CN104127462B - 一种注射级的紫锥菊提取物及其注射剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种注射级的紫锥菊提取物及其注射剂，该提取物由以下方法制备的：1)紫锥菊，粉碎，备用；2)取粉碎的紫锥菊粉末，用含碱的水溶液温浸提取2次，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；3)将步骤2)得到的滤液上阴离子树脂，水洗涤，然后用含酸的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液，备用；4)将步骤3)得到的浓缩液，盐析，冷藏，滤过，滤液弃去，沉淀用水洗涤，即得。本发明提供的注射剂中间体中菊苣酸和咖啡酰酒石酸含量高，成本低，药效好。

Description

一种注射级的紫锥菊提取物及其注射剂

技术领域

本发明涉及中药提取物，具体涉及一种注射级的紫锥菊提取物及其制剂。

背景技术

紫锥菊(Echinacea)为菊科(Compositea)松果菊属多年生草本植物，原产于北美洲的中西部地区，是目前受到国际普遍重视的一种免疫促进剂和免疫调节剂，是闻名世界的“免疫”草药,具有突出的抗感染与促免疫的作用。

紫锥菊为北美印第安人的传统药材，在20世纪欧美国家非常普及，1920年以后，随着近代西药的快速发展及青霉素的发现，其药用几乎消失，近年来，随着替代医药疗法的发展，紫锥菊又开始流行起来，目前在欧美广泛应用于药品、营养补充剂和保健食品。

紫锥菊提取物及制剂销售额居美国草药市场销售排名前5名，受到国内外的极大关注。多酚类成分一直以来被公认的具有免疫增强、抗炎、抗病毒作用的物质，其中菊苣酸作为一种指标性成分用于评价紫锥菊药材、提取物及制剂的质量。

注射剂起效快，疗效好，但对于注射的物质要求高，中药注射剂一般要求有效成分尽量清楚，质量便于控制。

目前，未见以菊苣酸等多酚为指标的紫锥菊注射剂的相关报道，发明人对此进行了研究，对紫锥菊药材中所含多酚类成分进行了提取纯化，制得紫锥菊注射剂。

目前紫锥菊注射剂相关研究报道较少，紫锥菊注射液鸡胚内抗新城疫病毒的作用研究(周新民等，紫锥菊注射液鸡胚内抗新城疫病毒作用研究，中国家禽，2011年第33卷第8期：28-30)一文中涉及紫锥菊注射液，其采用紫锥菊一般提取物用注射用水复溶，浓度为2％，装瓶，灭菌制得，未见质量控制内容，重复性较差。

在本发明的制备工艺中，对紫锥菊中多酚类成分进行了精制，与目前紫锥菊提取纯化相关专利存在交叉点。

而目前有关紫锥菊的提取方法有下列报道：

CN03134457.7(公开号为CN1473602)包括乙醇回流提取、除杂、浓缩、真空干燥，上柱等步骤。其存在以下不足之处：①提取液直接进行微滤处理，容易造成微滤膜堵塞，且生产效率低，不适宜大生产。②浓缩所得浸膏，进行减压干燥，由于菊苣酸等多酚类成分耐热性不好，长时间的受热造成菊苣酸损失较多，导致最终得到的提取物中菊苣酸含量不高。

CN200610031845.2(公开号为CN1957961A)紫锥菊提取物的制备方法，原料采用的是新鲜状态的紫锥菊全草，经提取，浓缩得紫锥菊提取物。该方法存在以下不足之处：①制备工艺以紫锥菊鲜药材为研究对象，虽然紫锥菊鲜品菊苣酸含量较高，但紫锥菊提取物的生产受季节限制，紫锥菊提取物的药源问题限制了其工业化生产。②其工艺生产的主要是以菊苣酸含量为指标，而药材中发挥免疫作用的多糖成分其未考虑，一定程度造成了药材资源的浪费。③制备工艺中药材用高浓度乙醇提取2次，药渣中吸附有大量乙醇，而未见处理，其生产的紫锥菊提取物成本较高。

CN200610061847.6(公开号为CN101032541A)公开了一种紫锥菊提取物及其制备方法和含量测定方法，该方法存在以下不足之处：①提取用乙醇量较大，乙醇消耗量大，成本较高。经试验研究其工艺菊苣酸转移率较低，在40-50％左右。②其工艺制备的紫锥菊提取物中菊苣酸含量较低，且指标单一，未体现总多酚和总多糖类成分含量转移情况。

