CN113234604B - 一种用于真菌毒素生产的混合培养基的配制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于真菌毒素生产的混合培养基的配制方法；通过采用淀粉类、油料类农副产品、农作物秸秆或残渣以及水为主要原料，经过特定加工后，获得一种新型的混合培养基；该培养基经高温灭菌后，可用于真菌培养，并进行相关真菌毒素的生产。本发明的培养基解决了目前单独采用一种农作物如大米、玉米为主要原料作为真菌培养基用于真菌培养进而获得真菌毒素方法中毒素产量低，选择性差、后处理复杂等问题，采用该发明中混配的培养基用于真菌培养进而生产真菌毒素，具有毒素产率高，选择性好，后处理简单，价格低廉的优点。

Description

一种用于真菌毒素生产的混合培养基的配制方法

技术领域

本发明涉及培养基及其配制，具体涉及一种用于真菌毒素生产的混合培养基的配制方法。

背景技术

真菌广泛分布于自然界，种类繁多、数量庞大，与人类关系十分密切，有许多真菌对人类有益，而有些真菌对人类有害。真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物。目前已知有300多种不同的真菌毒素。对人类危害严重的真菌毒素常见的主要有十几种，其中包括黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2等)、展青霉毒素(PAT)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、橘霉素(citrimin)和脱氧雪腐镰刀菌烯(DON)、伏马毒素B1、B2、B3(FB1、FB2、FB3)、赭曲霉毒素、T-2毒素等。

不同真菌可以产生相同的毒素，如黄曲霉和寄生曲霉都产生AFT；蓖麻青霉和棒形青霉都产青霉素。同一菌株由于培养基的不同其产毒能力也有很多的差别。

通过对现有专利文献的检索发现：

CN101914586公开了一种DON毒素的制备纯化方法，其利用禾谷镰刀菌生产DON毒素，使用的种子培养基为蔗糖1％、硝酸铵0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸铁0.02％、磷酸二氢钾0.2％、蛋白胨0.4％、酵母浸膏0.2％、余量为水，使用的发酵培养基为硝酸铵0.1％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.4％、蔗糖2％、甘油1％、硫酸锌0.002％、余量为水。

CN101736032公开了一种用尖孢镰刀菌培养毒素的方法及其作为除草剂的应用，其中尖孢镰刀菌培养时采用的固体培养基为：3-8％麦麸、0.5-5％豆饼粉、0.5-5％麦粉、0.1-2％硫酸铵、0-0.3％磷酸二氢钾、0-0.2％硫酸镁，自来水配制，控制pH＝5.5。

CN103421857公开了一种单端孢霉烯B族毒素的合成方法，其使用的产毒培养基为大米培养基：取市售的商品籼米粒100g，加水50ml，浸泡过夜后，在121℃高压蒸汽下灭菌每次30分钟，每天一次，共两天。

CN103397058A公开了一种高效制备脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，使用固体培养基进行生产培养；该固体培养基包括但不限于大米、玉米、小麦、燕麦、荞麦、高粱等粮食类。CN107478478公开了一种伏马毒素B1基体标准物质及其制备方法，其中采用食用农产品(如玉米、小麦、大米)的培养基来培养产毒。

CN108753865公开了一种用于生产AFB1的培养基，包括一级PDA培养基和二级培养基；一级PDA培养基的制备包括：土豆削皮切丁，每195-205g土豆加入495-505ml水，煮沸、过滤，加入15-25g蔗糖，加水至1L，121℃高温灭菌20min；二级培养基包括：玉米粉975-985g、鸡蛋175-185g、酵母粉10-20g、蛋白胨30-40g、蔗糖180-190g、玉米浆575-585g、氯化钠3-7g、花生饼粉75-85g、水575-585g。

