CN103351371B - 通过麦粒培养基制备纯化zen毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过麦粒培养基制备纯化ZEN毒素的方法，利用ZEN毒素苯环结构上羟基所具有的酸性，从接种禾谷镰刀菌的麦粒培养基中提取含有ZEN毒素的粗提液，其特征在于：将含有ZEN毒素的粗提液通过氢氧化钠过量碱化，使ZEN毒素溶解于水中，与有机溶剂分离；通过酸化调节含有ZEN毒素的水相至pH2.0~7.0，恢复结构，加入有机试剂使ZEN毒素重新溶解于有机试剂中，与水相分离，浓缩有机试剂得到ZEN粗毒素；采用制备型液相色谱对ZEN毒素在液相色谱上的紫外吸收峰进行回收，获得制备的ZEN毒素。
Description
技术领域
本发明涉及一种玉米赤霉烯酮（ZEN）的制备纯化方法，尤其是一种利用ZEN毒素理化性质进行制备纯化ZEN毒素的工艺。
背景技术
真菌毒素是病原菌侵染植物产生的次级代谢产物，在所有的真菌毒素中玉米赤霉烯酮是已知毒性和污染频率比较高的天然物质之一，是最为常见的一种毒素。玉米赤霉烯酮（ZEN）又称F2毒素，是由禾谷镰刀菌产生的一种雌激素类真菌毒素，其化学名为6-（10- 羟基-6 氧基-十一碳烯基）β-雷锁酸内酯，分子量为318，白色晶体，热稳定性好，易溶于甲醇、乙腈、三氯甲烷等有机试剂，不溶于水。化学结构如下图：
其结构中含有连接在苯环上的两个羟基，使ZEN毒素具有酸性。研究表明该毒素可引起动物（猪最敏感）和人的雌激素过多综合征，还具有生殖发育毒性、免疫毒性、基因毒性和可疑致癌性等。饲料和食品生产中所用的谷物（如玉米、小麦）是ZEN产生的最好基质，其次为豆类及其制品。谷物等在种植期、收获期、收获后的储藏期以及其成品储存、使用等环节中，都有可能受到ZEN的污染。
由于真菌毒素ZEN在小麦、玉米等谷物中普遍存在，除了严重影响粮食的产量和品质，威胁人畜的健康以外，还限制我国农产品的出口。澳大利亚、发过和俄罗斯等已制定了食品和动物饲料中玉米赤霉烯酮的最大允许限量为30-1000μg/kg。进口国家对真菌毒素限量标准阻碍了这类农产品的出口。因此对于ZEN毒素的检测和控制越来越引起广泛的关注。
无论对ZEN毒素进行产生检测研究还是控制研究，都需要大量的毒素样品。需要有一种能够大规模、安全、廉价的在实验室制备纯化ZEN毒素的方法和技术。目前，已报道的实验室纯化ZEN毒素的方法中涉及的培养基一般都是麦粒，采用这种培养基培养需要把禾谷镰刀菌接种于麦粒，28℃光培养25天后，采用乙腈/水（80:20）进行ZEN毒素的提取。采用这种方法获得ZEN毒素，由于小麦培养过程中产生各种代谢产物，毒素粗提取液中往往存在大量的杂质，这就导致提取的毒素步骤复杂，操作时间长，而且会造成后期的纯化困难，国内外未见ZEN毒素制备方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于：针对ZEN毒素检测和控制研究需要大量的毒素标品，目前通过麦粒培养基提取的ZEN毒素存在杂质多、色素浓度高等实际问题，提供一种新的制备和纯化ZEN毒素的方法，为ZEN毒素检测和控制研究提供毒素基础。
