streptomyces heliomyciniNBRC 15899T和Streptomyces pluripotens MUSC135T存在明显不同，可确定该Streptomyces sp.D67为链霉菌属新菌种，具有新菌种典型性的特点。
本发明提供的链霉菌D67经过上述本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定，结合菌落形态学鉴定和生理生化特征鉴定分析，本发明涉及Streptomyces sp.D67为革兰氏染色阳性，菌落大小为0.2cm-0.6cm×0.2cm-0.6cm，其与培养基结合较紧、质地致密，气生菌丝呈白色绒状，孢子呈白色，基内菌丝呈淡黄色。
本发明提供的链霉菌D67蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性均为阳性；Streptomycessp.D67能利用的糖类碳源为糊精、木糖、松二糖、蔗糖、肌醇、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖，通过菌株生理生化特性分析，其与邻近菌株Streptomyces ardesiacus NBRC 15402T、Streptomyces heliomycini NBRC 15899T和Streptomycespluripotens MUSC 135T存在明显的差异。
经过上述菌种鉴定，以及本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定及菌种的生理生化系统试验验证，证实获得菌种编号为D67为链霉菌范畴内属于一种典型的新菌种Streptomyces sp.D67，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏号：CCTCCNO：M 20221542，保藏日期为2022年10月07日。
上述所述一株高产群体感应抑制活性的放线菌新菌Streptomyces sp.D67的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明中，所述放线菌新菌Streptomyces sp.D67的分离培养基为：可溶性淀粉20g/L，KNO31 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，琼脂18g/L，10％土壤浸提液1000mL，pH 7.5。
本发明中，所述放线菌新菌Streptomyces sp.D67的纯化培养基为：可溶性淀粉10.0g/L，K2HPO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，(NH4)2SO42.0g/L，CaCl22.0 g/L，FeSO4·7H2O 0.001g/L，MnSO40.001 g/L，ZnSO4·7H2O0.001g/L，琼脂15.0g/L，蒸馏水1.0L，pH 7.2。
本发明提供一种高产群体感应抑制活性的放线菌新菌Streptomyces sp.D67粗提液的制备方法，其制备具体包括如下步骤：将Streptomyces sp.D67的单菌落接种于ISP2培养基中，于30℃、150rpm培养2天，得Streptomyces sp.D67种子液；将链霉菌D67种子液按照体积比为1％的接种量接入到高氏一号液体培养基，于30℃、150rpm发酵培养7天，获得Streptomyces sp.D67发酵液，将Streptomyces sp.D67发酵液离心，取上清液，等体积乙酸乙酯萃取3h，取有机相于40℃真空旋转蒸发仪中蒸干，称重，获得Streptomyces sp.D67粗提物；称取适量的粗提物溶于二甲基亚砜中，用0.22μm无菌滤膜过滤后，获得Streptomycessp.D67粗提液，-20℃保存备用。
进一步，本发明提供高产群体感应抑制活性放线菌新菌Streptomyces sp.D67粗提液在制备群体感应抑制药物中的应用。
通过实施本发明提供的上述具体技术方案实施本发明内容，可以得到以下
有益效果：
(1)本发明提供一株放线菌中新菌Streptomyces sp.D67，经鉴定确认为菌种Streptomyces sp.D67属于链霉菌属中新菌，进而有必要进行按照法律要求的保藏。
(2)本发明提供的放线菌新菌Streptomyces sp.D67经发酵萃取获得的代谢粗提物，进行初步分析及功能鉴定，Streptomyces sp.D67粗提液对紫色杆菌CV026具有较强的群体感应抑制活性，能明显抑制铜绿假单胞菌群集泳动特性，对铜绿假单胞菌生物膜、绿脓菌素和鼠李糖脂的产生具有显著抑制活性，并呈明显的浓度依赖性，当Streptomycessp.D67粗提液浓度为5mg/mL时，最高抑制率分别可达47％、40.9％和27％。
(3)本发明提供的放线菌新菌Streptomyces sp.D67粗提液TLC生物显影和抑菌活性结果表明该粗提液中具有群体感应抑制活性分子和抑菌化合物，具有被开发制备功能性药物及农业生物防控良好的应用前景，可以广泛应用于医药和农业行业中。
附图说明：
