CN103397058A

CN103397058A - 一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法

Info

Publication number: CN103397058A
Application number: CN2013103284405A
Authority: CN
Inventors: 武爱波; 赵志勇; 宋素泉; 王建华; 刘娜; 聂冬霞; 杨宪立
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-07-27
Filing date: 2013-07-27
Publication date: 2013-11-20

Abstract

本发明的目的是提供一种简单快速、价格低廉且可大量制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法。该方法首先将镰刀菌接种至固体培养基获得含有高量脱氧雪腐镰刀烯醇的培养物，然后经过提取、萃取后通过制备液相分离纯化及重结晶，最终获得了纯度较高的此化合物。该工艺操作简单、制备速度快，可大幅度降低生产成本。同时纯度达到98％以上，可作为标准物质应用于粮食及食品中脱氧雪腐镰刀烯醇的安全监控。此方法也填补了国内真菌毒素标准物质制备领域的空白。

Description

一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法

技术领域

本发明属于天然产物提取领域，具体涉及一种从镰刀菌接种的固体培养基中提取、分离纯化其次级代谢产物的方法技术。

背景技术

脱氧雪腐镰刀烯醇(deoxynivalenol，3，7，15-三羟基-12，13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮)又称为呕吐毒素，是由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌和雪腐镰刀菌等真菌侵染谷物类作物后在适宜的温度及湿度条件下产生的一种单端孢霉烯族B类毒素。它在1972年首次由日本人Morooka在燕麦中分离出。呕吐毒素耐高温，高压，弱酸中不分解，化学性质十分稳定。同时它极易溶解于水、乙腈、甲醇及乙酸乙酯等极性溶剂。

呕吐毒素是目前全球范围内污染粮食、饲料及食品最为严重的真菌毒素之一，严重影响着人和动物的健康。研究表明，动物特别是猪摄入被呕吐毒素污染的饲料可引起呕吐、厌食、腹泻、发烧及体重减轻等中毒症状，严重时可损害中枢神经系统及造血系统而造成急性死亡；同时它还具有很强细胞毒性(抑制DNA、RNA、蛋白质合成)、胚胎毒性(胚胎死亡、胎儿生长迟缓、功能发育不全)、一定致畸性、弱致癌性，并且影响人和动物的免疫系统。

检测、监测和控制食品、农产品中呕吐毒素污染水平已成为世界各个国家食品安全保障中的关键环节。目前有100多个国家和地区制定了食品及农产品中呕吐毒素的限量法规或标准。2006年欧盟颁布了新的《食品中真菌毒素限量标准(EC)No.1881/2006》规定人类直接食用的谷物、谷物淀粉、麦麸、干面食呕吐毒素最大限量为750μg/kg；我国于2011颁布了新修订的真菌毒素限量标准即《GB2761-2011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量)》中规定了谷物及谷物制品(玉米、玉米面、大麦、小麦、麦片、小麦粉)中呕吐毒素最大限量标准为1000μg/kg。目前国际上还没有统一的呕吐毒素限量标准，因此日粮中呕吐毒素摄入量与人及动物健康风险评估仍需进一步研究。

随着人们对食品安全的关注及对呕吐毒素科学研究的深入，对其纯品的需求量愈来愈大。目前国内使用的呕吐毒素标准品均为美国(Sigma)、奥地利(Romer)等国外进口产品，价格昂贵约为1000元/mg，如果单纯依靠购买国外标准物来进行相关食品检测，不仅花费大量的财力，而且很容易受到国外的限制。另外开展相关方面科学研究，也需要大量高纯度的呕吐毒素。如果不能自主生产会严重限制相关研究的进展。经检索我国至今尚未有口区吐毒素标准物质制备方面的报道。因此，迫切需要开发呕吐毒素纯化制备方法来填补国内空白。

目前呕吐毒素的制备方法包括(1)Colvin等利用化学合成方法合成脱氧雪腐镰刀烯醇，但是合成化合物的纯度及产率并不适用于工业化生产。(2)A1tpeter等和Ehrlich等分别开发出一种脱氧雪腐镰刀烯醇的制备方法，但是这些方法需要经过复杂的多步柱层析，生产周期长，浪费大量的人力物力，而且获得的产物纯度不高。(3)Witt等和Clifford等分别建立了一种基于硅胶柱分离的色谱方法，获得了纯度较为理想的脱氧雪腐镰刀烯醇。然而这种方法每次进样后需反复冲洗色谱柱，或者样品需要两次进行色谱柱分离，很大程度上增加了生产成本和生产周期。(4)He等开发了一种基于液液萃取的高速逆流液相色谱方法进行脱氧雪腐镰刀烯醇的分离纯化，此方法操作简单，色谱分离可大体积上样，但是数次进样后(＜8次)其色谱分离系统需要更新，这极大限制了其工业化生产效率。