本发明的目的是这样实现的：一种通过麦粒培养基制备纯化ZEN毒素的方法，利用ZEN毒素苯环结构上羟基所具有的酸性，从接种禾谷镰刀菌的麦粒培养基中提取含有ZEN毒素的粗提液，其特征在于：将含有ZEN毒素的粗提液加入过量的氢氧化钠碱化，使ZEN毒素溶解于水中，与有机溶剂分离；通过酸化调节含有ZEN毒素的水相至pH2.0~7.0，恢复结构，加入有机试剂使ZEN毒素重新溶解于有机试剂中，与水相分离，浓缩有机试剂得到ZEN粗毒素；采用制备型液相色谱对ZEN毒素在液相色谱上的紫外吸收峰进行回收，获得制备的ZEN毒素，具体的步骤是：
a) 将禾谷镰刀菌活化后接到绿豆汤液体培养基中，28℃摇床振荡培养5天后用灭菌纱布过滤得到禾谷镰刀菌孢子液，孢子液浓度为1×107 个/ml ，取2ml孢子液接到200g麦粒培养基中，28℃光培养25天，获得含有ZEN毒素的培养物；
b) 称取100g含有ZEN毒素的培养物，加入500ml体积比80:20的乙腈/水提取液，摇床室温振荡30分钟，离心后收集含有ZEN毒素的粗提液；
c) 将含有ZEN毒素的粗提液旋转蒸干后加入20ml色谱纯甲醇重新溶解，取2ml用于粗提液的检测，重新蒸干剩余粗提液后加入50ml体积比1:1的三氯甲烷/水溶液重新溶解，加入过量的氢氧化钠固体，直到氢氧化钠不能溶解为止，混匀分层后取上层提取物；
d) 将c步骤上层提取物装入试管，然后加入盐酸酸化，调节至pH2.0~7.0后加入等体积的三氯甲烷，混匀分层后取下层，旋转蒸干下层后重新溶解在2ml色谱纯的甲醇中，采用高效液相色谱检测pH2.0~7.0条件下ZEN毒素含量；高效液相色谱检测条件为：流速V=0.6ml/min，紫外吸收波长λ=236nm，流动相=甲醇：水的体积比80:20，利用制备型液相色谱的馏分收集器收集在8.00-8.70 min之间含有ZEN毒素的流动相，获得纯化的ZEN毒素；
所述的绿豆汤培养基为：准确称取绿豆3g，加入100ml单蒸水，电磁炉加热至绿豆表皮开始破裂，纱布过滤后定容至100ml，装入250ml三角瓶，121℃灭菌30分钟；所述的麦粒培养基为：将麦粒经单蒸水浸泡过夜后，去除单蒸水将湿麦粒装入灭菌袋中，121℃灭菌30分钟。
在本发明中：最佳方案是：d步骤是将3ml的c步骤上层提取物装入试管，加入盐酸酸化，调节至pH6.0后每管加入3ml三氯甲烷，混匀分层后取下层，旋转蒸干下层后重新溶解在2ml色谱纯的甲醇中，采用高效液相色谱检测pH6.0条件下ZEN毒素含量；高效液相色谱检测条件为：流速V=0.6ml/min，紫外吸收波长λ=236nm，流动相=甲醇：水的体积比80:20；利用制备型液相色谱的馏分收集器收集在8.00-8.70 min之间含有ZEN毒素的流动相，获得纯化的ZEN毒素，10g培养物可以制备0.2μg ZEN毒素。
在本发明中：a)步骤使用的禾谷镰刀菌为禾谷镰刀菌GZ3639。
在本发明中：采用高效液相色谱—质谱联用技术对纯化的ZEN毒素进行鉴定，结果表明，ZEN毒素的纯度为98%以上。
本发明的优点在于：利用ZEN毒素苯环结构上羟基所具有的酸性，通过碱化酸化处理，简化提取纯化步骤，获得的毒素纯度更高，杂质更少。
本发明的优点还在于：利用ZEN毒素的理化性质，有机试剂的用量少且可重复使用。
附图说明
图1、禾谷镰刀菌GZ3639粗提液和纯化后的高效液相色谱图。
图中：A为禾谷镰刀菌GZ3639生产粗提液的高效液相色谱图；B为粗提液在pH6.0酸化条件下纯化ZEN粗毒素的高效液相色谱图。
图2、高效液相色谱鉴定制备的ZEN毒素。
图中：A为ZEN标准品高效液相色谱图；B为制备的ZEN毒素高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1