图1显示为Streptomyces sp.D67基于16S rRNA序列构建的系统发育树。
图2显示为Streptomyces sp.D67的菌落形态。
图3显示为Streptomyces sp.D67发酵液群体感应抑制活性筛选平板。
图4显示为Streptomyces sp.D67粗提液TLC图及活性成分生物显影图。
图5显示为不同浓度的Streptomyces sp.D67粗提液对紫色杆菌CV026产紫色色素含量的影响。
图6显示为不同浓度的Streptomyces sp.D67粗提液对欧文氏菌生物膜的影响
图7显示为浓度为5mg/mL的Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌群集和泳动性影响。
图8显示为不同浓度的Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌产生物膜的影响
图9显示为不同浓度的Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌产绿脓菌素影响
图10显示为不同浓度的Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌产鼠李糖脂产量的影响
图11显示为不同浓度的Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌产蛋白酶影响。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为质量体积百分比，除非特别指出除外。
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明高氏一号培养基：可溶性淀粉20g/L，KNO31.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，琼脂15g/L，纯净水1000mL，pH7.4-7.6。
本发明LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，pH 7.0。
本发明群集检测培养基：蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，琼脂5g/L。
本发明泳动检测培养基：胰蛋白胨10g/L，NaCl 3g/L，琼脂5g/L。
本发明蛋白酶检测培养：脱脂奶粉20g/L，琼脂15g/L。
实施例1菌株Streptomyces sp.D67的分离纯化及鉴定
(一)筛选、分离和纯化
采用平板稀释法分离放线菌进行微生物的分离和纯化，将采集的新疆库木塔格沙漠土壤样品5g，放入45mL无菌水中，于150r/min，30℃孵育12h；采用标准梯度稀释，用无菌水稀释制成10-1-10-3浓度的稀释液；取100μL的各浓度稀释液，涂布于分离培养基平板上，放置于30℃恒温培养箱内培养；一周后，待平板上长出菌落后，挑取平板上的单菌落进行纯化培养，将纯化后的单菌落，转接到高氏一号培养基斜面上保存备用。
(二)16S rRNA基因鉴定
1.PCR模板DNA的提取
将纯化后的Streptomyces sp.D67接种到高氏一号液体培养基中，37℃摇床培养2d，收集菌体，采用DNA抽提试剂盒提取基因组总DNA。
2.PCR扩增
16S rRNA基因序列引物：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
PCR反应体系总体积25μL，PCR扩增条件为，94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸7min。
3.序列测定
PCR扩增产物经电泳检测和纯化后测序，其序列长度为1421bp，测试结果参见SEQID No：1所示，于NCBI进行BLAST同源序列检索，利用本领域常见采用的MEGA 7.0软件通过Neighbor-Joining方法建立系统进化树(重复抽样1000次)，结果见附图1所示所得序列在NCBI网站进行比对分析发现，Streptomyces sp.D67与Streptomyces ardesiacus NBRC15402T、Streptomyces heliomyciniNBRC 15899T和Streptomycespluripotens MUSC 135T的同源性最高，相似度分别为98.39％、98.11％和98.03％。选取同源性较高的序列构建16SrRNA系统发育树，Streptomyces sp.D67与Streptomyces pluripotens MUSC 135T(CP021080)亲缘更近聚在一个分支。经过系列多相分类鉴定，Streptomyces sp.D67与Streptomyces ardesiacus NBRC 15402T、Streptomyces heliomycini NBRC15899T和Streptomyces pluripotens MUSC 135T存在明显不同，证实获得的Streptomyces属范畴内菌种编号为D67与属于一种典型的新菌种。
