CN102391967B

CN102391967B - 一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用

Info

Publication number: CN102391967B
Application number: CN 201110366034
Authority: CN
Inventors: 张立新; 宋福行; 陈彩霞; 郭徽; 傅成章; 代焕琴; 刘雪婷; 谢峰; 杨娜; 余珂; 王倩
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2031-11-17
Also published as: CN102391967A

Abstract

本发明公开了一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用。本发明提供的菌株为链霉菌MS449，它的保藏编号为CGMCC No.5452。本发明提供的链霉菌MS449在没有经过任何培养基及发酵条件优化的前提下，其放线菌素X₂，放线菌素D和放线菌素X_0β的产量分别可达1.92、1.77和0.15mg/ml，均高于目前已见报道的放线菌素生产菌株的产量。本发明所提供的生产放线菌素的方法是发酵链霉菌MS449，发酵稳定、化合物分离工艺简便、产率高。本发明提供的菌株具有很好的工业化潜力和前景。

Description

一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用

技术领域

本发明涉及一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用。

背景技术

癌症是一种非常古老的疾病，伴随着整个人类发展的历史，严重威胁着人类的健康与生命。放线菌素能够通过影响核酸合成、诱导细胞分化、诱导细胞凋亡、抑制一些蛋白酶活性及影响细胞周期等方式发挥其抗肿瘤活性。放线菌素还可通过与DNA结合抑制RNA合成而发挥抗菌、抗病毒的作用。

放线菌素D已经成为较为理想的抗肿瘤药物，广泛应用于恶性肿瘤的临床治疗、结合手术治疗和放射治疗，对肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、霍奇金病、绒毛膜癌及睾丸肿瘤的治疗有效，尤其是对儿童肾母细胞瘤有很好的治疗效果，也常与其他药物联合用于肿瘤的治疗与研究。

放线菌素X₂除了更好的抗肿瘤作用外，对病毒性心肌炎最常见的病原体柯萨奇病毒(CVB3)有显著地抑制作用。

上世纪后期人们开始对放线菌素进行深入研究，主要集中于放线菌素的生物学功能和临床药理学研究，目前放线菌素已不仅是临床上重要的抗肿瘤药物，也越来越成为分子生物学和细胞生物学研究的工具。

放线菌素的产生菌已见报道的有近30种，但基本上都是单一成分高产，且在这些产生菌中，放线菌素D的产量最高为野生菌株0.21mg/ml、诱变菌株0.85mg/ml，放线菌素X₂的最高产量为0.15mg/ml。

发明内容

本发明的目的是提供一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用。

本发明提供的链霉菌(Streptomyces sp.)MS449，已于2011年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.5452。

本发明还保护所述链霉菌MS449在生产放线菌素中的应用。所述放线菌素可为放线菌素X₂、放线菌素D和放线菌素X_0β中的至少一种。

本发明还保护一种种子培养基，是通过如下方法制备得到的培养基：将20-30g可溶性淀粉、0.2-0.6g L-天冬酰胺、0.5-1.0g KNO₃、0.2-0.6g K₂HPO₄·H₂O、0.2-0.6gNaCl和0.2-1.0g MgSO₄·7H₂O用水定容至1L。所述种子培养基的pH可为7.0-7.5。所述种子培养基具体可通过如下方法制备得到：将25g可溶性淀粉、0.4g L-天冬酰胺、0.8g KNO₃、0.4g K₂HPO₄·H₂O、0.4g NaCl和0.6g MgSO₄·7H₂O用水定容至1L。

本发明还保护一种发酵培养基，是通过如下方法制备得到的培养基：将5-15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3-(N-吗啉基)丙磺酸用水定容至1L。所述发酵培养基的pH可为7.0-7.5。所述发酵培养基培养基具体可通过如下方法制备得到：将10g葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和20g 3-(N-吗啉基)丙磺酸用水定容至1L。

本发明还保护一种制备放线菌素的方法，是发酵所述链霉菌MS449，得到放线菌素。所述发酵的条件具体可为25-30℃、140-200rpm、6-20天(如6-15天)。所述发酵的条件具体可为28℃、180rpm、15天。

所述方法具体可包括如下步骤：将所述链霉菌MS449的种子液接种至所述发酵培养基中发酵并收获发酵液。

所述方法中，可将5ml所述种子液接种至100ml所述发酵培养基中。所述种子液具体可通过如下方法制备：将所述链霉菌MS449接种于所述种子培养基中，25-30℃(如28℃)、140-200rpm(如180rpm)培养2-6天(如96小时)，得到种子液。