CN200710165206.X(公开号为CN101148410A)公开了一种从紫锥菊提取高纯度菊苣酸的方法，其中包括下述三个步骤：一、乙醇提取：将粉碎好的紫锥菊根，采用浸泡法或超声提取等方法用乙醇提取，分离提取液和药渣；将药渣再用乙醇提取，所得提取液与第一次提取液合并，分离除去其中的固体杂质，备用；二、大孔吸附树脂柱预分离：将上述乙醇提取法所得提取物回收乙醇后加至大孔吸附树脂柱上，分别用不同浓度的乙醇洗脱，乙醇洗脱液回收溶剂后得到提取物；三、高速逆流色谱法纯化。该方法其存在以下不足之处：采用大孔树脂纯化，较阴离子树脂选择性吸附多酚成分较差，且成本比阴离子树脂高。

CN200810143072.6(公开号为CN101367728A)公开了一种从紫锥菊提取物纯化菊苣酸和单咖啡酰酒石酸的方法。以市售3-5％的紫锥菊提取物为原料，按原料和水的质量比为1∶2-5加水溶解，过滤，加酸调节pH为1-4；将上样液加到装有非极性大孔吸附树脂层析柱中；依次用三种不同梯度的洗脱液洗脱。

CN201110057558.X(公开号为CN102161620A)公开了一种从紫锥菊提取物中非柱色谱分离和纯化菊苣酸的方法，该方法存在以下不足之处：该发明直接使用紫锥菊提取物作为原料，另外，在萃取过程中采用氯仿萃取，萃取溶剂毒性较大，不利于劳动保护。

CN201010603968.5(公开号为CN102060706A)公开了一种从紫锥菊中提纯菊苣酸的方法，将紫锥菊粗提取，然后利用超临界CO₂及其夹带剂进行萃取，得到菊苣酸，再经离子交换等分离纯化方法得到高含量的菊苣酸。该方法其存在以下不足之处：①药液超滤，容易堵塞，效率较低，不适宜大生产；②采用超临界萃取，成本较高；③最终采用阳离子树脂柱纯化，菊苣酸不易吸附，收率较低。

CN201210216720.2(公开号为CN102716164A)提供的紫锥菊提取物，是采用碱性乙醇溶液及溶菌酶对紫锥菊药材进行两次提取获得；产品中：多糖含量≥21.50％，多酚含量≥8.10％，菊苣酸含量≥5.00％。其存在以下不足之处：用pH＝12氢氧化钙乙醇溶液提取容易造成钙离子与菊苣酸等多酚成分螯合，形成沉淀不溶物，且在高温碱性环境中易造成菊苣酸所含酯键的断裂，造成菊苣酸等成分的破坏，而经过发明人对该提取工艺的验证，最终制备得到的提取物中含量也与该文献提到的含量不符。

现有的紫锥菊提取物制备过程中易造成菊苣酸损失较多，含量不高，不适合工业生产，生产成本较高，且对药材的利用率不高，为解决以上问题，发明人提出了一种制备注射用紫锥菊提取物的方法及注射剂的制备方法和应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是要提供一种注射级的紫锥菊提取物及其制剂。

本发明提供的一种注射级的紫锥菊提取物，该提取物由以下方法制备的：

1)紫锥菊，粉碎，备用；

2)取粉碎的紫锥菊粉末，用含碱的水溶液温水浸提2-4次，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3)将步骤2)得到的滤液上阴离子树脂，水洗涤，然后用含酸的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液，备用；

4)将步骤3)得到的浓缩液，盐析，冷藏，滤过，滤液弃去，沉淀用水洗涤，即得注射用的紫锥菊提取物。

优选地，所述提取物由以下方法制备：

1)紫锥菊粉碎，过10-40目筛，备用；

2)取紫锥菊粉末，加紫锥菊重量6-12倍体积的浓度为0.05-0.20％碱溶液，60-90℃温水浸提2-4次，每次提取1-3小时，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3)以2-6倍柱体积/小时流速通过阴离子交换树脂柱，上样量不超过15g生药/树脂，以2-5倍柱体积水洗涤除杂，再以6-10倍柱体积含1-5％酸的40％-60％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，得浓缩液，备用；

4)将步骤3)中所得浓缩液加其重量1-15％氯化钠，搅拌使溶解，用浓度为20％的盐酸调节pH至0.5-3.0，静置，冷藏24小时，滤过，滤液弃去，沉淀用适量水洗涤，即得紫锥菊提取物。