随着色谱技术的发展，目前的高效液相色谱柱有更加优异的分离效率及柱效，可以在较短时间内从复杂基质中更好地分离纯化目标化合物。在满足纯度要求的同时，极大程度地缩减了生产成本，适合于大规模的工业化生产。因此有必要利用此技术开发出一种快速、经济且可大量制备高纯的脱氧雪腐镰刀烯醇的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，该方法工艺简单、生产周期短、工业化生产成本低。同时所制备的呕吐毒素纯度高可作为标准物质应用于粮食及食品安全监控。

本发明提供的一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，具体包括如下步骤：

(1)镰刀菌在马铃薯培养基上黑暗条件下28℃培养3d，然后将菌丝接种至200m1羧甲基纤维素培养基在200r/min，25℃条件下振动培养1d获得镰刀菌孢子液；

(2)称取一定量谷物类培养基于锥形瓶中，然后加入去离子水高温高压灭菌后，将培养好的镰刀菌或孢子液接种至培养基。置28℃条件下避光培养10d。

(3)培养结束后，将大米培养基置于50℃干燥箱中干燥24h，然后使用高速粉碎机粉碎，称取适量粉碎后的样品置于锥形瓶中加入不同比例甲醇乙腈水溶液提取，合并提取液于4℃条件下放置12h以沉淀颗粒性物质，Whatman No.4滤纸过滤；在50℃下旋蒸后，使用乙酸乙酯萃取1-6次，萃取液50℃条件下水浴旋蒸浓缩至干，得到固体物质。

(4)将固体物质溶解后，过0.22μm滤膜后，使用制备液相进行分离纯化。流动相为甲醇和水(30/70，v/v)，流速为3.5mL/min，检测波长为220nm，进样量为2mL，收集10.2min至10.8min馏分液，将所有馏分液混合50℃水浴旋蒸后置于冷冻真空干燥机干燥，获得白色针状固体。

(5)将(4)获得的固体残留物溶解在乙酸乙酯中，加入少量呕吐毒素标准物质后置于4℃冰箱中数天有固体结晶状物体出现，去除母液后获得结晶的呕吐毒素。

(6)将获得的呕吐毒素通过两种不同体系的高效液相色谱技术(UPLC-PDA和UPLC-UV)进行分析确定其纯度为98.82％～99.93％；

通过液相串联质谱技术在负离子模式下全扫描分析(m/z100～1000)得到[M-H]^-＝295.05，[M+CH₃COO-]^-＝355.10，确定其分子量为296.0，同时与sigma公司呕吐毒素标准物比较没有其他加合离子出现，间接证明获得了很高纯度的化合物；负离子模式下产物离子扫描(m/z295.05)分析可得到主要产物离子：277.40，218.18和138.10，与标准物质图谱一致，确证了化合物结构；

通过¹H和¹³C核磁共振波谱分析，确证其化学结构图谱与标准物质完全一致。

与现有技术相比，本发明有以下有益的技术效果：

(1)获得高产脱氧雪腐镰刀烯醇的镰刀菌菌株，产毒量高达2.45mg/g，优于先前所有报道的菌株。

(2)优化样品前处理方法，获得的固体培养基通过置干燥中培养烘干，获得的干燥培养物占原培养基30％，这样极大的节省了有机试剂的使用量及样品处理的时间，很大程度上降低了生产成本。

(3)优化选择出最优的提取溶剂及提取次数，使培养的固体培养基中脱氧雪腐镰刀烯醇得到最大程度的回收。

(4)纯化过程使用制备液相系统，可在24h内从176g固体培养基中获得268mg脱氧雪腐镰刀烯醇，消耗有机试剂甲醇约0.9L。极大地降低生产成本及提高生产效率。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明

图1为UPLC-PDA图谱：(a)呕吐毒素粗提物；(b)纯化的呕吐毒素；(c)呕吐毒素标准品(来自sigma公司)；(d)呕吐毒素标准品与纯化的呕吐毒素3D图谱，扫描波长范围200nm～400nm。

图2为UPLC-UV图谱：(a)纯化的呕吐毒素；(b)呕吐毒素标准品；(c)空白溶剂；

图3为液相串联质谱分析图谱：(a)呕吐毒素标准品(来自sigma公司)全扫描图谱；(b)纯化的呕吐毒素全扫描图谱；(c)呕吐毒素标准品产物离子扫描图谱；(d)纯化的呕吐毒素产物离子扫描图谱。

图4为纯化的呕吐毒素¹H(a)和¹³C(b)核磁共振图谱。

具体实施方式

下面给出的实施例对本发明作进一步的说明。本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读本发明实例后，本领域技术人员能领会并在公开的实施中做许多改变也可获得相同或类似的结果，均属于本发明的构思和范围。更具体的说，有些试剂或处理方法可替代本文所公开的试剂及方法而得到相同或类似结果。所有类似的取代或修饰均被认为本发明的构思和范围，所有上述等价形式均属于本发明权利要求书说限定的范围。