比较目前现有的真菌培养和毒素生产的工艺，主要有以下几种方法及不足之处：采用单一固体培养基如玉米、大米等为原料进行真菌培养，不足之处是真菌生长空间有限，营养成分来源单一，不易调控；利用混配液体培养基培养，缺点是产毒率低；利用混配固体培养基培养，缺点是培养基配制复杂，灭菌后的培养基容易粘结，操作不便，同时也不利于真菌生长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于真菌毒素生产的混合培养基的配制方法；通过采用淀粉类、油料类农副产品、农作物秸秆或残渣以及水为主要原料，经过特定加工后，获得一种新型的混合培养基；该培养基经高温灭菌后，可用于真菌培养，并进行相关真菌毒素的生产。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种用于真菌毒素生产的混合培养基的制备方法，所述方法包括如下步骤：

S1、将淀粉类和油料类农副产品，或淀粉类农副产品进行干燥粉碎或提取加工，获得50-300目粉状原料或提取物，作为原料成分A；

S2、将农作物秸秆或残渣经干燥后进行粉碎、过筛处理，得到2-50目的干燥粉，作为原料B；

S3、取纯净水或蒸馏水作为原料C；

S4、将所述原料A、B、C按照一定的比例混合均匀，即可得到用于真菌培养的原料D；

S5、将所述原料D经高温、高压水蒸气灭菌(10min以上)，冷却后即可(无需添加其他成分)用于真菌培养，并进行相关毒素的生产。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，淀粉类农副产品包括大米、小米、小麦、玉米、土豆、绿豆中的一种或几种。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，油料类农副产品包括大豆、花生、菜籽、芝麻、葵花子、棉籽中的一种或几种。

步骤S1中获得的粉状原料；目数过小，得到的颗粒太大，后续同S2中的秸秆或残渣混合时，不能充分混合，真菌获取营养及生长的空间有限；因此，选择50-300目最适宜。

步骤S1中，采用干燥粉碎操作简单；采用提取加工则可以根据不同菌种需要，进行提取方法的调整，得到更适宜特定菌种生长和产毒的培养基成分。

步骤S2中，过筛处理得到的干燥粉选择目数为2-50目；选择该目数范围的目的是利用农作物秸秆或残渣天然多孔、比表面积大的特性，结合S1中的成分，均匀分布在S2中物料的表面及多孔结构中，为真菌提供适宜的生长和产毒环境。发明人发现，原料A选择50-300目，原料B选择2-50目最适宜。并且，在此基础上，对于不同的真菌，所需A和B的比例还可进一步进行针对性优化。发明人认为，原料A和B的目数比例，对于不同类型的真菌会有不一样的效果，主要原因是真菌的生长和产毒通常所需条件并不一致，常见真菌多为好氧微生物，其生长繁殖条件通常需要一定的氧气浓度、20-30℃的温度以及较高的湿度，但是产毒条件通常在真菌生长条件受到一定程度抑制时发生，因此对于不同的真菌，所需A和B的比例还可进一步根据需要进行针对性优化。

本发明的培养基适用于培养的真菌包括曲霉菌、镰刀菌等，产生的毒素为黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)、展青霉毒素、赭曲霉毒素A、伏马毒素(FB1、FB2、FB3)和单端孢霉烯族类毒素等。最适宜的真菌有镰孢菌、黄曲霉、赭曲霉等。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述提取加工为：采用不同比例的水和有机溶剂进行超声或振摇提取，提取时间为30min～3h，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇中的单一溶剂或混合溶剂。

作为本发明的一个实施方案，所述水和有机溶剂的重量比为0.1～10∶1。实际操作中，针对不同的提取对象，水和有机溶剂的重量比在0.1～10∶1内进行优化选择。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述干燥粉碎的温度为室温～80℃。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，所述农作物秸秆包括玉米杆、高粱秆、水稻秸秆、小麦秸秆中的一种或几种；所述残渣包括甘蔗渣、玉米芯、花生壳中的一种或几种。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，所述干燥的温度为60～80℃。

作为本发明的一个实施方案，步骤S4中，所述原料A、B、C按照0.01～1∶0.1～1∶1的重量比混合均匀，其中，原料A、B为干燥至含水率低于20％后的重量，原料C为直接称取重量。