所述方法还可包括如下步骤：

(1)将所述发酵液离心(离心参数具体可为：4℃、8000转/min、15min)，分别收集上清液和沉淀；

(2)将步骤(1)获得的沉淀用丙酮浸提(可室温静置10小时)，离心(离心参数具体可为：4℃、8000转/min、15min)并收集上清液；

(3)将步骤(1)的上清液和步骤(2)的上清液合并，即为放线菌素粗提液(菌株粗提液)；

(4)将所述放线菌素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂，依次用体积百分比为40％、60％和80％的丙酮水溶液洗脱(各一升)，依次收集用60％和80％丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液，依次命名为洗脱液乙和洗脱液丙；

(5)将所述洗脱液乙蒸干并用丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC；反相HPLC参数：采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column(5μm，9.4×250mm)；流动相为体积百分比为60％的甲醇水溶液，流速为2.0ml/min；收集保留时间为29.2-29.9min的洗脱液，蒸干后得到放线菌素X_0β；

将所述洗脱液丙蒸干用丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC；反相HPLC参数：采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column(5μm，9.4×250mm)；流动相为体积百分比为70％的甲醇水溶液，流速为2.0ml/min；收集保留时间为38.1-39.6min的洗脱液，蒸干后得到放线菌素X2；收集保留时间为39.9-40.7min的洗脱液，蒸干后得到放线菌素D。

本发明提供的链霉菌MS449在没有经过任何培养基及发酵条件优化的前提下，其放线菌素X₂，放线菌素D和放线菌素X_0β的产量分别可达1.92、1.77和0.15mg/ml，均高于目前已见报道的放线菌素生产菌株的产量。本发明所提供的生产放线菌素的方法是发酵链霉菌MS449，发酵稳定、化合物分离工艺简便、产率高。本发明提供的菌株具有很好的工业化潜力和前景。

附图说明

图1为链霉菌MS449在斜面培养基上28℃培养28天的照片。

图2为链霉菌MS449在扫描电镜(Quanta 200)10000×下观察的照片。

图3为放线菌素粗提液的HPLC分析图。

图4为活性组份甲(A)、活性组份乙(B)和活性组份丙(C)的质谱图。

图5为活性组份甲(A)、活性组份乙(B)和活性组份丙(C)的紫外光谱图。

图6为活性组份甲、活性组份乙和活性组份丙的碳信号归属。

图7为每毫升发酵液中活性组份甲、活性组分乙和活性组分丙的产量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。可溶性淀粉购自北京化工厂，产品目录号为K0800034。葡萄糖购自北京现代东方精细化学品有限公司(HG)。稷粉购自农贸市场。棉籽蛋白粉(药媒)购自北京中棉紫光生物科技有限公司。MOPS即3-(N-吗啉基)丙磺酸，购自北京江晨生物。HP-20大孔吸附树脂(三菱)：购自北京慧德易科技有限公司。Agilent ZorbaxXDB C-8 column：购自北京慧德易科技有限公司。Agilent ZORBAX XDB C-18 column：购自北京慧德易科技有限公司。

实施例1、链霉菌MS449的分离和鉴定

一、链霉菌MS449的分离

菌株分离培养基的组成如下(以下均为质量百分比)：淀粉2％、L-天冬素0.05％、KNO₃ 0.1％、K₂HPO₄·H₂O 0.05％、NaCl 0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、CaCO₃ 0.1％、Agar1.8％和H₂O；pH值为7.5。

取1.0g土样(采自中国南海海底泥的泥土样品)，放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，180rpm摇2h，于20KHz、100W功率超声2min；取1.0ml悬浊液，放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，混匀；取1.0ml悬浊液，放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，混匀；系列稀释10^-3和10^-4；盖紧管盖，于100℃保温1h，取0.2ml涂板。获得了一株菌，将其命名为菌株MS449。

菌株MS449的保藏方法：于25％甘油冻存管-80℃保藏。

二、链霉菌MS449的鉴定

菌株MS449在斜面培养基上28℃培养28天的照片见图1。菌株MS449在扫描电镜(Quanta 200)10000×下观察的照片见图2。在斜面培养基上培养28天产生圆柱形孢子，表面光滑，大小均匀(0.5-0.7μm×1.5-2.0μm)。气生菌丝呈黄白色，表面带刺，基内菌丝呈黄色，有黄色色素产生。