进一步优选，所述提取物由以下方法制备：

1)紫锥菊粉碎，过10-24目筛，备用；

2)取紫锥菊粉末，加紫锥菊重量6-10倍体积的浓度为0.1-0.2％碱溶液，70-80℃温水浸提2-4次，每次提取1-2小时，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3)以4-6倍柱体积/小时流速通过阴离子交换树脂柱，上样量8-15g生药/树脂，以3-5倍柱体积水洗涤除杂，再以8-10倍柱体积含2-4％酸的40％-60％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，得浓缩液，备用；

4)将步骤3)中所得浓缩液加2.25-3％氯化钠，搅拌使溶解，用20％的盐酸调节pH至1-2，静置，冷藏24小时，滤过，滤液弃去，沉淀用适量水洗涤，即得注射用的紫锥菊提取物。

更进一步优选，所述提取物由以下方法制备：

1)紫锥菊粉碎，过15目筛，备用；

2)取紫锥菊粉末，加8倍量0.1％碱溶液，80℃温水浸提2次，每次提取1.5小时，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3)将步骤2)中所得滤液，以4倍柱体积/小时流速通过阴离子树脂柱，上样量为10g生药/树脂，以3倍柱体积水洗涤除杂，再以8倍柱体积的含2％酸的50％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，得浓缩液，备用；

4)将步骤3)中所得浓缩液，加2.5％的氯化钠，搅拌使溶解，用20％的盐酸调节pH至1.5，静置，冷藏24小时，滤过，滤液弃去，沉淀用适量水洗涤。

上述提取物中，

步骤1)中所述紫锥菊为紫锥菊的根或叶，或二者的混合物；

步骤2)中：

所述碱为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、浓氨水的一种或几种，优选为碳酸钠；

所述步骤3)中：

所述阴离子交换树脂柱为凝胶型阴离子交换树脂或大孔型阴离子交换树脂，优选为强碱性交联度为7的凝胶型离子交换树脂；

所述含酸的乙醇溶液中，所述酸为浓盐酸、磷酸、浓硫酸、冰醋酸、柠檬酸的一种或几种，优选为柠檬酸；

所述含酸的乙醇洗脱时，监控方法是用液相随时检测，至8倍体积乙醇时，液相未检出菊苣酸与咖啡酰酒石酸为止。

本发明还提供了上述提取物的制备方法，具体为：

1)紫锥菊，粉碎，备用；

2)取粉碎的紫锥菊粉末，用含碱的水溶液温浸提取2次，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3)将步骤2)得到的滤液上阴离子树脂，水洗涤，然后用含酸的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液，备用；

4)将步骤3)得到的浓缩液，盐析，冷藏，滤过，滤液弃去，沉淀用水洗涤，即得。

本发明还提供含上述提取物的注射剂，所述注射剂为冻干粉针或注射液。

所述注射液由以下成分组成：紫锥菊提取物10-20％、抗氧剂0.05-0.2％、助溶剂0.1-0.2％、止疼剂0.1-0.5％，余量为注射用水；

所述冻干粉针由紫锥菊提取物和辅料组成，其中辅料为紫锥菊提取物的0.5-0.8倍。所述辅料为甘露醇、亚硫酸氢钠、吐温-80、三氯叔丁醇。

本发明还提供了注射剂的制备方法，以1000ml注射液为例，该方法包括以下步骤：将注射用的紫锥菊提取物加注射用水至80-800ml，搅拌均匀，用20％的盐酸调节pH＝4.5-6.5，滤过，滤液加适量抗氧剂、助溶剂及止疼剂，加注射用水至适量，搅拌均匀，再加0.5％-1％活性炭，加热煮沸10-30分钟，薄膜滤过，滤液分装，灭菌，得紫锥菊注射液；或滤液加适量甘露醇，经冷冻干燥，得紫锥菊注射粉针剂。

优选地，所述注射剂由以下方法制备：将注射用的紫锥菊提取物10-100g加注射用水100-800ml，搅拌均匀，用20％的盐酸调节pH＝5.0-6.5，滤过，滤液加抗氧剂、助溶剂及止疼剂，加注射用水至100-1000ml，再加0.8％活性炭，加热煮沸20分钟，0.22μm薄膜滤过，热压灭菌，分装，得紫锥菊注射液；或滤液加10％甘露醇，经冷冻干燥，得紫锥菊注射粉针剂。

