CN112094770B - 一株高地芽孢杆菌及其活性物质复配液与菌剂在防治根结线虫病中的应用 - Google Patents

一株高地芽孢杆菌及其活性物质复配液与菌剂在防治根结线虫病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株高地芽孢杆菌及其活性物质复配液与菌剂在防治根结线虫病中的应用，一种高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084，已于2018年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.16308，本发明涉及菌剂对根结线虫的防治效果显著。

Description

一株高地芽孢杆菌及其活性物质复配液与菌剂在防治根结线 虫病中的应用
技术领域
本发明涉及一株高地芽孢杆菌及其活性物质复配液与菌剂在防治根结线虫病中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
根结线虫病是由根结线虫引起的一种常见的土传病害，目前已成为制约世界农业发展的重要因素之一，据统计，全球每年因根结线虫病损失高达1570亿美元。根结线虫病的主要症状就是在植物根部形成大小不等的根瘤，患病植物前期表现不明显，类似肥水不足的症状，一旦发现即是发病后期，呈爆发式发病，植株死亡或是绝产。
使用化学药剂防治在当前农业生产中占据着主导地位，用于防治根结线虫的化学农药称为杀线剂，分为熏蒸剂和非熏蒸剂两种，在过去的几十年里，化学杀线剂具有经济、速效的特点深受农民的欢迎。但是，随着人们环保意识的加强，国家对于绿色农业和健康农业的重视，化学杀线剂因其高残留、高毒性、高风险性等弊端，其应用正逐步受到限制，绝大多数应用广泛的高毒杀线剂例如苯线磷、甲基异柳磷、克百威、灭多威、灭线磷、涕灭威、溴甲烷等已经被明文禁用。
随着人们对根结线虫病的重视以及研究的不断深入，一些化学防治的取代方法不断被发掘，生物防治作为其中之一，现已成为根结线虫防治的研究热点。根结线虫的生物防治是指利用根结线虫的天敌生物或是它们的代谢产物杀伤或抑制根结线虫，以减轻根结线虫病的发生。生物防治因其环境友好、作用效果明显、无残留、使用过程对人畜安全等特点得到了研究以及产业层面的关注。目前，超过700个种的食线虫真菌资源被发掘报道，细菌类如假单胞菌属、芽孢杆菌属、巴氏杆菌属等多个属的菌种也被证实具有很好的杀虫效果，新的杀虫化合物、杀虫基因也不断的被发掘报道。
虽然对生防菌的研究越来越多，但是已注册登记并实际应用到农业生产中的所占比例还很小，且菌种较为单一，其中很重要的原因就是对线虫生防菌的认识、研究、开发和利用尚处于初始阶段，不能满足线虫病害生物防治的实际要求。在生防菌的应用上，研究成果仅停留在试验水平，加之，对以生防菌为主要活性成分的高效发酵工艺和剂型研发相对滞后，导致实现工业化生产并大面积推广应用的生防菌菌剂产品数量不多。
尽管目前关于高地芽孢杆菌的杀虫活性已有少量报道，但是关于高地芽孢杆菌的研究不够深入，发酵及剂型模式单一，防治效率不高，且没有对高地芽孢杆菌杀虫活性物质进行相关研究。
中国专利文献CN108865946A(申请号：201810799951.8)公开了一株高地芽孢杆菌及其在防治番茄根结线虫中的应用。该发明公开的高地芽孢杆菌CGMCC No.15213的菌悬液在作用于根结线虫二龄幼虫时，作用时间长，在12h以上；该菌的应用实验数据显示，每次每株番茄灌药液250mL，共灌根两次，所述药液为高地芽孢杆菌CGMCC No.15213固体发酵培养物10倍液，所述固体发酵培养物的活菌数为70亿/g，所述每株番茄施用高地芽孢杆菌CGMCCNo.15213固体发酵培养物为50g，即每株番茄施用的活菌数为3500亿；所用番茄品种为“西粉3号”该番茄品种的常规栽培每亩4500株左右；即使按每亩2000株栽培，按上述实验数值，每亩高地芽孢杆菌CGMCC No.15213固体发酵培养物的用量为100kg，活菌数达7×106亿/亩。该发明公开的高地芽孢杆菌CGMCC No.15213用于防治线虫的应用，每亩用量过大，不利于推广应用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株高地芽孢杆菌及其活性物质复配液与菌剂，可应用于根结线虫病的生物防治。
本发明的技术方案如下
一种高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084，已于2018年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.16308。
所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084，简称AMCC 101084，同时也编号为AMCC1040，从植物根际土壤中分离得到。
所述高地芽孢杆菌AMCC 101084的培养方法I，包括如下步骤：
(1)将高地芽孢杆菌AMCC 101084在固体培养基平板上活化培养，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于种子液体培养基中，进行培养液，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液接种于发酵液体培养基中，进行培养，制得初级发酵液；
(4)将步骤(3)制得的初级发酵液接种于发酵液体培养基中，进行培养，制得发酵液。