作为本发明的一个实施方案，步骤S5中，所述高温、高压的具体条件为：温度在100℃-200℃之间，压力在0.1MPa＜P＜1.0MPa。

本发明提供一种混配固态生物基质的培养基，用于真菌的培养并产生相应的真菌毒素。本发明中主要创新之处有以下几点：以农作物秸秆或残渣作为混配培养基的一种原料成分，一是利用农作物秸秆或残渣天然多孔的特性，将混配培养基中的营养成分分布在蓬松、多孔的环境，大大增加真菌的生长空间，提供更加有利于真菌的生长和产毒环境，二是充分利用秸秆或残渣中的糖分和微量元素为真菌的生长和产毒提供养分，三是利用农作物秸秆或残渣天然吸附剂的作用，吸附真菌生长和产毒过程中产生的色素、以及未消耗的油脂类副产物，减少后续毒素的纯化生产工艺(以玉米芯为例，采用玉米芯混合培养基进行镰刀菌培养生产雪腐镰刀菌烯醇毒素，提取操作后玉米芯吸附色素副产物变为紫色，即是吸附色素的直观表现)；四是，所利用的农作物秸秆或残渣价格低廉、可持续再生、绿色环保，为企业生产节能减排。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明通过采用淀粉类、油料类农作物或其提取物，农作物秸秆或残渣，以及水的混配，获得一种用于真菌培养的培养基，该培养基解决了目前单独采用一种农作物如大米、玉米为主要原料作为真菌培养基用于真菌培养进而获得真菌毒素方法中毒素产量低，选择性差、后处理复杂等问题，采用该发明中混配的培养基用于真菌培养进而生产真菌毒素，具有毒素产率高，选择性好，后处理简单，价格低廉的优点。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为真菌培养基的配置流程图；

图2为实施例1的混合培养基与传统方法(采用玉米作为培养基)用于镰刀菌培养并生产脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素的比较示意图；

图3为实施例2中采用混合培养基和玉米培养基生产玉米赤霉烯酮的对比结果；

图4为实施案3中采用混合培养基和传统单一培养基生产黄曲霉毒素B1的对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明提供一种用于真菌毒素生产的混合培养基的配制方法；流程如图1所示，具体包括如下步骤：

步骤一、将淀粉类、油料类农副产品进行干燥粉碎或提取加工，获得50-300目粉状原料或提取物，作为原料成分A；

步骤二、将农作物秸秆或残渣经干燥后进行粉碎、过筛处理，得到2-50目的干燥粉，作为原料B；

步骤三、取纯净水或蒸馏水作为原料C；

步骤四、将上述步骤一至步骤三获得的原料A、B、C按照一定的比例混合均匀，即可得到用于真菌培养的原料D：

步骤五、将步骤四得到的原料D经高温、高压水蒸气灭菌10min以上，冷却后即可用于真菌培养，并进行相关毒素的生产。

其中，步骤一中所述淀粉类农副产品包括：大米、小米、小麦、玉米、土豆、绿豆等，油料类农副产品包括大豆、花生、菜籽、芝麻、葵花子、棉籽等；其中的提取加工方法为：采用不同比例的水和有机溶剂进行超声或振摇提取，提取时间不低于30min，有机溶剂可采用甲醇、乙腈、乙醇中的单一溶剂或混合溶剂，水在有机相中的占比可根据不同真菌培养的需求控制在0％-100％之间。

其中步骤二中所述的农作物秸秆或残渣包括，玉米杆、高粱秆、水稻秸秆、小麦秸秆、甘蔗渣、玉米芯、花生壳等，可选用其中的一种或多种混合使用，混合的比例可根据培养菌种的不同进行调配，当选用两种或两种以上混配秸秆时，按照干重计算，其种任意一种的比例可在0％-100％之间调控，并保证所有混配原料的比例加和等于100％。

其中步骤四中所述原料A、B、C按照一定的比例混合均匀，其中的比例按照重量计算，成分A、B为干燥(含水率低于20％)后重量，成分C为直接称取重量，成分A、B、C各自的比例可在0％-100％之间调控，并保证上述三种成分的比例加和等于100％。

