CN110498824A - 纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法 - Google Patents

纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇‑3‑葡萄糖苷的方法，所属农产品和食品安全技术领域，先取经过伽马辐照后的小麦于无菌锥形瓶加入无菌水并接种孢子液进行培养，接着将其干燥后粉碎倒入烧杯中，再添加乙腈、水和乙酸的混合液提取，然后蒸发除去提取剂中的有机溶剂。经过提取后的粉末，加入超纯水复溶后，过水相滤膜过滤后，接着通过层析分离以及去杂质后采用试管进行收集。将所有试管的液体收集起来后进行干燥，接着用超纯水复溶后再将脱色剂加入到含有D3G的水中，最后经真空冷冻干燥得到纯化的D3G白色粉末。该制备方法具有操作简单、制备周期短和成本低的优点。能够提高D3G毒素的制备效率，降低目前D3G纯品的制备成本。

Description

纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法
技术领域
本发明涉及农产品和食品安全技术领域，具体涉及一种纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(deoxynivalenol-3-glucoside，D3G)是在植物降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)毒性过程中，由DON在糖苷转移酶的作用下经葡萄糖苷化而形成的。DON是由镰刀菌属分泌的主要的单端孢霉烯族毒素，已被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为最危险的食品污染物之一。
D3G已被证明常与DON共存于农产品和食品中。近来研究发现D3G可以在生物体内被微生物水解而释放出原型毒素DON从而产生同等甚至更高水平的毒性，具有极大的危害。因此，D3G的检测、毒理和代谢等已经成为目前研究的热点和焦点。
小麦、大麦等农作物生长及储存过程中容易受到镰刀菌属真菌的侵染，产生有毒的次级代谢产物，但是进一步研究发现被禾谷镰刀菌侵染后的谷物不仅存在游离态的DON，还有一些隐蔽型的 DON，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（D3G）。这些毒素在常规的提取过程中易被忽略，当隐蔽型毒素进入人和动物体内后会释放出DON毒素，成为潜在的食品安全威胁毒素。但现在对D3G毒素的研究尚属于初步阶段，分离和纯化方式主要通过化学合成得到的，需要标准品作为合成原料，价格较为昂贵且步骤比较复杂。
发明内容
本发明主要解决现有技术中存在价格较为昂贵且步骤比较复杂的不足，提供了一种纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，其具有操作简单、制备周期短和成本低的优点。能够提高D3G毒素的制备效率，降低目前D3G纯品的制备成本。
本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：
一种纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，按如下操作步骤：
第一步：先用自封袋取n克干净小麦籽粒，封口后再加一层自封袋。利用伽马辐照，辐照剂量为5kgray，辐照后的小麦在 4℃条件下储存。
第二步：在无菌操作台中称取50g辐照小麦于250mL无菌锥形瓶中加入100mL无菌水，震荡摇匀。
第三步：接着在无菌锥形瓶中接种孢子液100µL，于恒温培养箱 25℃下，培养6～8天。
第四步：经过在无菌锥形瓶内培养后的小麦籽粒取出经过40℃鼓风干燥机干燥18～36小时，再用高速粉碎机粉碎后过筛备用。
第五步：称取粉碎过的小麦粉末置于1000mL烧杯中，加入乙腈、水和乙酸的混合液，并提取800mL的提取剂，并重复加入乙腈、水和乙酸的混合液再提取一次；将所有的提取剂混合起来，40℃下旋转蒸发除去提取剂中的有机溶剂。
第六步：经过提取后的粉末，加入超纯水复溶后，过水相滤膜过滤后，通过制备液相纯化，然后通过层析分离以及去杂质后采用试管进行收集。
第七步：将所有试管的液体收集起来后，经过40℃～50℃下旋转蒸发干燥，接着用超纯水复溶后再将脱色剂加入到含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的水中，并采用8000rpm的高速离心剧烈搅拌后，收集搅拌后的上清液，最后经真空冷冻干燥得到纯化的脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷白色粉末。
作为优选，除去提取剂中的有机溶剂后，再加入400mL的乙酸乙酯提取，此过程重复3～5 次，多次重复得到的收集水相液体置于-18℃以下预冻 12小时以上后放入真空冷冻干燥机中冻干3天以上。
作为优选，乙腈：水：乙酸的比例为79：20：1。
作为优选，在无菌锥形瓶中接种孢子液培养过程中每隔1～2天震荡摇匀，以免结块。
作为优选，经过提取后的粉末，加入20mL超纯水复溶并通过0.22μm的水相滤膜后，接着在流速为2.5mL/min 条件下，通过C18色谱柱进行层析分离，然后采用波长为 220nm的紫外检测器进行检测，检测采用每针进样量为1.0mL，同时收集脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷，收集时间段为15min～25min的液体于试管中。
作为优选，C18色谱柱采用250 mm×10 mm的规格，采用甲醇和水的混合液进行流动洗脱过程，甲醇:水的比例为20:80。
作为优选，每次进样10～15 针后，用甲醇清洗C18色谱柱30min，从而洗去杂质。
作为优选，将所有试管的液体收集起来后，经过旋转蒸发干燥后的粉末，接着用30mL超纯水复溶后再将1g 脱色剂加入到含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的水中。
作为优选，纯化得到的脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷通过液相色谱质谱联用仪采用同位素稀释法测定其纯度及不确定度。
本发明能够达到如下效果：
本发明提供了一种纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，与现有技术相比较，具有操作简单、制备周期短和成本低的优点。能够提高D3G毒素的制备效率，降低目前D3G纯品的制备成本。
具体实施方式
下面通过实施例，对发明的技术方案作进一步具体的说明。
实施例：一种纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，按如下操作步骤：
第一步：先用自封袋取300克干净小麦籽粒，封口后再加一层自封袋。利用伽马辐照，辐照剂量为5kgray，辐照后的小麦在 4℃条件下储存。
第二步：在无菌操作台中称取50g辐照小麦于250mL无菌锥形瓶中加入100mL无菌水，震荡摇匀。
第三步：接着在无菌锥形瓶中接种孢子液100µL，于恒温培养箱 25℃下，培养7天。在无菌锥形瓶中接种孢子液培养过程中每隔1天震荡摇匀，以免结块。
第四步：经过在无菌锥形瓶内培养后的小麦籽粒取出经过40℃鼓风干燥机干燥24小时，再用高速粉碎机粉碎后过筛备用。
第五步：称取粉碎过的小麦粉末置于1000mL烧杯中，加入乙腈、水和乙酸的混合液，乙腈：水：乙酸的比例为79：20：1。并提取800mL 的提取剂，并重复加入乙腈、水和乙酸的混合液再提取一次。将所有的提取剂混合起来，40℃下旋转蒸发除去提取剂中的有机溶剂。除去提取剂中的有机溶剂后，再加入400mL的乙酸乙酯提取，此过程重复4次，多次重复得到的收集水相液体置于-18℃以下预冻 12小时以上后放入真空冷冻干燥机中冻干3天以上。
第六步：经过提取后的粉末，加入20mL超纯水复溶并通过0.22μm的水相滤膜后，接着在流速为2.5mL/min 条件下，采用甲醇和水的混合液进行流动洗脱过程，甲醇:水的比例为20:80。并通过C18色谱柱进行层析分离，C18色谱柱采用250 mm×10 mm的规格。然后采用波长为 220nm的紫外检测器进行检测，检测采用每针进样量为1.0mL，同时收集脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷，收集时间段为20min的液体于试管中。每次进样12 针后，用甲醇清洗C18色谱柱30min，从而洗去杂质。
第七步：将所有试管的液体收集起来后，经过45℃下旋转蒸发干燥，接着用 30mL超纯水复溶后再将1g 脱色剂加入到含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的水中。并采用8000rpm的高速离心剧烈搅拌后，收集搅拌后的上清液，最后经真空冷冻干燥得到纯化的脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷白色粉末。最后纯化得到的脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷通过液相色谱质谱联用仪采用同位素稀释法测定其纯度及不确定度。
综上所述，该纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，具有操作简单、制备周期短和成本低的优点。能够提高D3G毒素的制备效率，降低目前D3G纯品的制备成本。
以上所述仅为本发明的具体实施例，但本发明的结构特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (9)