根据本发明优选的，步骤(1)中，固体培养基为LB固体培养基，活化条件为37℃活化培养24h。
根据本发明优选的，步骤(2)中，种子培养基为LB液体培养基，培养条件为37℃、180rpm培养18h。
根据本发明优选的，步骤(3)中，按体积百分比5-10％的接种量接种，培养条件为37℃、180rpm培养10h。
根据本发明优选的，步骤(4)中，按体积百分比5-10％的接种量接种，培养条件为37℃、180rpm培养24h。
根据本发明优选的，步骤(3)或(4)中，所述发酵液体培养基的组分按质量分数计为：玉米粉1.5％，豆饼粉2.0％，麸皮2.1％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl2 0.01％，余量水，pH 7.0-7.2。
根据本发明优选的，步骤(4)中，制得发酵液的菌体浓度为(0.2～1.0)×109CFU/mL。
所述高地芽孢杆菌AMCC 101084的培养方法Ⅱ，包括如下步骤：
a将高地芽孢杆菌AMCC 101084在LB固体培养基平板上活化培养，制得活化菌株；
b将步骤a制得的活化菌株接种于BPY液体培养基中，进行培养液，制得种子液；
c将步骤b制得的种子液接种于BPY液体培养基中，进行培养，制得发酵液。
根据本发明优选的，步骤a中，活化条件为37℃活化培养12h。
根据本发明优选的，步骤b中，培养条件为37℃、200rpm培养12h。
根据本发明优选的，步骤c中，接种量为1％，培养条件为37℃、200rpm培养48h。
根据本发明优选的，步骤b或步骤c中，所述BPY液体培养基每升组分如下：
蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖10.0g，氯化钠5.0g，余量水，pH7.0。
根据本发明优选的，步骤c中，制得发酵液的菌体浓度为(0.3～1.1)×108CFU/mL。
上述高地芽孢杆菌AMCC 101084用于防治根结线虫。
根据本发明优选的，上述高地芽孢杆菌AMCC 101084用于防治番茄和/或生姜的根结线虫。
上述高地芽孢杆菌AMCC 101084的培养方法Ⅰ或培养方法Ⅱ制备的发酵液用于防治根结线虫。
根据本发明优选的，上述发酵液用于防治番茄和/或生姜的根结线虫。
根据本发明优选的，上述发酵液除去菌体后液体用于防治根结线虫。
根据本发明优选的，上述发酵液施用时，稀释1000倍应用。
进一步优选的，上述发酵液用于防治番茄和/或生姜的根结线虫，每亩用量为20L。
上述高地芽孢杆菌AMCC 101084用于生产2,3-丁二酮、乙酸、乙偶姻、异戊醇、2-氨乙基异丙醚、2,3-丁二醇、异戊酸、2-甲基丁酸、异辛醇、正辛酸之一或二者以上。
一种杀线虫的活性物质复配液包括：2,3-丁二酮、乙酸、乙偶姻、异戊醇、2-氨乙基异丙醚、2,3-丁二醇、异戊酸、2-甲基丁酸、异辛醇、正辛酸之一或二者以上。
根据本发明优选的，所述复配液按质量分数计包括：2,3-丁二酮0.1％-0.5％、乙酸0.1％-0.4％、乙偶姻0.5％-1.0％、异戊醇0.1％-0.5％、2-氨乙基异丙醚0.3％-1.0％、2,3-丁二醇0.1％-0.5％、异戊酸0.1％-0.4％、2-甲基丁酸0.1％-0.3％、异辛醇0.1％-0.5％和正辛酸0.01％-0.1％，余量为水。
进一步优选的，所述复配液按质量分数计包括：2,3-丁二酮0.3％、乙酸0.2％、乙偶姻0.7％、异戊醇0.3％、2-氨乙基异丙醚0.8％、2,3-丁二醇0.4％、异戊酸0.2％、2-甲基丁酸0.2％、异辛醇0.5％和正辛酸0.05％，余量为水。
有益效果
1、本发明涉及的高地芽孢杆菌AMCC 101084在进行杀虫实验时，其发酵上清液对南方根结线虫二龄幼虫的致死率为100％，并且作用时间短，达到100％的致死率只需要作用1.5h。
2、本发明涉及的高地芽孢杆菌AMCC 101084液体菌剂处理含虫病土3d后，栽种大姜，后期不再追施该菌剂，并且发酵液用量少，与空白对照相比，施用菌剂的大姜癞皮面积明显减少，生姜根结线虫病俗称生姜癞皮病，有效改善了大姜的产品质量，本发明涉及菌剂对根结线虫的防治效果显著。
3、本发明涉及的活性物质复配液处理含虫病土3d后移栽番茄，番茄种植45d后，其根结数量可减少65.86％，虫口密度下降73.24％。
附图说明
图1、高地芽孢杆菌AMCC 101084进化树；
图2、实施例2中发酵液Ⅱ上清液作用时间对应的根结线虫致死率曲线图；
图3、高地芽孢杆菌AMCC 101084挥发性物质总离子流图；
图4、高地芽孢杆菌AMCC 101084发酵液对大姜根结线虫的抑制作用的观察图片；
图5、为收获期空白对照组大姜癞皮观察照片；
图6、为收获期施用菌剂的大姜癞皮观察照片。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围并不限于此。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂家购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084的分离、鉴定
从植物根际筛选出一株杀线虫菌株，命名为AMCC 101084菌株，同时也编号为AMCC1040。
AMCC 101084菌株的16S序列如SEQ ID No.1所示，其分类地位与高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)处于同一分支(见图1)，生理生化实验(见表1)表明该菌与高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)分类地位相同。
