CN115948268A - 一株拮抗猕猴桃溃疡病致病菌的死亡谷芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株拮抗猕猴桃溃疡病致病菌的死亡谷芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域。本发明公开一株死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)，保藏编号为CCTCCNO:M2022853。本发明从印度洋海泥样品中分离纯化并筛选出能够抑制丁香假单胞菌生长的菌株，经鉴定其为死亡谷芽孢杆菌，并通过对其抗菌活性物质进行分析，证实抗菌活性物质为杆菌霉素D类化合物。可见，本发明公开的深海来源的死亡谷芽孢杆菌，具有成为猕猴桃溃疡病生防菌的可能性，能够为猕猴桃溃疡病的防治提供新菌株。

Description

一株拮抗猕猴桃溃疡病致病菌的死亡谷芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株拮抗猕猴桃溃疡病致病菌的死亡谷芽孢杆菌及其应用。

背景技术

猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)被称为“水果之王”，富含多种维生素、糖、色素、有机酸等成分，尤其是维生素C含量非常丰富。近年来，随着猕猴桃种植面积的扩大和种植时间的延长，猕猴桃溃疡病的发病率出现上升的态势。猕猴桃溃疡病是一种低温性细菌病害，由丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)引发，具有爆发性强、传播速度快、隐蔽性强的特点，成为制约现今猕猴桃产业的一种主要病害。目前，对猕猴桃溃疡病的防治方法主要有物理防治和化学药剂防治等，但仍然缺乏特别安全、有效的方法，如化学防治法存在药物残留、环境污染和病原耐药性等问题。

生物防治是一种以有益生物或其他生物来抑制或杀死有害生物的方法，此方法不仅对植物生长没有影响，而且对致病菌不易产生抗药性，不污染环境，不影响人类健康，是未来替代化学药剂防治植物病害的优先选择。2008年，西北农林科技大学申哲等在感溃疡病的猕猴桃植株上喷施内生放线菌gcLA4发酵液100倍稀释液，以化学药剂施那宁为对照，抑制效果明显。2013年，四川农业大学燕金宜从猕猴桃植株枝条上分离出的内生真菌J2，也对猕猴桃溃疡病病原菌有较好的抗性和遗传稳定性，是一个具有开发潜力的生防菌株。而对海洋来源拮抗丁香假单胞菌的菌株研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株拮抗猕猴桃溃疡病致病菌的死亡谷芽孢杆菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过筛选分离得到一株拮抗丁香假单胞菌的死亡谷芽孢杆菌，为猕猴桃溃疡病的生防提供新菌株。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一株死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)，保藏编号为CCTCCNO: M2022853，保藏时间为2022年6月10日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

本发明还提供一种所述的死亡谷芽孢杆菌或其次级代谢产物在抑制丁香假单胞菌中的应用。

本发明还提供一种所述的死亡谷芽孢杆菌或其次级代谢产物在防治猕猴桃溃疡病中的应用。

优选的是，所述次级代谢产物为杆菌霉素D类化合物。

优选的是，包括所述杆菌霉素D类化合物包括结构式如式I所示的化合物及其同系物，

优选的是，所述同系物包括分子式分别为C₄₉H₇₆N₁₀O₁₅和C₅₀H₇₈N₁₀O₁₅的化合物，结构式分别如下式II、式III所示：

本发明还提供一种抑制丁香假单胞菌的抑制剂，包含所述的死亡谷芽孢杆菌或其次级代谢产物。

本发明还提供一种防治猕猴桃溃疡病的药物，包含所述的死亡谷芽孢杆菌或其次级代谢产物。

本发明公开了以下技术效果：

本发明从印度洋海泥样品中分离纯化并筛选出能够抑制丁香假单胞菌生长的菌株，采用形态学观察、生理生化实验及16S rDNA基因序列分析对其进行菌种鉴定，鉴定其为死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)。另外，还对该菌株的抗菌活性物质进行了分析，证实为杆菌霉素D类化合物。本发明提供了一种来源于深海来源的死亡谷芽孢杆菌，具有成为猕猴桃溃疡病生防菌的可能性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为菌株G357对丁香假单胞菌的抑制效果；

图2为菌株G357的形态学特征；a为菌落形态图；b显示其镜检结果为革兰氏阴性菌；c为电镜图；

图3为琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000 DNA Marker；357号：PCR产物；