本发明涉及的培养基：
绿豆汤培养基：准确称取绿豆3g，加入100ml单蒸水，电磁炉加热至绿豆表皮开始破裂，纱布过滤后定容至100ml，装入250ml三角瓶，121℃灭菌30分钟。
麦粒培养基：将麦粒经单蒸水浸泡过夜后，去除单蒸水将湿麦粒装入灭菌袋中，121℃灭菌30分钟。
实施例2
禾谷镰刀菌GZ3639（该菌株由美国农业部真菌毒素研究中心馈赠）
将禾谷镰刀菌GZ3639活化后接到绿豆汤液体培养基中，28℃摇床振荡培养5天后用灭菌纱布过滤得到禾谷镰刀菌孢子液，孢子液浓度为1×107 个/ml ，取2ml孢子液接到200g麦粒培养基中，28℃光培养25天，获得含有ZEN毒素的培养物；称取100g含有ZEN毒素的培养物，加入500ml体积比80:20的乙腈/水提取液，摇床室温振荡30分钟，离心后收集含有ZEN毒素的粗提液；将含有ZEN毒素的粗提液旋转蒸干后加入20ml色谱纯甲醇重新溶解，取2ml用于粗提液的检测，重新蒸干剩余粗提液后加入50ml体积比1:1的三氯甲烷/水溶液重新溶解，加入过量的氢氧化钠固体，直到氢氧化钠不能溶解为止，混匀分层后取上层提取物；将3ml的c步骤上层提取物装入6组试管，然后加入盐酸酸化，将每组试管分别调节至pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，然后加入3ml的三氯甲烷，分别混匀分层后取下层，旋转蒸干下层后重新溶解在2ml色谱纯的甲醇中，采用高效液相色谱检测pH2.0~7.0条件下ZEN毒素含量（高效液相色谱检测条件为：流速V=0.6ml/min，紫外吸收波长λ=236nm，流动相中甲醇与水的体积比为80:20），结果见表1。
表1：高效液相色谱检测不同pH条件下ZEN粗毒素含量
通过表1的结果发现在pH6.0条件下，ZEN毒素含量最高、杂峰最少（ZEN毒素含量平均值为1.984μg/g，杂峰个数为5个），确定pH6.0为最佳酸化条件。
本实施例中提取的含有ZEN毒素的粗提液经液相色谱检测发现，杂质峰较多且色素浓度高，见图1A；通过本发明的提纯方法，在pH6.0酸化条件下获得的ZEN粗毒素经高效液相色谱检测，杂质峰数量最少且去色素效果最好（保留时间为8.162分钟），见图1B。
实施例3
将禾谷镰刀菌GZ3639活化后接到绿豆汤液体培养基中，28℃摇床振荡培养5天后用灭菌纱布过滤得到禾谷镰刀菌孢子液，孢子液浓度为1×107 个/ml ，取2ml孢子液接到200g麦粒培养基中，28℃光培养25天，获得含有ZEN毒素的培养物；称取10g含有ZEN毒素的培养物，加入50ml体积比80:20的乙腈/水提取液，摇床室温振荡30分钟，离心后收集含有ZEN毒素的粗提液；将含有ZEN毒素的粗提液旋转蒸干后加入5ml体积比1:1的三氯甲烷/水溶液重新溶解，加入过量的氢氧化钠固体，直到氢氧化钠不能溶解为止，混匀分层后取上层提取物；将上层提取物装入试管，然后加入盐酸酸化，调节至pH6.0后加入3ml的三氯甲烷，混匀分层后取下层，旋转蒸干下层后重新溶解在2ml色谱纯的甲醇中，利用制备型液相色谱的馏分收集器收集在8.00-8.70 min之间含有ZEN毒素的流动相，获得纯化的ZEN毒素。
以ZEN毒素标准品（购自Sigma公司，code: Z-2125）为对照，见图2A，对制备的ZEN毒素进行高效液相色谱检测（高效液相色谱检测条件同制备条件），见图2B；采用高效液相色谱—质谱联用技术对制备的ZEN毒素进行鉴定，10g培养物可以制备0.2μg ZEN毒素，纯度为98.1%。