根据菌落形态特征，将菌株MS449鉴定为链霉菌。

链霉菌(Streptomyces sp.)MS449已于2011年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5452。

实施例2、应用链霉菌MS449生产放线菌素

斜面培养基的制备方法如下(pH7.0)：将25g可溶性淀粉、0.4g L-天冬酰胺、0.8g KNO₃、0.4g K₂HPO₄·H₂O、0.4g NaCl、0.6g MgSO₄·7H₂O和18g琼脂用水溶解并用水定容至1L。

种子培养基的制备方法如下(pH7.5)：将25g可溶性淀粉、0.4g L-天冬酰胺、0.8g KNO₃、0.4g K₂HPO₄·H₂O、0.4g NaCl和0.6g MgSO₄·7H₂O用水溶解并用水定容至1L。

发酵培养基的制备方法如下(pH7.0)：将10g葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和20g MOPS用水溶解并用水定容至1L。

一、菌株发酵

1、种子培养

(1)将链霉菌MS449的孢子接种于斜面培养基，28℃培养8天(到气生菌丝丰满)，即得到斜面菌种。

(2)在500ml玻璃瓶中装入100ml种子培养基。

(3)从步骤(1)的斜面挖块接种至步骤(2)的培养基，28℃、180rpm培养96小时，得到种子液。

2、发酵培养

(1)在500ml的三角瓶中加入100ml发酵培养基。

(2)在步骤(1)的培养基中接种5ml步骤1得到的种子液，28℃、180rpm培养15天，收获发酵液(发酵液为容器内的所有物质)。

二、有效成分的分离纯化

1、将1升步骤一得到的发酵液4℃条件下离心15min(8000转/min)，分别收集上清液和沉淀(菌体)。

2、将步骤1获得的菌体用350mL丙酮室温条件下浸泡过夜(约10小时)，4℃条件下离心15min(8000转/min)，收集上清液。

3、将步骤1的上清液和步骤2的上清液合并，即为放线菌素粗提液(菌株粗提液)。

4、将50ml放线菌素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂柱，用100％丙酮洗脱，浓缩洗脱液，并进行HPLC分析。

HPLC参数：Agilent Zorbax XDB C-8column(5μm，4.6×150mm)；体积百分比为70％的甲醇水溶液为流动相，流速为1.0ml/min；检测波长为254nm。

HPLC图谱见图3。粗提液中存在三种成分，保留时间分别为8.6min、14.7min和16.9min。

5、将步骤3得到的菌株粗提液(约1300ml)上样于300ml HP-20大孔吸附树脂，先用800ml水洗脱，然后依次用体积百分比为40％、60％和80％的丙酮水溶液(各1升)洗脱，依次收集用60％和80％丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液，依次命名为洗脱液乙(约1升)和洗脱液丙(约1升)。

6、将洗脱液乙通过旋转蒸发仪除去丙酮并蒸干，用3mL丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC。

反相HPLC参数：Agilent ZORBAX XDB C-18 column(5μm，9.4×250mm)；体积百分比为60％的甲醇水溶液为流动相，流速为2.0ml/min；检测波长为254nm。

收集保留时间为29.2-29.9min的洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，得到活性组分甲(每毫升步骤一得到的发酵液中含有0.15mg活性组分甲)。

7、将洗脱液丙通过旋转蒸发仪除去丙酮并蒸干，用6mL丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC。

反相HPLC参数：Agilent ZORBAX XDB C-18 column(5μm，9.4×250mm)；体积百分比为70％的甲醇水溶液为流动相，流速为2.0ml/min；检测波长为254nm。

收集保留时间为38.1-39.6min的洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，得到活性组分乙(每毫升步骤一得到的发酵液中含有1.92mg活性组分乙)。

收集保留时间为39.9-40.6min的洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，得到活性组分丙(每毫升步骤一得到的发酵液中含有1.77mg活性组分丙)。