其中步骤五中的高温、高压的具体条件为，温度在100℃-200℃之间，压力在0.1-1.0MPa之间。

实施例1

本实施例提供一种用于真菌毒素生产的混合培养基，该混合培养基的配制包括如下步骤：

步骤一、分别将玉米和花生饼60℃烘干4h，然后粉碎，过50目标准筛，得50目玉米粉和花生饼粉，并将玉米粉和花生饼粉按照重量比10∶1预混均匀，作为原料成分A；

步骤二、将玉米芯经干燥后进行粉碎、过5目筛处理，得到5目的干燥粉，作为原料B；

步骤三、取纯净水或蒸馏水作为原料C；

步骤四、将原料A、B、C按照0.1∶0.3∶1的比例混合均匀(该比例按照重量计算，成分A、B为干燥(含水率低于20％)后重量，成分C为直接称取重量)，然后称取10份混合物料，每份45克，分别放入250mL三角瓶，并用双层纱布封口，即可得到用于真菌培养的原料D；

步骤五、将步骤四得到的原料D经121℃水蒸气在0.2MPa压力下灭菌20min，冷却后，将灭菌后的原料D转移到生物安全柜，进行预先活化好的镰刀菌的接种，接种后充分混匀物料，尽量让镰刀菌菌种与培养物料分布均匀，然后放入培养箱中，在28℃、80％湿度条件下暗黑培养3天，3天后再次无菌操作混匀物料，混匀物料后温度不变、湿度调整为60％，继续暗黑培养10天，即可得到产生DON毒素的培养物料。

传统方法采用玉米作为培养基，培养基配制：取250mL三角瓶，称取50g玉米碴子(粒径约0.2-0.6cm)，加水25g，用双层细砂布封口后室温浸泡24小时，然后121℃高温灭菌20min，冷却后接菌使用，培养温度、湿度以及培养周期同本实施例的混合培养基方法一致。

采用本实施例制得的混合培养基与传统方法(采用玉米作为培养基)用于镰刀菌培养并生产脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素的比较，如图2所示；由图2可知：以相同重量的固体物料计算，本发明所用的混合培养基获得的DON毒素产率更高，选择性更好，后续毒素的生产纯化更加简便高效，成本更低；具体来说，本实施例的混合培养基与玉米粒培养基进行比较，DON(保留时间8.5min的色谱峰)的含量增加一倍以上，同时混合培养基得到的DON相对含量更高，说明杂质含量更低；另外，玉米培养的DON分析图谱中，保留时间7.5min左右有一个含量非常高的副产物峰，对DON的纯化带来较大的难度。

在本实施例的基础上，如果仅保留A、C，灭菌后的物料容易发生粘连，非常不利于真菌的生长，培养所得的物料中真菌毒素DON的含量大大降低；如果仅保留B、C成分，DON的产毒率将大大降低。

实施例2

本实施例提供一种用于真菌毒素生产的混合培养基，该混合培养基的配制包括如下步骤：

步骤一、将重量比为10∶1的大米、大豆进行干燥粉碎，过筛50目标准筛，获得50目粉状原料，作为原料成分A；

步骤二、将重量比为1∶1的玉米杆、玉米芯经干燥后进行粉碎、过5目标准筛处理，得到5目的干燥粉，作为原料B；

步骤三、取纯净水或蒸馏水作为原料C；

步骤四、将上述步骤一至步骤三获得的原料A、B、C按照2∶1∶5的比例混合均匀(其中的比例按照重量计算，成分A、B为干燥(含水率低于20％)后重量，成分C为直接称取重量)，即可得到用于真菌培养的原料D；

步骤五、将步骤四得到的原料D经121℃水蒸气在0.2MPa压力下灭菌20min，冷却后，将灭菌后的原料D转移到生物安全柜，进行预先活化好的镰刀菌的接种，接种后充分混匀物料，尽量让镰刀菌菌种与培养物料分布均匀，然后放入培养箱中，在28℃、80％湿度条件下暗黑培养3天，3天后再次无菌操作混匀物料，混匀物料后温度不变、湿度调整为60％，继续暗黑培养10天，即可得到产生ZEN毒素的培养物料。

