CN101736032B - 用尖孢镰刀菌培养毒素的方法及其作为除草剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用尖孢镰刀菌培养毒素的方法，该方法通过工业化生产，大量获取尖孢镰刀菌代谢产物，采用尖孢镰刀菌培养的毒素作为生物农药使用，具有很高的经济价值和良好的应用前景。本发明的还提供尖孢镰刀菌毒素作为除草剂的应用。用尖孢镰刀菌培养毒素的方法，首先将培养基置入培养容器内，经适当温度灭菌后，接种尖孢镰刀菌至培养基，控制培养基的温度、湿度、压力、pH条件，通以无菌空气，培养后，采用氢氧化钠溶液离心浸提其中的毒素后，再经干燥、浓缩做成固体或粉末状成品。

Description

用尖孢镰刀菌培养毒素的方法及其作为除草剂的应用 

技术领域：

本发明涉及一种真菌毒素的培养方法，具体讲为尖孢镰刀菌培养毒素的方法，以及该毒素作为生物除草剂的应用。 

背景技术：

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、番茄枯萎病、辣椒枯萎病等多种植物枯萎病的病原菌，是一种土传食腐真菌，在生长过程中自然感染西瓜等葫芦科、茄科、禾本科等很多植物，常从寄主植物根部侵入寄主体内，并沿导管向上侵染，产生毒素，引起植物细胞壁降解、渗漏、DNA合成受阻、电解质外渗、N代谢紊乱、光合作用受到抑制等，引起植物水分运输困难，导致植物因缺水而萎蔫死亡。 

尖孢镰刀菌是一种寄生性和生存能力都很强的丝状真菌，产生三种孢子：大型分生孢子、小型分生孢子、厚垣孢子。由于其腐生性和寄生性都很强，在土壤中存活多年，抗逆性很强，对植物的侵染和危害都很大，一般是作为病原菌对待。 

发明内容：

本发明目的在于提供一种用尖孢镰刀菌培养毒素的方法，该方法通过工业化生产，大量获取尖孢镰刀菌代谢产物，培养的尖孢镰刀菌毒素作为生物农药使用，具有很高的经济价值和良好的应用前景。 

本发明的另一目的是提供尖孢镰刀菌培养的毒素作为生物除草剂的应用。 

本发明的目的是通过以下措施实现的： 

用尖孢镰刀菌培养毒素的方法，其特征是：首先将培养基置入培养容器内， 经适当温度灭菌后，接种尖孢镰刀菌至培养基，控制培养基的温度、湿度、压力、pH条件，培养后，采用氢氧化钠溶液离心浸提其中的毒素后，再经干燥、浓缩做成固体或粉末状成品。 

培养过程中，培养基按重量百分比为：3-8％麦麸、0.5-5％豆饼粉、0.5-5％麦粉、0.1-2％硫酸铵、0-0.3％磷酸氢二钾、0-0.2％硫酸镁，以自来水配制，控制pH4-5.5，做成固体培养基； 

将培养基置于高压灭菌锅中进行高温灭菌55-65分钟，保持灭菌锅中温度为120-124℃，压力为0.12-0.8Mpa；取出已灭菌的培养基，放置在无菌接种室内冷却，并放置2-3天；冷却后，采用上次方法再灭菌一次； 

第二次灭菌后，当培养基降温至35℃左右时，接种尖孢镰刀菌，接种量占培养基的重量比为1～6％，控制培养室温度为28-33℃，进行培养； 

培养过程中翻动培养基，经7～9天培养后，按重量/体积为1∶1.5-2kg/L的比例加入浓度为0.5-1M的NaOH溶液，离心浸提培养基中的真菌毒素及其它代谢产物2-3次，弃去固体沉淀，再向上清液中加入等体积0.5-1M的HCl溶液中和，然后在50-75℃旋转蒸发浓缩溶液近干，得固体或粉末状毒素及其它代谢产物。 

培养过程中翻动或搅动培养基，1-3天内每天翻动或搅动次3-5次；4-10天内每天翻动或搅动6-10次；11-13天内每天翻动或搅动4-6次；或搅动培养池内培养基。 

本发明培养的尖孢镰刀菌毒素作为生物除草剂的应用。 

本发明将植物病原菌化害为利，利用尖孢镰刀菌生产萎蔫毒素，通过人工将本来是植物病原菌的尖孢镰刀菌接种到灭菌后的液体或固体培养基，在一定的温度、湿度、压力、pH条件下，经一段时间培养后，收集提取尖孢镰刀菌产 生的毒素(主要是镰刀菌酸)，形成固体或液体状成品。 

本发明利用现代微生物工艺技术很实现了室内工业化、规模化生产，生产条件和生产过程容易人工调控，质量容易控制，产品能进行连续化、批量化生产。该尖孢镰刀菌毒素作为生物农药使用大大降低了生产和使用成本，提高产品单位效价(除草效果)，具有很高的经济价值和良好的应用前景。 

正是由于尖孢镰刀菌的具有强烈的抑制葫芦科、禾本科、茄科等植物生长的独特性，可以化害为利，将其产生的毒素用作除草剂，用于防治农田葫芦科、茄科、禾本科等杂草，有独特的效果。而且用量省、效果好、专业性强、污染少、不伤害天敌、环境友好，因此是农林牧及园艺上的优良生物农药，有利于人类可持续发展和生态平衡。 