实施例2：Streptomyces sp.D67的生理生化测定
(一)菌落形态特征分析
链霉菌D67可在ISP2、高氏一号、贝耐特琼脂等培养基上均能生长良好。将待观察的链霉菌D67接种到高氏一号平板上，于30℃培养4天，待菌落长满整个平板观察菌落特征记录并拍照保存，同时记录菌落的扫描电镜照片，记录结果参见附图2所示。
由附图2结果可知，本发明提供的链霉菌D67为革兰氏阳性菌，菌落大小为0.2cm-0.6cm×0.2cm-0.6cm，其与培养基结合较紧、质地致密，气生菌丝呈白色绒状，孢子呈白色，基内菌丝呈淡黄色。
基于以上生物学特征，将上述链霉菌D67鉴定为链霉菌属中新菌。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCCNO：M 20221542，保藏日期为2022年10月07日。
(二)菌株的生理生化特征分析
将链霉菌D67接种于高氏一号培养基上，分别检测各生理生化特征，生长温度、盐度、pH值范围、明胶液化、硝酸盐还原、过氧化氢产生、尿素酶、淀粉酶、酯酶、纤维素分解、碳源利用等特征分析主要参考《常见细菌系统鉴定手册》，链霉菌D67蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性均为阳性；链霉菌D67能利用的糖类碳源为糊精、木糖、松二糖、蔗糖、肌醇、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖。对病原菌的抗菌测定，链霉菌D67对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、欧文氏菌及金黄色葡萄球菌呈现出一定抗性。
综合16Sr RNA基因序列同源性对比分析以及菌落形态学鉴定、生理生化特征对比等多个方面与标准模式菌株具有鲜明的区别，确定该链霉菌D67为一种链霉菌新菌种，具有链霉菌同属内新菌种的特性。
实施例3：Streptomyces sp.D67粗提液的制备
本实施例在实施例1-2的基础上，菌种Streptomyces sp.D67粗提液制备过程如下：将链霉菌D67的单菌落接种于ISP2液体培养基中，于30℃、150rpm培养2天，得Streptomyces sp.D67种子液；将Streptomyces sp.D67种子液，按照体积比为1％的接种量接入到含有50mL高氏一号液体培养基的100mL三角瓶，于30℃、150r/min发酵培养7d，获得D67发酵液，将发酵液于1000r/min常温离心8min，取上清液，用等体积的乙酸乙酯萃取3h，取有机相于40℃真空旋转蒸发仪中蒸干，称重，获得Streptomyces sp.D67粗提物，最高产量可达540mg/L；称取适量的Streptomyces sp.D67粗提物溶于二甲基亚砜中，用0.22μm无菌滤膜过滤后，获得Streptomyces sp.D67粗提液，-20℃保存备用。
实施例4：Streptomyces sp.D67粗提液的应用
本实施例在实施例1-3的基础上，提供高产群体感应抑制活性新菌Streptomycessp.D67粗提液在制备群体感应抑制药物的应用，主要考察其对紫色杆菌CV026群体感应活性、铜绿假单胞菌群集泳动特性、铜绿假单胞菌生物膜活性、绿脓菌素和鼠李糖脂活性等的影响。
(1)Streptomyces sp.D67粗提液对紫色杆菌CV026群体感应的影响
取紫色杆菌CV026新鲜菌苔一环接入LB培养基中,于30℃，150r/min恒温振荡培养16h；取CV026菌液1mL和20μL浓度为100μmol/mL C6-HSL加入平皿中，然后加入25mL LB固体培养基，于50℃迅速混匀，待其凝固后，使用直径9mm打孔器打孔，备用；取100μLStreptomyces sp.D67粗提液加入孔中，于30℃恒温培养24h，观察平板变色情况，并记录有模糊透明圈的菌株，以初步确定该菌株具有群体感应抑制活性，统计结果参见附图3所示。
由附图3结果可知，不同稀释倍数的Streptomyces sp.D67粗提液可以不同程度的抑制紫色杆菌CV026产生紫色色素，初步证明该菌株具有明显的群体感应抑制效果。
(2)Streptomyces sp.D67粗提液群体感应活性验证
本试验在试验(1)的基础上，采用薄层色谱(TLC)-生物自显影法，取5μLStreptomyces sp.D67粗提液点在铝制薄层板上，选用展开剂体系为体积比为60：40的甲醇-水，密闭层析至上端0.5cm，冷风吹干；取其中一条于紫外线灯波长254nm观察荧光斑点，并拍照；另一条置于平皿内，将混有紫色杆菌CV026和C6-HSL的LB琼脂铺于TLC板上，凝固后，于30℃恒温培养36h，观察平板变色情况，并拍照，以确定活性物质的位置，具体结果参见附图4所示。
由附图4结果可知，Streptomyces sp.D67粗提液在245nm紫外照射下出现一个明显的暗斑，Rf值为0.77；通过生物显影，在TLC薄板上方有一明显菌株生长，但菌株无紫色素积累透明圈，证明Streptomyces sp.D67粗提液中含有较强的群体感应抑制活性成分。
(3)Streptomyces sp.D67粗提液对紫色杆菌产紫色色素的影响