1.一种纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于按如下操作步骤：
第一步：先用自封袋取n克干净小麦籽粒，封口后再加一层自封袋；利用伽马辐照，辐照剂量为5kgray，辐照后的小麦在 4℃条件下储存；
第二步：在无菌操作台中称取50g辐照小麦于250mL无菌锥形瓶中加入100mL无菌水，震荡摇匀；
第三步：接着在无菌锥形瓶中接种孢子液100µL，于恒温培养箱 25℃下，培养6～8天；
第四步：经过在无菌锥形瓶内培养后的小麦籽粒取出经过40℃鼓风干燥机干燥18～36小时，再用高速粉碎机粉碎后过筛备用；
第五步：称取粉碎过的小麦粉末置于1000mL烧杯中，加入乙腈、水和乙酸的混合液，并提取 800mL的提取剂，并重复加入乙腈、水和乙酸的混合液再提取一次；将所有的提取剂混合起来，40℃下旋转蒸发除去提取剂中的有机溶剂；
第六步：经过提取后的粉末，加入超纯水复溶后，过水相滤膜过滤后，通过制备液相纯化，然后通过层析分离以及去杂质后采用试管进行收集；
第七步：将所有试管的液体收集起来后，经过40℃～50℃下旋转蒸发干燥，接着用超纯水复溶后再将脱色剂加入到含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的水中，并采用8000rpm的高速离心剧烈搅拌后，收集搅拌后的上清液，最后经真空冷冻干燥得到纯化的脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷白色粉末。
2.根据权利要求1所述的纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于：除去提取剂中的有机溶剂后，再加入400mL的乙酸乙酯提取，此过程重复3～5 次，多次重复得到的收集水相液体置于-18℃以下预冻 12小时以上后放入真空冷冻干燥机中冻干3天以上。
3.根据权利要求1所述的纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于：乙腈：水：乙酸的比例为79：20：1。
4.根据权利要求1所述的纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于：在无菌锥形瓶中接种孢子液培养过程中每隔1～2天震荡摇匀，以免结块。
5.根据权利要求1所述的纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于：经过提取后的粉末，加入20mL超纯水复溶并通过0.22μm的水相滤膜后，接着在流速为2.5mL/min 条件下，通过C18色谱柱进行层析分离，然后采用波长为 220nm的紫外检测器进行检测，检测采用每针进样量为1.0mL，同时收集脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷，收集时间段为15min～25min的液体于试管中。
6.根据权利要求5所述的纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于：C18色谱柱采用250 mm×10 mm的规格，采用甲醇和水的混合液进行流动洗脱过程，甲醇:水的比例为20:80。
7.根据权利要求5所述的纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于：每次进样10～15 针后，用甲醇清洗C18色谱柱30min，从而洗去杂质。
8.根据权利要求1所述的纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于：将所有试管的液体收集起来后，经过旋转蒸发干燥后的粉末，接着用 30mL超纯水复溶后再将1g 脱色剂加入到含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的水中。
9.根据权利要求1所述的纯化制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于：纯化得到的脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷通过液相色谱质谱联用仪采用同位素稀释法测定其纯度及不确定度。
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