上述：

所述抗氧剂为0.1％亚硫酸氢钠；

所述助溶剂为吐温-80；

所述止疼剂为三氯叔丁醇。

本发明还提供了上述锥菊注射剂在制备治疗动物免疫功能低下或提高疫苗免疫效果的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的紫锥菊提取物及其注射剂具有以下优点：

1、植物体内化学成分复杂，其中杂质成分主要有纤维素、叶绿素、糖类、蛋白质、油脂和蜡、树脂、树胶、鞣质及无机盐等，在提取分离时，应尽量设法使得杂质不被提取出来，或者在提取分离过程中尽可能的去除，最终获得所需的成分。

本发明为取得注射用的紫锥菊提取物，事先将紫锥菊药材粉碎后用适宜碱水温浸提取，能使其所含多酚类物质成盐，水溶性增强，同时温浸提取，能避免高分子多糖、粘液质等的溶出，便于后续纯化。

1)与现有技术水回流提取，本发明的碱溶液温浸提取，原因是紫锥菊的有效成分为菊苣酸等，但其高温不稳定，本发明的碱溶液温浸提取，有效的保护了菊苣酸这种有效成分，且经过多次试验，本试验方法能够最大限度的将菊苣酸等有效成分提取出来，且对其进行有效保护；

2)过柱：现有技术有非极性柱，本发明为过阴离子树脂柱，多酚类等阴离子被交换于树脂上，经水洗除杂，用酸性乙醇洗脱，使多酚类物质游离，乙醇破坏其与树脂间的氢键吸附，多酚类物质被洗脱下来，洗脱液经过浓缩，盐析精制后，得紫锥菊注射剂中间体，本工艺成本低廉，容易操作，得紫锥菊中间体菊苣酸和咖啡酰酒石酸含量高。

2、本发明提供的注射剂中间体中菊苣酸和咖啡酰酒石酸含量高，成本低，药效好。所制得的紫锥菊注射剂中间体，菊苣酸的含量高于40％，咖啡酰酒石酸的含量高于20％。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

浓度为溶质与溶剂的重量体积比，如0.1％碳酸钠为0.1g的碳酸钠用水配制成100ml溶液。

所述凝胶型阴离子树脂柱，由上海开平树脂有限公司生产；

含酸的乙醇溶液，是质量体积比g/ml，以含2％柠檬酸的50％乙醇溶液为例，该溶液是将2g柠檬酸溶于100ml的浓度为50％的乙醇溶液中。

实施例1：注射级的紫锥菊提取物

1、取紫锥菊根，粉碎，过15目筛，备用；

2、取紫锥菊粉末2000g，用紫锥菊重量8倍体积的含0.1％碳酸钠的水溶液(16000ml)，80℃温水浸提2次，每次提取1.5小时，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3、将步骤2中所得滤液，以4倍柱体积/小时流速通过凝胶型阴离子树脂柱，上样量为10g生药/树脂，以3倍柱体积的水洗涤除杂，再以8倍柱体积的含2％柠檬酸的50％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，得浓缩液500ml，备用；

4、将步骤3中所得浓缩液，加氯化钠50g，搅拌使溶解，用20％的盐酸调节pH＝1.5，静置，冷藏24小时，滤过，滤液弃去，沉淀用水400ml洗涤，即得注射级的紫锥菊提取物。

实施例2：注射级的紫锥菊提取物

1、取紫锥菊叶，粉碎，过15目筛，备用；

2、取步骤1紫锥菊粉末2000g，加紫锥菊重量9倍体积的含0.1％碳酸钠溶液(18000ml)，75℃温浸2次，每次提取2.0小时，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3、将步骤2中所得滤液，以5倍柱体积/小时流速通过凝胶型阴离子树脂柱，上样量为12g生药/树脂，以3倍柱体积水洗涤除杂，再以8倍柱体积的含4％柠檬酸的40％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，得浓缩液450ml，备用；

4、将步骤3中所得浓缩液，加氯化钠45g，搅拌使溶解，用20％的盐酸调节pH＝1.0，静置，冷藏24小时，滤过，滤液弃去，沉淀用水500ml洗涤，即得注射级的紫锥菊提取物。