本发明培养的尖孢镰刀菌作为生物除草剂，既能满足农业生产需要，又不会污染环境，与化学合成除草剂方法相比，生产过程中不产生有毒废气、废水、废渣等，无需高温高压设备，使用到田间后很快就会自动降解，不会长期残留影响下茬作物的生长，有利于可持续发展。 

采用本发明培养的尖孢镰刀菌作为除草剂，同化学除草剂相比，不需要高温、高压、高毒，生产原料无毒，无易燃易爆原辅材料，方法简便，生产过程中无有毒废气、废液和废渣产生；同时产品使用到环境后，不污染环境，不会长久残留植物和土壤中，对下茬作物无残毒；用尖孢镰刀菌培养毒素做除草剂目前尚未见公开报道。本发明所用的尖孢镰刀菌可以从很多大学或研究所及公司购买。 

具体实施方式：

下面结合实例，对本发明作进一步的说明。 

实例一：固体培养方法 

1、培养环境彻底消毒，包括培养池、曲盘、塑料袋、培养室及培养室内空气。 

2、将3-8％麦麸、0.5-5％豆饼粉、0.5-5％麦粉、0.1-2％硫酸铵、0-0.3％磷酸氢二钾、0-0.2％硫酸镁等加入适量水份，调整含水量达50％左右，pH4-5.5，做成固体培养基，将固体培养基置于培养池、曲盘或塑料袋中。 

3、将袋装上述原料置于高压灭菌锅中进行高温灭菌60分钟，保持灭菌锅中温度为121℃，压力为0.15MPa。 

4、取出已灭菌的袋装培养基，放置在无菌接种室内冷却，并放置2-3天。 

5、将放置2-3天的灭菌袋装培养基再次高温灭菌一次，方法同3，杀灭上次灭菌过程中存活的孢子，冷却。 

6、当袋中培养基降温至35℃左右时，接种尖孢镰刀菌，接种量占培养基的重量比为1～6％，控制培养室温度为28-33℃。放置在培养室的培养池或培养架上进行培养，如塑料袋培养，在接种后将塑料袋均匀打孔。 

7、培养过程中应多次翻动塑料袋或曲盘，1-3天内每天翻动次3-5次；4-6天内每天翻动6-10次；7-9天内每天翻动4-6次；或搅动培养池内培养基，以使培养基均匀透气，以利尖孢镰刀菌均匀生长充分利用培养料。 

8、固体培养法经7～9天培养后，按1∶1.5-2kg/L(重量/体积)加入0.5-1M的NaOH溶液(培养基∶NaOH溶液＝1∶1.5-2)，离心浸提培养基中的真菌毒素及其它代谢产物2次(2000-3500转/分)，弃去固体沉淀，再向上清液中加入等体积0.5-1M的HCl溶液中和NaOH，然后50-75℃旋转蒸发(35-75转/分)浓缩溶液近干，得固体或粉末状毒素及其它代谢产物，产物为活菌产品。 

实施例二： 

将本发明培养的毒素产品作为生物除草剂，一般用于灭除葫芦科、禾本科、茄科、景葵科等杂草。将纯品粉剂兑水稀释2000-6000倍喷雾使用，一般幼苗期杂草(2片真叶)2天死亡率90％以上；较大杂草(3-6叶)3天杂草死亡率50-80％以上；晴天使用效果最好，3天杂草死亡率达99％；使用后2小时内如遇到降水，则在天晴后再喷施一次；一般应在作物播种或移栽前10-15天使用。 

Claims (4)

1.用尖孢镰刀菌培养毒素的方法，其特征是：首先将培养基置入培养容器内，经适当温度灭菌后，接种尖孢镰刀菌至培养基，控制培养基的温度28-33℃、湿度50％、pH4-5.5，培养后，采用0.5-1M氢氧化钠溶液离心浸提其中的毒素后，用0.5-1M的HCl中和离心浸提的毒素的上清液，再经干燥、浓缩做成固体或粉末状成品。

2.根据权利要求1所述用尖孢镰刀菌培养毒素的方法，其特征是：培养过程中，培养基按重量百分比为：3-8％麦麸、0.5-5％豆饼粉、0.5-5％麦粉、0.1-2％硫酸铵、0-0.3％磷酸氢二钾、0-0.2％硫酸镁，以自来水配制，控制pH4-5.5，做成固体培养基；

将培养基置于高压灭菌锅中进行高温灭菌55-65分钟，保持灭菌锅中温度为120-124℃，压力为0.12-0.8Mpa；取出已灭菌的培养基，放置在无菌接种室内冷却，并放置2-3天；冷却后，采用上次方法再灭菌一次；

第二次灭菌后，当培养基降温至35℃左右时，接种尖孢镰刀菌，接种量占培养基的重量比为1～6％，控制培养室温度为28-33℃，进行培养；

培养过程中翻动培养基，经7～9天培养后，按重量/体积为1∶1.5-2kg/L的比例加入浓度为0.5-1M的NaOH溶液，离心浸提培养基中的真菌毒素及其它代谢产物2-3次，弃去固体沉淀，再向上清液中加入等体积0.5-1M的HCl溶液中和，然后在50-75℃旋转蒸发浓缩溶液近干，得固体或粉末状毒素及其它代谢产物。

3.根据权利要求1所述用尖孢镰刀菌培养毒素的方法，其特征是：培养过程中翻动或搅动培养基，1-3天内每天翻动或搅动次3-5次；4-10天内每天翻动或搅动6-10次；11-13天内每天翻动或搅动4-6次；或搅动培养池内培养基。 

4.权利要求1所培养的毒素作为除草剂在防治葫芦科和茄科杂草上的应用。