经鉴定，AMCC 101084菌株属于高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，已于2018年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16038。
表1生理生化实验
Figure BDA0002637500850000051
Figure BDA0002637500850000061
Note:++means positive,+means borderline,-means negative.
实施例2
高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084菌株的培养及离体杀虫实验
所述高地芽孢杆菌AMCC 101084的培养方法I，包括如下步骤：
(1)取斜面保藏菌种，在LB固体培养基平板上三区划线，37℃培养24h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，进行培养液，37℃、180rpm培养18h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液接种于发酵液体培养基中，按体积百分比5％的接种量接种，进行培养，培养条件为37℃、180rpm培养10h，制得初级发酵液；
(4)将步骤(3)制得的初级发酵液接种于发酵液体培养基中，按体积百分比7％的接种量接种，进行培养，培养条件为37℃、180rpm培养24h，制得发酵液I。
步骤(3)或(4)中，所述发酵液体培养基的组分按质量分数计为：玉米粉1.5％，豆饼粉2.0％，麸皮2.1％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl2 0.01％，余量水，pH 7.0-7.2。
所述发酵液I的活菌数为(0.2～1.0)×109CFU/mL。
所述高地芽孢杆菌AMCC 101084的培养方法Ⅱ，包括如下步骤：
(1)取斜面保藏菌种，于LB固体培养基平板上三区划线，37℃培养12h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于BPY液体培养基(50mL/250mL)，37℃，200rpm培养12h，制得种子液；
(3)按照1％接种量，将种子液接种至BPY培养基(200mL/500mL)，37℃，200rpm培养48h，制得发酵液Ⅱ。
所述发酵液Ⅱ的活菌数为(0.3～1.1)×108CFU/mL。
所述LB培养基，每升组分如下：
蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉20.0g，余量水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
所述BPY培养基，每升组分如下：
蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖10.0g，氯化钠5.0g，余量水，pH7.0，121℃灭菌20min。
发酵液Ⅱ上清液的制备：将发酵液分装到100mL的离心管并置于高速冷冻离心机中，12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液，4℃冰箱保存备用；
活性检测：在24孔板中分别加入100μL线虫悬液(约200条)、100μL待测菌的发酵液Ⅱ上清液和300μL无菌水，用移液器轻轻吹打混匀，每个样品重复3次，以空白培养基代替发酵液作为阴性对照，25℃黑暗放置，每隔10min统计线虫死亡率(见图2)。
所述线虫为南方根结线虫二龄幼虫(Meloidogyne incongnita,J2)。
校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100
高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084菌株BPY发酵上清液1.5h对线虫致死率可达100％。
对比菌株1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AMCC100011，保藏与山东农业微生物菌种资源保藏与利用中心(本领域技术人员可由此处购买)，相同培养及杀虫条件下，其发酵上清液对线虫无致死效果。
对比菌株2解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AMCC100041，保藏与山东农业微生物菌种资源保藏与利用中心(本领域技术人员可由此处购买)，相同培养及杀虫条件下，其发酵上清液12h对线虫致死率为55％。
对比菌株3地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)AMCC100161，保藏与山东农业微生物菌种资源保藏与利用中心(本领域技术人员可由此处购买)，相同培养及杀虫条件下，其发酵上清液12h对线虫致死率为43％。
对比菌株4高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC101354，保藏与山东农业微生物菌种资源保藏与利用中心(本领域技术人员可以由此处购买)，相同培养及杀虫条件下，其发酵上清液12h对线虫致死率为29％。