传统方法采用大米作为培养基，培养基配制：取250mL三角瓶，称取50g大米，加水25g，用双层细砂布封口后室温浸泡24小时，然后121℃高温灭菌20min，冷却后接菌使用，培养温度、湿度以及培养周期同本实施例的混合培养基方法一致。

采用本实施例制得的混合培养基与传统方法(采用大米作为培养基)用于镰刀菌培养并生产玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素的比较，如图3所示；由图3可知：以相同重量的固体物料计算，本发明所用的混合培养基获得的ZEN毒素产率更高，选择性更好，后续毒素的生产纯化更加简便高效，成本更低。

在本实施例的基础上，如果仅保留A、C，灭菌后的物料容易发生粘连，非常不利于真菌的生长，培养所得的物料中真菌毒素ZEN的含量明显降低。如果仅保留B、C成分，ZEN的产毒率将大大降低。

实施例3

本实施例提供一种用于真菌毒素生产的混合培养基，该混合培养基的配制包括如下步骤：

步骤一、将重量比为10∶2∶1的玉米、大豆、菜籽进行干燥粉碎，过筛，获得50目粉状原料，作为原料成分A；

步骤二、将新鲜甘蔗渣经干燥后进行粉碎、过筛处理，得到5目的干燥粉，作为原料B；

步骤三、取纯净水或蒸馏水作为原料C；

步骤四、将上述步骤一至步骤三获得的原料A、B、C按照2∶1∶5的比例混合均匀(其中的比例按照重量计算，成分A、B为干燥(含水率低于20％)后重量，成分C为直接称取重量)，即可得到用于真菌培养的原料D；

步骤五、将步骤四得到的原料D经121℃水蒸气在0.2MPa压力下灭菌20min，冷却后，将灭菌后的原料D转移到生物安全柜，进行预先活化好的镰刀菌的接种，接种后充分混匀物料，尽量让镰刀菌菌种与培养物料分布均匀，然后放入培养箱中，在28℃、80％湿度条件下暗黑培养3天，3天后再次无菌操作混匀物料，混匀物料后温度不变、湿度调整为60％，继续暗黑培养10天，即可得到产生ZEN毒素的培养物料。

传统方法采用大米作为培养基，培养基配制：取250mL三角瓶，称取50g大米，加水25g，用双层细砂布封口后室温浸泡24小时，然后121℃高温灭菌20min，冷却后接菌使用，培养温度、湿度以及培养周期同本实施例的混合培养基方法一致。

采用本实施例制得的混合培养基与传统方法(采用大米作为培养基)用于曲霉菌培养并生产黄曲霉毒素B1(AFB1)的比较，如图4所示；由图4可知：以相同重量的固体物料计算，本发明所用的混合培养基获得的AFB1毒素产率更高，选择性更好，后续毒素的生产纯化更加简便高效，成本更低。

在本实施例的基础上，如果仅保留A、C，灭菌后的物料容易发生粘连，非常不利于真菌的生长，培养所得的物料中真菌毒素AFB1的含量明显降低；如果仅保留B、C成分，AFB1的产毒率将大大降低，甚至不产毒。

实施例4

本实施例提供一种用于真菌毒素生产的混合培养基，该混合培养基的配制包括如下步骤：

步骤一、将重量比为10∶5∶1的大米、小米、葵花籽进行干燥粉碎，然后进行提取加工，采用重量比为9∶1的水和乙醇进行超声或振摇提取，提取时间为120min，过滤提取液，取续滤液旋干后待用，作为原料成分A；

步骤二、将重量比为1∶1的高粱秆和水稻秸秆经干燥后进行粉碎、过筛处理，得到10目的干燥粉，作为原料B；

步骤三、取纯净水或蒸馏水作为原料C；

步骤四、将上述步骤一至步骤三获得的原料A、B、C按照1∶2∶8的比例混合均匀(其中的比例按照重量计算，成分A以提取物料大米、小米、葵花籽的干重计算、B为干燥(含水率低于20％)后重量，成分C为直接称取重量)，即可得到用于真菌培养的原料D；