实施例3：注射级的紫锥菊提取物

1、取紫锥菊根，粉碎，过20目筛，备用；

2、取紫锥菊粉末1000g，加紫锥菊重量10倍体积的含0.1％碳酸钠的水溶液(10000ml)，70℃温水浸提3次，每次提取1小时，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3、将步骤2中所得滤液，以4倍柱体积/小时流速通过凝胶型阴离子树脂柱，上样量为15g生药/树脂，以3倍柱体积水洗涤除杂，再以8倍柱体积的含2％柠檬酸的60％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，得浓缩液600ml，备用；

4、将步骤3中所得浓缩液，加氯化钠50g，搅拌使溶解，用15％的盐酸调节pH至2.0，静置，冷藏24小时，滤过，滤液弃去，沉淀用水600ml洗涤，即得注射级的紫锥菊提取物。

实施例4：注射级的紫锥菊提取物

1、取紫锥菊根，粉碎，过50目筛，备用；

2、取紫锥菊粉末1000g，加紫锥菊重量12倍体积的含0.2％碳酸钠的水溶液(12000ml)，80℃温水浸提2次，每次提取2小时，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3、将步骤2中所得滤液，以6倍柱体积/小时流速通过凝胶型阴离子树脂柱，上样量为15g生药/树脂，以5倍柱体积水洗涤除杂，再以10倍柱体积的含2％柠檬酸的50％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，得浓缩液700ml，备用；

4、将步骤3中所得浓缩液，加氯化钠60g，搅拌使溶解，用20％的盐酸调节pH至1.0，静置，冷藏24小时，滤过，滤液弃去，沉淀用水600ml洗涤，即得注射级的紫锥菊提取物。

对比例1：

参考CN200910255677.9(CN102100717A)的实施例作为提取方法，采用本发明实施例1的上柱法，进行吸附和洗脱，其中提取方法为：

用蒸馏水加热回流提取：将20倍量蒸馏水与紫锥菊药材混合，在微沸状态下回流提取1.5小时，过滤，收集滤液。

对比例2：

参考刘轶琛撰写的硕士论文“中国引种紫锥菊中酚酸类成分的研究”，2008年公开，具体方法为：

精密称取实施例1提供的紫锥菊提取物20g，加蒸馏水100ml溶解，加加酸调节pH值到3.0，超声30min，抽滤，滤渣加100ml的蒸馏水，加加酸调节pH值到3.0，超声20min，抽滤，弃去滤渣，将两次提取液合并均匀，即得紫锥菊提取物的上样原料液，将150ml浓度为4.95mg/ml的原料液以2BV/h的流速上样到聚酰胺柱体积为200ml的聚酰胺柱，静置吸附150min后，依次用400ml的去离子和1200ml浓度为50％的乙醇洗脱，洗脱速度为2BV/h。

实验例1：含量测定

1、对实施例1-4、对比例1、对比例2提供的提取物进行含量检测，检测方法为参照高效液相色谱法(《中国药典》2010版附录35页)测定，具体检测方法为：

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长330nm。理论板数按菊苣酸峰计算应不低于1500。

表1：菊苣酸含量测定梯度洗脱

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～20	15	85
20～22	15→40	85→60
			22～25	40→15	60→85

对照品溶液的制备 精密称取菊苣酸及咖啡酰酒石酸对照品适量，加70％甲醇制成每1ml各含40μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备 取实施例或对比例提供的提取物粉末，研细，取约0.05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声(功率250W，频率35kHz)处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1ml含紫锥菊以菊苣酸(C₂₂H₁₈O₁₂)计，为200.0mg。

2、测定结果：见表2

表2：提取物的含量检测

样品	菊苣酸含量	咖啡酰酒石酸含量
			实施例1	48％	25％
实施例2	43％	28％
			实施例3	45％	27％
实施例4	46％	26％
			对比例1	38％	20％
对比例2	36％	23％

表2结果显示：实施例1-4制得的注射级的紫锥菊提取物中，菊苣酸的含量不低于43％，咖啡酰酒石酸的含量不低于25％。

紫锥菊提取物的收率为1％-10％之间，含菊苣酸不低于40％。杂质照注射剂有关物质检查法(药典附录73页)检查，应符合规定。

实施例5：紫锥菊注射液的制备

将实施例1制备得到的注射级的紫锥菊提取物100g，加注射用水800ml，搅拌均匀，用20％的盐酸调节pH＝5.5，滤过，滤液加亚硫酸氢钠1.0g、吐温802g、三氯叔丁醇1.0g，加注射用水至1000ml，再加活性炭1.0g，加热煮沸30分钟，0.22μm薄膜滤过，热压灭菌15分钟，分装，得紫锥菊注射液970ml。