图4为基于16S rDNA基因序列菌株G357的系统发育树；

图5为活性组分的分离纯化HPLC图；a.分离制备；b.单体化合物1检测；

图6为二次分离纯化HPLC图；

图7为化合物1的负离子质谱；

图8为化合物2和3的正离子质谱；a为化合物2的正离子质谱；b为化合物3的正离子质谱；

图9为化合物1的正负离子二级质谱结果；

图10为以DMSO为溶剂化合物1的¹H NMR结果；

图11为以DMSO及D₂O为溶剂化合物1的¹H NMR结果；

图12为化合物1的¹³C NMR结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1、实验材料

实验样品为自然资源部第三海洋研究所提供的西南印度洋海泥样品(水深1783m)。

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)，本实验室保藏。

营养肉汤(nutrient broth，NB)培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g和去离子水1 000mL，调节pH＝7.0。营养琼脂培养基在此基础上加入琼脂30g/L。

LB海水培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g和海水1 000mL。

LA海水培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，琼脂20g，酵母提取物5g和海水 1000mL。

以上培养基均在121℃高压蒸汽灭菌15min。

2、实验方法

2.1筛选丁香假单胞菌拮抗菌株

采用涂布平板法和平板划线法分离西南印度洋海泥中的微生物，取1g印度洋海泥样品加入9mL经过灭菌的含有60％海水的去离子水中，振荡2h后静置，按10倍梯度依次稀释至10^-7。取稀释度分别为10^-7、10^-6、10^-5的样品各50μL，均匀涂布在LA 海水培养基上，置于28℃培养箱中，恒温培养3天。选取形态不同的微生物多次反复平板划线，以得到纯化的单菌落。将得到的单菌落于37℃条件下摇瓶培养，培养24h 后加甘油混合，编号，并保存于-80℃冰箱中。

将丁香假单胞菌接种于营养肉汤培养基中，以1％(V/V)的接种量，进行活化， 30℃条件下摇床培养2天。再将分离得到的海洋微生物接种于LB海水培养基中，以 0.1％(V/V)的接种量，180r/min、37℃条件下培养24h，即得到海洋微生物种子液。

初筛：采用滤纸片法。在无菌条件下，吸取活化后的丁香假单胞菌100μL，均匀涂布于营养琼脂培养基上。制备分离得到的每种海洋微生物种子液，在其中各放入5片直径为9mm的滤纸圆片，分别浸泡10min，然后整齐叠放在上述接种了丁香假单胞菌的营养琼脂培养基上，30℃条件下培养24h，观察是否出现抑菌圈。

复筛：采用牛津杯法。首先将分离得到的海洋微生物接种于LB海水培养基中，以0.1％(V/V)的接种量，180r/min、37℃条件下培养24h。将得到的菌株发酵液在10000 r/min、4℃条件下离心10min，离心后取上清，旋转蒸发浓缩100倍，用0.22μm的无菌微孔滤膜过滤，然后存放置无菌离心管中。吸取活化后的丁香假单胞菌100μL，均匀涂布于营养琼脂培养基上，在培养基上放置牛津杯，每个杯内加入200μL上述浓缩后的海洋微生物发酵液，并于30℃条件下培养箱中培养24h。

2.2丁香假单胞菌拮抗菌株的鉴定

(1)形态观察及生理生化实验

将按照上述步骤筛选得到的丁香假单胞菌拮抗菌株划线，接种于LA海水培养基中，首先观察菌株的形态特点，其次根据《常见细菌系统鉴定手册》对其生理生化特征进行鉴定，包括革兰氏染色试验、明胶液化试验、糖发酵试验、吲哚试验等。

(2)分子生物学鉴定

选取通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3')，采用菌落聚合酶链式反应(polymeras chain reaction， PCR)的方法对筛选得到的丁香假单胞菌拮抗菌株的16S rDNA基因序列进行扩增。 PCR扩增体系：模板7μL，细菌通用引物27F和1492R各2μL，2×Taq Plus Master Mix酶25μL，双蒸水(ddH₂O)14μL，总体积为25μL；PCR扩增条件：95℃预变性5min；98℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃再延伸5min。

将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information，NCBI) 的GenBank数据库中采用基本局部比对搜索工具(basic local alignment searchtool， Blast)进行同源性搜索比对，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用 MEGA 6.0软件中的邻接(neighbor-joining，NJ)法绘制系统发育树。

2.3对丁香假单胞菌起到抑制作用的活性成分的分离和鉴定

为了分析G357中对丁香假单胞菌起到抑制作用的活性成分，对其发酵液用盐酸分级沉淀法进行处理，将发酵液调节pH＝4时，得到的沉淀活性最强。然后用甲醇抽提沉淀物，进行中压制备，采用PE:EA＝1:4以及DCM:MEOH:TFA＝7:1:0.77作为洗脱液进行洗脱，得到抗菌活性组分。