步骤五、将步骤四得到的原料D经150℃水蒸气在0.5MPa压力下灭菌20min，冷却后即可用于真菌培养，并进行相关毒素的生产。

实施例5

本实施例提供一种用于真菌毒素生产的混合培养基，该混合培养基的配制包括如下步骤：

步骤一、将重量比为10∶1的干燥玉米粉和大豆粉进行提取加工，采用重量比为4∶1的水和乙醇进行超声或振摇提取，提取时间为120min，过滤提取液，取续滤液旋干后待用，作为原料成分A；

步骤二、将重量比为1∶2的玉米杆和高粱秆经干燥后进行粉碎、过筛处理，得到5目的干燥粉，作为原料B；

步骤三、取纯净水或蒸馏水作为原料C；

步骤四、将上述步骤一至步骤三获得的原料A、B、C按照1∶2∶6的比例混合均匀(其中的比例按照重量计算，成分A以提取物料玉米粉和大豆粉的干重计算、B为干燥(含水率低于20％)后重量，成分C为直接称取重量)，即可得到用于真菌培养的原料D；

步骤五、将步骤四得到的原料D经120℃水蒸气在0.2MPa压力下灭菌25min，冷却后即可用于真菌培养，并进行相关毒素的生产。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (2)

1.一种用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素生产的混合培养基的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一、分别将玉米和花生饼60℃烘干4h，然后粉碎，过50目标准筛，得50目玉米粉和花生饼粉，并将玉米粉和花生饼粉按照重量比10：1预混均匀，作为原料成分A；

步骤二、将玉米芯经干燥后进行粉碎、过5目筛处理，得到5目的干燥粉，作为原料B；

步骤三、取纯净水或蒸馏水作为原料C；

步骤四、将原料A、B、C按照0.1：0.3：1的比例混合均匀，该比例按照重量计算，成分A、B为干燥至含水率低于20％后重量，成分C为直接称取重量；然后称取10份混合物料，每份45克，分别放入250mL三角瓶，并用双层纱布封口，即可得到用于真菌培养的原料D；

步骤五、将步骤四得到的原料D经121℃水蒸气在0.2MPa压力下灭菌20min，冷却后，将灭菌后的原料D转移到生物安全柜，进行预先活化好的镰刀菌的接种，接种后充分混匀物料，尽量让镰刀菌菌种与培养物料分布均匀，然后放入培养箱中，在28℃、80％湿度条件下暗黑培养3天，3天后再次无菌操作混匀物料，混匀物料后温度不变、湿度调整为60％，继续暗黑培养10天，即可得到产生DON毒素的培养物料。

2.一种用于玉米赤霉烯酮毒素生产的混合培养基的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一、将重量比为10：1的大米、大豆进行干燥粉碎，过筛50目标准筛，获得50目粉状原料，作为原料成分A；

步骤二、将重量比为1:1的玉米杆、玉米芯经干燥后进行粉碎、过5目标准筛处理，得到5目的干燥粉，作为原料B；

步骤三、取纯净水或蒸馏水作为原料C；

步骤四、将上述步骤一至步骤三获得的原料A、B、C按照2:1:5的比例混合均匀，该比例按照重量计算，成分A、B为干燥至含水率低于20％后重量，成分C为直接称取重量，即可得到用于真菌培养的原料D；

步骤五、将步骤四得到的原料D经121℃水蒸气在0.2MPa压力下灭菌20min，冷却后，将灭菌后的原料D转移到生物安全柜，进行预先活化好的镰刀菌的接种，接种后充分混匀物料，尽量让镰刀菌菌种与培养物料分布均匀，然后放入培养箱中，在28℃、80％湿度条件下暗黑培养3天，3天后再次无菌操作混匀物料，混匀物料后温度不变、湿度调整为60％，继续暗黑培养10天，即可得到产生ZEN毒素的培养物料。

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