以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据权利要求的记载，结合本领域基本常识，选择不同的禾谷镰刀菌，完全可以获得相同的结果，因此，这种改变禾谷镰刀菌的方式制备纯化ZEN毒素，同样属于本发明的保护范畴。
Claims (4)
1.一种通过麦粒培养基制备纯化ZEN毒素的方法，利用ZEN毒素苯环结构上羟基所具有的酸性，从接种禾谷镰刀菌的麦粒培养基中提取含有ZEN毒素的粗提液，其特征在于：具体的步骤是：
a) 将禾谷镰刀菌活化后接到绿豆汤液体培养基中，28℃摇床振荡培养5天后用灭菌纱布过滤得到禾谷镰刀菌孢子液，孢子液浓度为1×107 个/ml ，取2ml孢子液接到200g麦粒培养基中，28℃光培养25天，获得含有ZEN毒素的培养物；
b) 称取100g含有ZEN毒素的培养物，加入500ml体积比80:20的乙腈/水提取液，摇床室温振荡30分钟，离心后收集含有ZEN毒素的粗提液；
c) 将含有ZEN毒素的粗提液旋转蒸干后加入20ml色谱纯甲醇重新溶解，取2ml用于粗提液的检测，重新蒸干剩余粗提液后加入50ml体积比1:1的三氯甲烷/水溶液重新溶解，加入过量的氢氧化钠固体，直到氢氧化钠不能溶解为止，混匀分层后取上层提取物；
d) 将c步骤上层提取物装入试管，然后加入盐酸酸化，调节至pH2.0~7.0后加入等体积的三氯甲烷，混匀分层后取下层，旋转蒸干下层后重新溶解在色谱纯的甲醇中，采用高效液相色谱检测pH2.0~7.0条件下ZEN毒素含量；高效液相色谱检测条件为：流速V=0.6ml/min，紫外吸收波长λ=236nm，流动相中甲醇与水的体积比为80:20，利用制备型液相色谱的馏分收集器收集在8.00-8.70 min之间含有ZEN毒素的流动相，获得纯化的ZEN毒素；
所述的绿豆汤培养基为：准确称取绿豆3g，加入100ml单蒸水，电磁炉加热至绿豆表皮开始破裂，纱布过滤后定容至100ml，装入250ml三角瓶，121℃灭菌30分钟；所述的麦粒培养基为：将麦粒经单蒸水浸泡过夜后，去除单蒸水将湿麦粒装入灭菌袋中，121℃灭菌30分钟。
2.根据权利要求 1所述的通过麦粒培养基制备纯化ZEN毒素的方法，其特征在于：最佳方案是：d步骤是将3ml的c步骤上层提取物装入试管，加入盐酸酸化，调节至pH6.0后每管加入3ml三氯甲烷，混匀分层后取下层，旋转蒸干下层后重新溶解在2ml色谱纯的甲醇中，采用高效液相色谱检测pH6.0条件下ZEN毒素含量；高效液相色谱检测条件为：流速V=0.6ml/min，紫外吸收波长λ=236nm，流动相中甲醇与水的体积比80:20；利用制备型液相色谱的馏分收集器收集在8.00-8.70 min之间含有ZEN毒素的流动相，获得纯化的ZEN毒素，10g培养物可以制备0.2μg ZEN毒素。
3.根据权利要求 1或2所述的通过麦粒培养基制备纯化ZEN毒素的方法，其特征在于：a)步骤使用的禾谷镰刀菌为禾谷镰刀菌GZ3639。
4.根据权利要求 3所述的通过麦粒培养基制备纯化ZEN毒素的方法，其特征在于：采用高效液相色谱—质谱联用技术对纯化的ZEN毒素进行鉴定，结果表明，ZEN毒素的纯度在98%以上。
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