实施例3
高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084菌株杀虫活性物质的分析，包括如下步骤：
(1)高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084划线接种于BPY固体培养基平板上活化培养，37℃培养12h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于BPY液体培养基中，进行种子培养，37℃，200rpm培养12h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比7％接种量接种到BPY液体培养基中，进行液体培养，37℃，200rpm培养12h，制得初级发酵液；
(4)将步骤(3)制得的初级发酵液按体积百分比7％接种量接种到BPY发酵培养基中，进行发酵培养，37℃，200rpm培养48h，制得发酵液。
(5)将步骤(4)制得的发酵液置于高速冷冻离心机中，12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液，进行SPME-GC-MS分析，分析条件如下：
萃取头老化：250℃温度条件下，载气流量3mL/min，老化时间为30min。
向50mL顶空瓶中加入25mL样品，立即用带有硅橡胶隔垫的瓶盖密封，置于95℃的水浴锅中处理30min；将已老化处理过的50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头插入顶空瓶中，其末端不接触样品，在95℃下继续保持30min；将富集完成的固相微萃取头取出，迅速插入气相色谱仪进样口，于250℃解吸6min，完成进样。
色谱条件：Rtx-5MS色谱柱(60m×0.32mm×0.25μm)，载气为高纯度氦气(99.999％)，柱流量为3mL/min，不分流方式进样，进样口温度为230℃。
质谱条件：离子源温度为220℃，EI电离，电离能量70eV，接口温度250℃，离子碎片扫描范围为35-500m/z，溶剂延迟时间3min。
升温程序：初始温度50℃，保持2min以后以2℃/min升至120℃，再以5℃/min升至200℃，保持1min。挥发性成分经NIST08,NIST08s及FFNSC1.3数据库比对后定性，结果见表2，图3为挥发性物质总离子流图(纵坐标为峰值，横坐标为出峰时间)。
表2高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084产生的挥发性成分
Figure BDA0002637500850000081
实施例4
高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084杀虫活性物质的复配及盆栽抗病实验
将实施例3中检测到的10种挥发性化合物的标准品(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)按照一定浓度进行复配，具体如下：2,3-Butanedione(2,3-丁二酮),Aceticacid(乙酸),Acetoin(乙偶姻),3-Methyl-1-butanol(异戊醇),2-Isopropoxy ethylamine(2-氨乙基异丙醚),2,3-Butanediol(2,3-丁二醇),3-Methyl-butanoic acid(异戊酸),2-Methyl-butanoic acid(2-甲基丁酸),2-Ethyl hexanol(异辛醇),n-Octanoic acid(正辛酸)的复配后质量百分比分别为0.3％，0.2％，0.7％，0.3％，0.8％，0.4％，0.2％，0.2％，0.5％，0.05％，余量为水。
盆栽实验于山东农业大学温室内进行，所用土壤采集自山东农业大学试验站，虫口密度为15条/g土，线虫经分子生物鉴定为南方根结线虫。共设置4个处理：(1)CK，80mL无菌水+800g虫土；(2)T1，80mL的阿维菌素乳油稀释液+800g虫土，所述稀释液为5％阿维菌素乳油的2000倍稀释液；(3)T2，80mL的杀虫活性物质复配液稀释液+800g虫土，所述稀释液为杀虫活性物质复配液的1000倍稀释液；(4)T3，80mL的发酵液Ⅱ上清液(实施例2制备)稀释液+800g虫土，所述稀释液为发酵液Ⅱ上清液的1000倍稀释液。处理3d后移栽番茄，每个处理6个重复。常规管理，移栽45d后将番茄整株取样，统计根结数、卵囊数、虫口密度，具体方法参照Affokpon et al.(Biocontrol potential of native Trichoderma isolatesagainst root-knot nematodes in West African vegetable production systems,SoilBiology and Biochemistry，2011)，结果见表3：
表3盆栽实验
Figure BDA0002637500850000091
盆栽实验结果表明：高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084杀虫活性物质复配液处理含虫病土3d后移栽番茄，种植45d后其根结数量可减少65.86％，虫口密度下降73.24％，卵囊数减少了84.69％；发酵液Ⅱ上清液处理后其根结数量及虫口密度、卵囊数与空白对照相比也分别降低了63.74％、72.63％、87.65％。