实施例6：紫锥菊注射粉针剂的制备

取实施例2制备得到的注射级的紫锥菊提取物100g，加注射用水500ml，甘露醇50g，搅拌均匀，用20％的盐酸调节pH＝6.5，滤过，滤液再加活性炭1.0g，加热煮沸30分钟，0.22μm薄膜滤过，热压灭菌20分钟，分装，冷冻干燥，得紫锥菊注射粉针剂100g。

实施例7：紫锥菊注射液的制备

将实施例3制备得到的注射级的紫锥菊提取物100g，加注射用水500ml，搅拌均匀，用20％的盐酸调节pH＝4.5，滤过，滤液加亚硫酸氢钠2.0g、吐温802g、三氯叔丁醇1.5g，加注射用水至1000ml，再加活性炭2.0g，加热煮沸20分钟，0.22μm薄膜滤过，辐照灭菌15分钟，分装，得紫锥菊注射液450ml。

实施例8：紫锥菊注射液的制备

将实施例4制备得到的注射级的紫锥菊提取物，加注射用水400ml，搅拌均匀，用20％的盐酸调节pH＝5.0，滤过，滤液加亚硫酸氢钠1.5g、吐温802g、三氯叔丁醇1.0g，加注射用水至500ml，再加活性炭3.0g，甘露醇45g。加热煮沸25分钟，0.22μm薄膜滤过，辐照灭菌20分钟，分装，得紫锥菊注射液450ml。

实验例2：对C57BL/6J小鼠NK细胞活性及淋巴细胞转化的影响

为进一步验证本发明的注射剂及制备工艺存在的优势，发明人考察了其对C57BL/6J小鼠NK细胞活性及淋巴细胞转化的影响。

1、材料与方法

1.1实验材料

受试药物：紫锥菊注射液(实施例5-8提供的注射液或冻干粉针，)，10ml/支，青岛康地恩药业有限公司提供。

对照药物：黄芪多糖注射液，衡阳科迪动物有限公司产品，批号20110531，10ml/支。

3H-TdR(氚标记胸腺嘧啶核苷)，上海原子核研究所提供，放射性浓度为20muci/ml。

1.2实验仪器

SN-6930型液体闪烁计数仪，上海核所日环光电仪器有限公司厂生产。

1.3实验动物

近交系小鼠C57BL/6J，雄性，体重18-20g，由上海斯莱克动物责任有限公司提供。合格证号：SCXK(沪)2007-0005

1.4给药剂量与途径

实验剂量设计为：实施例5提供的注射剂10ml/kg，30ml/kg，50ml/kg，实施例6提供的注射液30ml/kg(用注射用水溶解，使其浓度与实施例5注射液的浓度一致)、实施例7、8提供的注射液30ml/kg，对比例1和2提供的注射液30ml/kg(对比例1、2提供的提取物按照实施例5的方法制备成的注射液)，腹腔注射。

1.5实验方法

小鼠共100只，随机分为10组，每组10只。分别为实施例5高、中、低3个剂量组，实施例6、实施例7、实施例8、对比例1、对比例2、阳性对照组和空白组。

分组后第二天开始给药，每日一次，按照每组的剂量腹腔注射给药，连续给药2周。最后一次给药后，过1小时后断颈处死小鼠，无菌取脾，用手术剪刀将脾脏剪碎分离细胞，用1640培养剂制成细胞悬液，进行NK细胞活性测定及淋转实验。

1.5.1NK细胞活性测定：在96孔培养板中加入1×106/ml浓度脾细胞100ul作为效应细胞，另取已培养24小时处于旺盛生长期的YAC-1、浓度1×104/ml细胞100ul作为靶细胞加入培养板中，同时加3H-TdR0.4uci/孔在37℃、CO₂培养箱中培养24小时，收集细胞在液闪仪上测定CPM值，各组10复孔。

1.5.2淋巴细胞转化测定：在96孔培养板中加入1×107/ml浓度脾细胞100ul，ConA(50ug/ml)50ul,在5％CO₂、37℃培养箱中培养48小时，加入20ul3H-TdR培养24小时，各组10复孔，对照管用培养剂代替，培养结束后在多孔细胞收集器上收集细胞，5％TCA固定，无水乙醇脱水，液闪仪上测定CPM值。