三、有效成分的鉴定

1、外观

活性组份甲、活性组分乙和活性组分丙均为无定形桔红色粉末。

2、溶解性

活性组份甲、活性组分乙和活性组分丙均易溶于甲醇、丙酮、氯仿，不溶于水。

3、质谱

活性组份甲的质谱图见图4A。ESI-MS质谱检测其[M+H]+为1271.3，与文献报道放线菌素X_0β的分子离子峰一致。

活性组分乙的质谱图见图4B。ESI-MS质谱检测其[M+H]+为1269.1，[M+Na]+为1291.1。与文献报道放线菌素X2的分子离子峰一致。

活性组分丙的质谱图见图4C。ESI-MS质谱检测其[M+H]+为1255.1，[M+Na]+为1277.1。与文献报道放线菌素D的分子离子峰一致。

4、紫外光谱

紫外光谱测试仪器为Mariner System 5304instrument。

活性组份甲的紫外光谱图见图5A，在238和444.0nm处有最大吸收峰。

活性组份乙的紫外光谱图见图5B，在239和445.0nm处有最大吸收峰。

活性组份丙的紫外光谱图见图5C，在240和444.0nm处有最大吸收峰。

5、核磁信号归属

核磁图谱测试仪器为Varian Inova 600MHz，所用溶剂为氘代丙酮(acetone-d6)。活性组份甲、活性组份乙和活性组份丙的碳信号归属如表1和图6所示。与文献报道一致。

表1活性组份甲、活性组份乙和活性组份丙的碳信号归属

综合上述结果：所述活性组份甲的结构式见式(I)，为放线菌素X_0β；所述活性组分乙的结构式见式(II)，为放线菌素X2；所述活性组分乙的结构式见式(III)，为放线菌素D。

式(I)；

式(II)；

式(III)。

实施例3、应用链霉菌MS449生产放线菌素

一、菌株发酵

1、种子培养

同实施例2的步骤一的1。

2、发酵培养

(1)在500ml的三角瓶中分装100ml发酵培养基。

(2)在步骤(1)的培养基中接种5ml步骤1得到的种子液，28℃、180rpm培养，间隔时间(每24小时取样1次，每24小时计为1天)取样，收获发酵液(发酵液为容器内的所有物质)。

二、有效成分的分离纯化

同实施例2的步骤二。

每毫升发酵液中活性组份甲(放线菌素X_0β)、活性组分乙(放线菌素X2)和活性组分丙(放线菌素D)的产量见图7。

Claims

1.链霉菌（Streptomyces sp.）MS449，它的保藏编号为CGMCC No.5452。

2.权利要求1所述链霉菌MS449在生产放线菌素中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述放线菌素为放线菌素X₂、放线菌素D和放线菌素X_0β中的至少一种。

4.用于培养权利要求1所述链霉菌MS449的培养基，是通过如下方法制备得到的培养基：将5-15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3-(N-吗啉基）丙磺酸用水定容至1L。

5.一种制备放线菌素的方法，是发酵权利要求1所述链霉菌MS449，得到放线菌素。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述链霉菌MS449的种子液接种至权利要求4所述培养基中发酵并收获发酵液。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述种子液的制备方法如下：将权利要求1所述链霉菌MS449接种于下述培养基中，25-30℃、140-200rpm培养2-6天，得到种子液；

通过如下方法制备得到所述培养基：将20-30g可溶性淀粉、0.2-0.6gL-天冬酰胺、0.5-1.0g KNO₃、0.2-0.6g K₂HPO₄·H₂O、0.2-0.6g NaCl和0.2-1.0g MgSO₄·7H₂O用水定容至1L。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：

（1）将所述发酵液离心，分别收集上清液和沉淀；

（2）将步骤（1）获得的沉淀用丙酮浸提，离心并收集上清液；

（3）将步骤（1）的上清液和步骤（2）的上清液合并，即为放线菌素粗提液；

（4）将所述放线菌素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂，依次用体积百分比为40%、60%和80%的丙酮水溶液洗脱，依次收集用60%和80%丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液，依次命名为洗脱液乙和洗脱液丙；

（5）将所述洗脱液乙蒸干并用丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC；反相HPLC参数：采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column；流动相为体积百分比为60%的甲醇水溶液，流速为2.0ml/min；收集保留时间为29.2-29.9min的过柱后洗脱液，得到放线菌素X_0β；

将所述洗脱液丙蒸干用丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC；反相HPLC参数：采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column；流动相为体积百分比为70%的甲醇水溶液，流速为2.0ml/min；收集保留时间为38.1-39.6min的过柱后洗脱液，得到放线菌素X2；收集保留时间为39.9-40.7min的过柱后洗脱液，得到放线菌素D。