实施例5
高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084大田实验
本试验于山东省潍坊昌邑市田间进行。大姜连作多年，根结线虫病严重。
本试验共3个处理：(1)菌剂处理：发酵液Ⅰ(实施例2制备)菌剂浓度为(0.2～1.0)×109CFU/mL，亩用量20L，整地起垄后，菌剂稀释1000倍均匀喷施至栽种大姜的沟内，处理3d后栽种大姜；(2)化学农药处理作为阳性对照：噻唑膦颗粒剂，亩用量10kg，均匀洒在沟内；(3)空白对照CK：不做任何处理。每个处理3个重复，每个处理面积为30m2。根系染色方法、根结数统计方法，雌虫数统计方法参照Ramatsitsi and Dube(Post-infectionalresistance in traditional leafy vegetable infected with root-knotnematodes.South African Journal of Botany,131,169-173)。
结果显示(见表4，图4)：在根结线虫病发病期间，与CK相比，5月份二龄幼虫侵染数减少了93.68％，8月份雌虫数减少了82.90％，总根结数(为单根结+串珠状根结)减少了65.71％，收获期空白对照组大姜癞皮面积较大(见图5)，严重影响了大姜的产品质量；施用菌剂的大姜癞皮面积明显减少(见图6)，有效改善了大姜的产品质量，本发明涉及菌剂对根结线虫的防治效果显著。
由图4可以看出高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)AMCC 101084菌剂对大姜根结线虫的抑制作用显著，能够有效抑制线虫侵染，抑制线虫发育，延缓线虫雌虫的发育时间。
表4大田实验
Figure BDA0002637500850000101
注：“J2s”为根结线虫二龄幼虫。
综上，本发明涉及的高地芽孢杆菌AMCC 101084在进行杀虫实验时，其发酵上清液对南方根结线虫二龄幼虫的致死率为100％，并且作用时间短，达到100％的致死率只需要作用1.5h；本发明涉及的高地芽孢杆菌AMCC 101084液体菌剂处理含虫病土3d后，栽种大姜，后期不再追施该菌剂，菌剂浓度为(0.2～1.0)×109CFU/mL，亩用量只需要20L，与空白对照相比，施用菌剂的大姜癞皮面积明显减少，生姜根结线虫病俗称生姜癞皮病，有效改善了大姜的产品质量，本发明涉及菌剂对根结线虫的防治效果显著；利于推广应用。
根据本发明涉及高地芽孢杆菌AMCC 101084发酵液中活性物质的种类，复配的活性物质复配液处理含虫病土3d后移栽番茄，番茄种植45d后，其根结数量可减少65.86％，虫口密度下降73.24％。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏滋百农生态农业股份有限公司
<120> 一株高地芽孢杆菌及其活性物质复配液与菌剂在防治根结线虫病中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1429
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttcggcggc tggctccata aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg 60
gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120
attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca 180
gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc cattgtagca 240
cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300
tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt 360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420
cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag aggatgtcaa 480
gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta 600
atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac 660
ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc 720
agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780
ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac 840
cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt 900
acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960
gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg ccctatttga acggcacttg 1020
ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct 1080
ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140
ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt 1200
ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagcc 1260
gaagccacct tttatgtctg aaccatgcgg ttcagacaac catccggtat tagccccggt 1320
ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg 1380
ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactg catgtatag 1429

Claims (22)

1.一种高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）AMCC 101084，已于2018年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.16308。
2.权利要求1所述高地芽孢杆菌AMCC 101084的培养方法I，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将高地芽孢杆菌AMCC 101084在固体培养基平板上活化培养，制得活化菌株；
（2）将步骤（1）制得的活化菌株接种于种子液体培养基中，进行培养，制得种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液接种于发酵液体培养基中，进行培养，制得初级发酵液；
（4）将步骤（3）制得的初级发酵液接种于发酵液体培养基中，进行培养，制得发酵液。
3.如权利要求2所述的培养方法Ⅰ，其特征在于，步骤（1）中，固体培养基为LB固体培养基，活化条件为37℃活化培养24h。
4.如权利要求2所述的培养方法Ⅰ，其特征在于，步骤（2）中，种子液体培养基为LB液体培养基，培养条件为37℃、180rpm培养18h。
5.如权利要求2所述的培养方法Ⅰ，其特征在于，步骤（3）中，按体积百分比5-10％的接种量接种，培养条件为37℃、180rpm培养10h。
6.如权利要求2所述的培养方法Ⅰ，其特征在于，步骤（4）中，按体积百分比5-10％的接种量接种，培养条件为37℃、180rpm培养24h。
7.如权利要求2所述的培养方法Ⅰ，其特征在于，步骤（3）或（4）中，所述发酵液体培养基的组分按质量分数计为：玉米粉1.5%，豆饼粉2.0%，麸皮2.1%， KH2PO4 0.03%，K2HPO40.01%，CaCl2 0.01%，余量水，pH 7.0-7.2。
8.如权利要求2所述的培养方法Ⅰ，其特征在于，步骤（4）中，制得发酵液的菌体浓度为（0.2~1.0）×109CFU/mL。
9.权利要求1所述高地芽孢杆菌AMCC 101084的培养方法Ⅱ，其特征在于，包括如下步骤：
a将高地芽孢杆菌AMCC 101084在LB固体培养基平板上活化培养，制得活化菌株；
b将步骤a制得的活化菌株接种于BPY液体培养基中，进行培养，制得种子液；
c将步骤b制得的种子液接种于BPY液体培养基中，进行培养，制得发酵液。
10.如权利要求9所述的培养方法Ⅱ，其特征在于，步骤a中，活化条件为37℃活化培养12h。
11.如权利要求9所述的培养方法Ⅱ，其特征在于，步骤b中，培养条件为37℃、200rpm培养12h。
12.如权利要求9所述的培养方法Ⅱ，其特征在于，步骤c中，接种量为1%，培养条件为37℃、200rpm培养48h。
13.如权利要求9所述的培养方法Ⅱ，其特征在于，步骤b或步骤c中，所述BPY液体培养基每升组分如下：
蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖10.0g，氯化钠5.0g，余量水，pH 7.0。
14.如权利要求9所述的培养方法Ⅱ，其特征在于，步骤c中，制得发酵液的菌体浓度为（0.3~1.1）×108CFU/mL。
15.权利要求1所述高地芽孢杆菌AMCC 101084用于防治根结线虫。
16.如权利要求15所述应用，其特征在于，上述高地芽孢杆菌AMCC 101084用于防治番茄和/或生姜的根结线虫。
17.权利要求2-14任一项所述高地芽孢杆菌AMCC 101084的培养方法制备的发酵液用于防治根结线虫。
18.如权利要求17所述应用，其特征在于，所述发酵液用于防治番茄和/或生姜的根结线虫。
19.如权利要求17所述应用，其特征在于，所述发酵液除去菌体后液体用于防治根结线虫。
20.如权利要求17所述应用，其特征在于，所述发酵液施用时，稀释1000倍应用。
21.如权利要求17所述应用，其特征在于，所述发酵液用于防治番茄和/或生姜的根结线虫，每亩用量为20L。
22.权利要求1所述高地芽孢杆菌AMCC 101084用于生产2,3-丁二酮、乙酸、乙偶姻、2-氨乙基异丙醚、2,3-丁二醇、异戊酸、 2-甲基丁酸、正辛酸之一或二者以上。
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