在70％甲醇-超纯水(0.1％TFA)，波长为222nm条件下等梯度洗脱进行制备。

3、结果

(1)从印度洋海泥样品筛选出一株对丁香假单胞菌拮抗效果最好的菌株G357，抑菌圈直径最大，达到21.30±0.83mm。如图1。

菌株G35在LB海水培养基上的菌落及细胞形态见图2。可见菌株G357长出的菌落为乳白色、半透明、凸起的圆形菌落，无褶皱，易挑起，表面光滑，呈乳状。

菌株G357的生理生化试验结果见表1。由表1可知，菌株G357的明胶液化试验、接触酶试验、淀粉水解试验、V-P试验、尿素试验、硫化氢试验结果均为阳性；而油脂水解试验、吲哚试验、甲基红试验、柠檬酸盐试验均为阴性。

表1菌株G357的生理生化特征

注：“+”表示结果呈阳性；“－”表示结果呈阴性。

(2)琼脂糖凝胶电泳图如图3所示，结果显示所筛选的丁香假单胞菌拮抗菌株能扩增出特异性条带。

G357号菌株测序结果如下：

cgcagggcgctgctatacatgcagtcgagcggacagatgggaagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaac acgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacat aaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgc gtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcc gcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagt gccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggt ggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccgggga gggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggagga acaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggt agtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctgggg agtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcg aagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttg tcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaa ggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctaca atggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgac tgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacacc acgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaaggtgagaaagtt。

基于16S rDNA基因序列，构建菌株G357的系统发育树，结果见图4。菌株G357 与死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)聚在同一分支，可视为亲缘关系最为接近。结合形态观察及生理生化特征试验结果，最终将该菌株鉴定为死亡谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)。

(3)在70％甲醇-超纯水(0.1％TFA)，波长为222nm条件下等度洗脱进行制备，出峰时间为20.40min的为化合物1。对26.22min出现的峰也进行收集，检测发现其中含有两种化合物，用70％-90％甲醇-超纯水(0.1％TFA)的条件进行洗脱，收集出峰时间为42.45min和44.76min的化合物2和3，见图5和图6。

如图7和图8所示，根据TOF-MS可知，三个单体化合物的分子量分别为M＝1029.52[M-H]^-、M＝1045.40[M+H]⁺、M＝1059.45[M+H]⁺，得化合物的相对分子质量分别1030、 1044、1058。

结合化合物1的正负离子二级质谱结果(图9)，推测其分子组成(表2)。

表2化合物1正离子二级质谱分析

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)结果如图10-图11所示。¹³C NMR(101MHz,DMSO- d6)δ174.60,174.45,172.43,172.18,171.97,171.56,170.90,170.22,169.94,156.32,130.72,130.59,128.62,115.57,66.53,62.47,62.10,60.95,59.14,56.66,55.41,53.35,52.16,51.07,48.73,47.45,41.24,37.42,36.10,34.31,31.97,30.59,29.81,29.74,29.72,29.69,29.65,29.60,29.39,29.02,28.67,27.51,25.99,25.52,25.15,22.76,20.84,14.61，结果如图12所示。结合上述数据分析，查阅文献进行比对，推测化合物1属于Bacillomycin D杆菌霉素D类化合物，分子式为C₄₈H₇₄N₁₀O₁₅。结构式如下式 I所示，化合物2和3均为其同系物，分子式分别为C₄₉H₇₆N₁₀O₁₅，C₅₀H₇₈N₁₀O₁₅，结构式如下式II、式III所示。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一株死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)，其特征在于，保藏编号为CCTCCNO:M2022853。

2.一种如权利要求1所述的死亡谷芽孢杆菌或其次级代谢产物在抑制丁香假单胞菌中的应用。

3.一种如权利要求1所述的死亡谷芽孢杆菌或其次级代谢产物在防治猕猴桃溃疡病中的应用。

4.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述次级代谢产物为杆菌霉素D类化合物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述杆菌霉素D类化合物包括结构式如式I所示的化合物及其同系物，

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述同系物包括分子式分别为C₄₉H₇₆N₁₀O₁₅和C₅₀H₇₈N₁₀O₁₅的化合物，结构式分别如下式Ⅱ、式Ⅲ所示：

7.一种抑制丁香假单胞菌的抑制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的死亡谷芽孢杆菌或其次级代谢产物。

8.一种防治猕猴桃溃疡病的药物，其特征在于，包含权利要求1所述的死亡谷芽孢杆菌或其次级代谢产物。

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