实施例1：镰刀菌在马铃薯培养基上黑暗条件下28℃培养3d，然后将菌丝接种至200m1羧甲基纤维素培养基在200r/min，25℃条件下振动培养1d获得禾谷镰刀菌孢子液，通过血球计数板计数调节浓度至1.0×10⁵个/ml保存待用。称取50g大米于200m1锥形瓶中，加入20m1去离子水，在121℃高温灭菌30min；将菌块或孢子液接种至灭菌的大米培养基，放置在28℃条件下培养10d；将大米培养基置于50℃干燥箱中干燥24h，然后使用高速粉碎机粉碎成均匀的粉末。称取100g干燥粉末置于锥形瓶中加入不同提取溶剂(乙腈，84％乙腈水，50％乙腈水，甲醇，70％甲醇水，50％甲醇水，乙酸乙酯，水)提取，提取液于4℃条件下放置12h以沉淀颗粒性物质，Whatman No.4滤纸过滤；在50℃下水浴旋蒸至提取液减少约4/5后，使用乙酸乙酯萃取1次，合并萃取液50℃水浴旋蒸浓缩至干，得到油黄色固体物质。将获得的固体物质溶解在40m1甲醇中，过0.22μm滤膜后，使用制备液相进行分离纯化。流动相为甲醇和水(30/70，v/v)，等度洗脱，检测波长为220nm，进样量为2ml，收集10.2min至10.8min馏分液，将所有馏分液混合50℃水浴旋蒸后置于冷冻真空干燥机中干燥，获得白色针状固体。获得的固体残留物溶解在乙酸乙酯中，加入少量呕吐毒素标准物质后置于4℃冰箱中数天有固体结晶状物体出现，去除母液后获得结晶的区吐毒素。

实施例2：禾谷镰刀菌孢子液制备同实施例1。称取50g玉米于200m1锥形瓶中，加入20m1去离子水，在121℃高温灭菌30min；其余步骤同实施例1。

实施例3：禾谷镰刀菌孢子液制备同实施例1，称取50g小麦于200m1锥形瓶中，加入20ml去离子水，在121℃高温灭菌30min；其余步骤同实施例1。

实施例4：禾谷镰刀菌孢子液制备同实施例1，称取50g荞麦于200m1锥形瓶中，加入20ml去离子水，在121℃高温灭菌30min；其余步骤同实施例1。

实施例5：禾谷镰刀菌孢子液制备同实施例1，称取50g燕麦于200ml锥形瓶中，加入20ml去离子水，在121℃高温灭菌30min；其余步骤同实施例1。

实施例6：禾谷镰刀菌孢子液制备同实施例1，称50g高粱于200ml锥形瓶中，加入20ml去离子水，在121℃高温灭菌30min；其余步骤同实施例1。

Claims

1.一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，其特征在于：

该方法包括如下步骤：

(1)将镰刀菌及镰刀菌孢子液接种至灭菌后的固体培养基进行产毒培养；

(2)获得的固体培养基经过提取、过滤及旋转蒸发，然后使用有机溶剂进行萃取及脱脂溶剂去除脂肪，最后将萃取液浓缩至干获得残渣；

(3)将残渣溶解后通过制备液相进行分离纯化，收集馏分液浓缩蒸干再溶解后重结晶获得脱氧雪腐镰刀烯醇；

(4)通过紫外分光光度计，高效液相色谱，超高压液相色谱，液相串联质谱及核磁共振波谱等仪器进行该化合物的纯度分析及结构确证。

2.如权利要求1所述一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，其特征在于所述步骤(1)中的镰刀菌及镰刀菌孢子液为可产生脱氧雪腐镰刀烯醇的镰刀菌。

3.如权利要求1所述一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，其特征在于所述步骤(1)中的固体培养基为：包括但不限于大米、玉米、小麦、燕麦、荞麦、高梁等粮食类。

4.如权利要求1所述一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，其特征在于所述步骤(2)中提取方法包括但不限于超声提取。

5.如权利要求4所述一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，其特征在于所述提取溶剂为可以是84％乙腈/水，及其它有机溶剂或其含水溶液。

6.如权利要求1所述一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，其特征性为步骤(2)中有机溶剂可以是乙酸乙酯，及其它可从水溶液中萃取脱氧雪腐镰刀烯醇的有机试剂；脱脂溶剂可以是正己烷、石油醚，及其它不能溶解脱氧雪腐镰刀烯醇的有机溶剂。

7.如权利要求1所述一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，其特征性为：步骤(3)中制备液相色谱柱为包括但不限于C₁₈，C₈色谱柱，流动相包括但不限于甲醇、乙腈或含水溶液。