NK活性(PI％)＝(对照组CPM值-实验组CPM值)/对照组CPM值×100％

淋转指数＝实验组CPM值/对照组CPM值

2、实验结果与分析

2.1对小鼠NK细胞活性的影响：见表2

表3：紫锥菊注射液对小鼠NK细胞活性的影响

组别	剂量(ml/kg)	动物数(只)	CPM值	NK活性(pi)(％)
					实施例5低剂量组	10	10	11476±1498	—
实施例5中剂量组	30	10	9941±2077	9.81
					实施例5高剂量组	50	10	9720±733**	11.81
实施例6组	30	10	9940±2067	10.64
					实施例7组	30	10	12650±2057	—
实施例8组	30	10	11950±1057	6.76
					对比例1组	30	10	12650±2057	—
对比例2组	30	10	11950±1057	6.76
					阳性对照	30	10	10167±910	7.75
空白对照	—	10	11022±874	—

注：各组与空白对照组比较：*表示显著差异(P＜0.05)；**表示极显著差异(P＜0.01)。

由表3可知：紫锥菊注射液高剂量组能够显著性地增强小鼠NK细胞的活性，中、低剂量及阳性对照药组在本实验中作用不明显。

2.2对小鼠淋巴细胞转化的转化的影响

表4：紫锥菊注射剂对小鼠淋巴细胞转化的影响

组别	剂量(g/kg)	动物数(只)	CPM值	淋转指数(SI)
					实施例5低剂量组	10	10	6036±1591	0.70
实施例5中剂量组	30	10	12299±2411**	1.42
					实施例5高剂量组	50	10	15826±3034**	1.82
实施例6组	30	10	14345±2611**	1.65
					实施例7组	30	10	13876±2561**	1.70
实施例8组	30	10	14966±2678**	1.68
					对比例1组	30	10	7876±2601**	0.87
对比例2组	30	10	6985±1591**	0.93
					阳性对照	30	10	10878±3236	1.25
空白对照	—	10	8680±1615	—

注：各组与空白对照组比较：*表示显著差异(P＜0.05)；**表示极显著差异(P＜0.01)

由表3可知：紫锥菊注射液中、高剂量组对淋巴细胞转化具有显著的促进作用(SI>1为促进)，并呈现出剂量相关性。阳性对照药也表现出一定的促进作用。

实验例3：对在临床上对鸡新城疫疫苗抗体效价的影响。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1试验药物

紫锥菊注射液，青岛康地恩药业有限公司生产，批号20111211，10ml/支。

1.1.2对照药物

黄芪多糖注射液，衡阳科迪动物有限公司产品，批号20110631，10ml/支。

1.1.3实验动物

罗曼鸡，1日龄，370只，购自青岛市城阳区康信种鸡场。

1.1.4疫苗

新城疫IV系苗，批号080411，黑龙江生物制品厂生产。

1.2方法

1.2.1实验分组及处理

1日龄蛋公鸡，挑选150只鸡作为实验鸡，随机分为5组，每组30只。从10日龄开始分别按照表5方案进行给药，13日龄用新城疫IV系苗滴鼻点眼免疫，2头份/只。

表5：试验分组及处理方法

组别	说明	药物使用剂量
			1	紫锥菊注射液1组(实施例5)	0.1ml肌注，新城疫苗免疫
2	紫锥菊注射液2组(实施例5)	0.2ml肌注，新城疫苗免疫
			3	紫锥菊注射液3组(实施例5)	0.4ml肌注，新城疫苗免疫
4	紫锥菊注射液4组(实施例6)	1.0ml肌注，新城疫苗免疫
			5	紫锥菊注射液5组(实施例7)	1.2ml肌注，新城疫苗免疫
6	紫锥菊注射液6组(实施例8)	1.1ml肌注，新城疫苗免疫
			7	黄芪多糖注射液对照组	1.0ml肌注，新城疫苗免疫
8	健康对照组	不给药，不免疫
			9	空白对照组	不给药，免疫

1.2.2鸡新城疫HI抗体效价

分别于10、13、16、19、22日龄每组随机抽取10只颈静脉采血，分离血清，采用红细胞凝集抑制试验法(HI)检测ND抗体效价。具体方法为：

(1)取一块洁净的96孔“V”型微量血凝反应板，在每孔中加生理盐水50μL(每一份血清加一列)