采用96孔板法，分别取100μL的LB液体培养基(含0.1μmol C6-HSL)置于孔中，以2％接种量接种紫色杆菌CV026菌液，分别加入浓度为0.005mg/mL、0.05mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL和2mg/mL的Streptomyces sp.D67粗提液，加入等量的二甲基亚砜作为对照，置于酶标仪中于30℃震荡培养24h；分别吸取100μL上述粗提液置于1.5mL离心管中，于10000r/min离心5min，弃上清液，加入100μL的DMSO，涡旋震荡使紫色杆菌紫色素充分溶解，再次离心，取上清液，采用酶标仪测定其OD600值，以确定粗提物对紫色杆菌产生紫色素的影响，结果参见附图5所示。
由附图5结果可知，不同浓度Streptomyces sp.D67粗提液均对紫色杆菌CV026紫色色素产量有显著的影响，随着Streptomyces sp.D67粗提液浓度的升高，紫色色素含量显著减少，表明Streptomyces sp.D67粗提液中的群体感应抑制物能明显抑制了紫色杆菌CV026紫色色素的生成，即使是低浓度0.005mg/mL的Streptomyces sp.D67粗提液仍能有效降低其紫色素产量，此时紫色素产量为27％，表明Streptomyces sp.D67粗提液具有较强的群体感应抑制剂活性。
(4)Streptomyces sp.D67粗提液对欧文氏菌生物膜的影响
采用96孔板法，分别取100μL的LB液体培养基于孔中，以质量体积比2％的接种量接入欧文氏菌菌液，分别加入一定量的粗提物，至终浓度分别为0.06mg/mL、0.125mg/mL、0.2mg/mL和0.5mg/mL,加入等量的二甲基亚砜为对照，置于酶标仪中30℃震荡培养24h；弃掉菌液，蒸馏水冲洗3次获得生物膜，自然风干后用1％结晶紫染色15min，冲洗干净并烘干，用95％的乙醇洗脱，测定OD590值，并统计结果参见附图6所示。
由附图6数据可知，与对照组相比，各浓度Streptomyces sp.D67粗提液均对欧文氏菌生物膜的产生有显著的影响，随着Streptomyces sp.D67粗提液浓度的增加，其对欧文氏菌生物膜的抑制作用也逐渐增强，其中浓度为0.5mg/mL的Streptomyces sp.D67粗提液作用时，其对欧文氏菌生物膜的抑制作用最为显著，抑制率可达37％。
(4)Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌群集性和泳动性的影响
分别配制含有5mg/mL的Streptomyces sp.D67粗提液群集琼脂培养基和泳动琼脂培养基平板，点接铜绿假单胞菌，于30℃恒温正置培养24h，以确认菌株的迁移情况群集或泳动情况，添加等体积的二甲基亚砜作为对照，统计结果参见附图7所示。
由附图7数据可知，不加粗提液的铜绿假单胞菌群集和泳动明显，添加浓度为5mg/mL的Streptomyces sp.D67粗提液，其可以显著抑制铜绿假单胞菌群集和泳动性。
(5)Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌生物膜的影响
采用96孔板法，分别取100μL的LB液体培养基于孔中，以2％的接种量接入铜绿假单胞菌菌液，分别加入一定量的链霉菌D67粗提物，至终浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL和5mg/mL，并以加入等量的二甲基亚砜作为对照，分别置于酶标仪中于30℃震荡培养24h。弃掉菌液，蒸馏水冲洗3次获得生物膜，自然风干后用1％结晶紫染色15min，冲洗干净并烘干，用95％的乙醇洗脱，测定OD590值，以确定Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌生物膜的影响，具体结果参见附图8所示。
由附图8数据可知，与对照组相比，各浓度Streptomyces sp.D67粗提液均对铜绿假单胞菌生物膜的产生有显著的影响，随着Streptomyces sp.D67粗提液浓度的升高，其对铜绿假单胞菌的生物膜抑制作用也逐渐增强，当Streptomycessp.D67粗提液的浓度为5mg/mL时，其对铜绿假单胞菌的生物膜的产生抑制作用最显著，抑制率可达53％。
(6)Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌绿脓菌素的影响
本试验在试验(5)的基础上，取100μL菌液8000r/min离心5min,取上清加入100μL氯仿抽提绿脓菌素，并用100μL 0.2mol/L HCl反萃取氯仿中的绿脓菌素，待HCl层溶液由无色变为红色至深红色，测其OD520值，具体结果参见附图9所示。
由附图9数据可知，在实验浓度中，Streptomyces sp.D67粗提液均表现出对铜绿假单胞菌绿脓菌素具有一定抑制作用，抑制率为12.3％-40.9％，浓度为5mg/mL的Streptomyces sp.D67粗提液作用时，抑制率最显著，抑制率可达40.9％。
(7)Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌鼠李糖脂的影响
本试验在试验(5)的基础上，吸取100μL菌液上清液，加入乙酸乙酯萃取2次，40℃蒸干，加入100μL超纯水溶解后用300μL浓度为2％的蒽酮-硫酸溶液进行显色反应，在沸水中反应15min并冷却，同时设立空白对照组，重复三次，测定样品与空白对照组的OD625值，以确定Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌鼠李糖脂的影响，具体结果参见附图10所示。
由附图10数据可知，添加不同浓度的Streptomyces sp.D67粗提液，其对铜绿假单胞菌菌株鼠李糖脂产量有不同的影响，当Streptomyces sp.D67粗提液的浓度为5mg/mL和2mg/mL时，其抑制效果最显著，抑制率分别为27％和19％。
(8)Streptomyces sp.D67粗提液对铜绿假单胞菌总蛋白酶产量的影响
本试验在试验(5)的基础上，取100μL菌液10000r常温离心8min，在脱脂牛奶平板培养皿中心打直径为6mm小孔后加入50μL上清液，30℃下培养8h，观察并测量透明圈大小，具体结果参见附图11所示。
由附图11数据结果可知，添加不同浓度的Streptomyces sp.D67粗提液时，其对铜绿假单胞菌蛋白酶的抑制率均在6％左右，表明Streptomyces sp.D67粗提液未对铜绿假单胞菌总蛋白酶产量发产生明显的抑制作用。
综上数据可知，本发明提供的新菌Streptomyces sp.D67经发酵萃取获得的粗提液，进行初步分析及功能鉴定试验，Streptomyces sp.D67粗提液对紫色杆菌CV026具有较强的群体感应抑制活性，能明显抑制铜绿假单胞菌群集泳动特性，对铜绿假单胞菌生物膜、绿脓菌素和鼠李糖脂的产生具有显著抑制活性，并呈明显的浓度依赖性，最高抑制率分别可达47％、40.9％和27％；Streptomyces sp.D67粗提液TLC生物显影和抑菌活性结果表明该粗提液中具有多种群体感应抑制活性分子和抑菌化合物，为群体感应抑制剂的应用奠定坚实的基础。
综上所述，上述的实施例仅仅是对本试验的优选实施方式进行描述，并非对本试验的范围进行限定，在不脱离本试验设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本试验的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本试验确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一株高产群体感应抑制活性的新菌Streptomycessp.D67，其特征在于，所述菌株Streptomycessp.D67属于链霉菌属中新菌，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为CCTCCNO：M20221542。
2.如权利要求1所述的一株高产群体感应抑制活性的新菌Streptomycessp.D67，其特征在于，所述菌株Streptomycessp.D67的分离培养基为：可溶性淀粉20g/L，KNO31g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，琼脂18g/L，10％土壤浸提液1000mL，pH7.5。
3.如权利要求1所述的一株高产群体感应抑制活性的新菌Streptomycessp.D67，其特征在于，所述菌株Streptomycessp.D67的纯化培养基为：可溶性淀粉10.0g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，NaCl1.0g/L，(NH4)2SO42.0g/L，CaCl22.0g/L，FeSO4·7H2O0.001g/L，MnSO40.001g/L，ZnSO4·7H2O0.001g/L，琼脂15.0g/L，蒸馏水1.0L，pH7.2。
4.一种如权利要求1所述的高产群体感应抑制活性的新菌Streptomycessp.D67粗提物的制备方法，其特征在于，将Streptomycessp.D67的单菌落接种于ISP2培养基中，于30℃、150rpm培养2天，得Streptomycessp.D67种子液；将Streptomycessp.D67种子液按照体积比为1％的接种量接入到高氏一号液体培养基，于30℃、150rpm发酵培养7天，获得Streptomycessp.D67发酵液，将Streptomycessp.D67发酵液离心，取上清液，等体积乙酸乙酯萃取3h，取有机相于40℃真空旋转蒸发仪中蒸干，称重，获得Streptomycessp.D67粗提物；称取适量的粗提物溶于二甲基亚砜中，用0.22μm无菌滤膜过滤后，获得Streptomycessp.D67粗提液，-20℃保存备用。
5.如权利要求1所述的一株高产群体感应抑制活性的新菌Streptomycessp.D67粗提物在制备群体感应抑制药物中的应用。
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