(2)将被检血清50μL加入第一孔中，充分混合后，取50μL加入第2孔中，如此稀释直至第11孔，混匀后吸取50μL丢弃，第12孔不加血清作为对照。

(3)根据血凝试验测定的病毒凝集效价，配制4个血凝单位的病毒抗原。在每孔中加入4单位病毒稀释液50μL。

(4)将反应板置振荡器上振荡1min，取下室温放置10min。

(5)在每孔中加入1％鸡红细胞悬液各50μL。

(6)置微型振荡器上振荡3min，取下放室温15min，观察判定记录结果。

(7)判定标准：以使红细胞完全发生凝集抑制的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制效价。

2、实验结果与分析：见表6

表6：新城疫HI抗体效价

注：上标字母相同表示差异不显著(p>0.05)，字母不同表示差异显著(p<0.05)

由表6可知，第4、5组的抗体效价较高，即将紫锥菊注射剂以1.0ml、1.2ml、肌注用效果较好，其中以1.0ml注射用的效果最好。

实验例小结：由以上试验可以看出，本发明提供的紫锥菊注射液对C57BL/6J小鼠NK细胞活性及淋巴细胞转化的影响与在临床上对鸡新城疫疫苗抗体效价的影响明显优于阳性对照药物，且未出现明显副作用，说明本发明安全可靠，可用于大生产临床使用。

实验例4：稳定性考察、溶血性、血管刺激性、过敏性实验

1、稳定性实验：使用本专利发明制备紫锥菊注射液经长期稳定性试验，加速稳定性试验。

结果表明：本发明提供的注射液性质稳定，性状未发生任何改变，稳定性良好。

2、血管刺激性、溶血性和过敏反应

本发明分别以家兔和豚鼠为实验动物，给紫锥菊注射液后观察动物有无血管刺激作用及溶血和过敏反应。

结果：滴注部位未出现明显的血管刺激反应及过敏反应，对家兔红细胞未产生溶血和凝集作用。

结论：本发明提供的紫锥菊注射液无血管刺激性、过敏性及溶血性。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种注射级的紫锥菊提取物，其特征在于，所述提取物由以下方法制备：

1)紫锥菊粉碎，过10-40目筛，备用；

2)取紫锥菊粉末，加紫锥菊重量6-12倍体积的浓度为0.05-0.20％碱溶液，60-90℃温水浸提2-4次，每次提取1-3小时，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3)以2-6倍柱体积/小时流速通过阴离子交换树脂柱，上样量不超过15g生药/树脂，以2-5倍柱体积水洗涤除杂，再以6-10倍柱体积含1-5％酸的40％-60％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，得浓缩液，备用；

4)将步骤3)中所得浓缩液加其重量1-15％氯化钠，搅拌使溶解，用浓度为20％的盐酸调节pH至0.5-3.0，静置，冷藏24小时，滤过，滤液弃去，沉淀用适量水洗涤，即得紫锥菊提取物。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述提取物由以下方法制备：

1)紫锥菊粉碎，过10-24目筛，备用；

2)取紫锥菊粉末，加紫锥菊重量6-10倍体积的浓度为0.1-0.2％碱溶液，70-80℃温水浸提2-4次，每次提取1-2小时，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3)以4-6倍柱体积/小时流速通过阴离子交换树脂柱，上样量8-15g生药/树脂，以3-5倍柱体积水洗涤除杂，再以8-10倍柱体积含2-4％酸的40％-60％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，得浓缩液，备用；

4)将步骤3)中所得浓缩液加2.25-3％氯化钠，搅拌使溶解，用20％的盐酸调节pH至1-2，静置，冷藏24小时，滤过，滤液弃去，沉淀用适量水洗涤，即得注射用的紫锥菊提取物。

3.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述提取物由以下方法制备：

1)紫锥菊粉碎，过15目筛，备用；

2)取紫锥菊粉末，加8倍量0.1％碱溶液，80℃温水浸提2次，每次提取1.5小时，滤过，药渣弃去，滤液合并，备用；

3)将步骤2)中所得滤液，以4倍柱体积/小时流速通过阴离子树脂柱，上样量为10g生药/树脂，以3倍柱体积水洗涤除杂，再以8倍柱体积的含2％酸的50％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，得浓缩液，备用；

4)将步骤3)中所得浓缩液，加2.5％的氯化钠，搅拌使溶解，用20％的盐酸调节pH＝1.5，静置，冷藏24小时，滤过，滤液弃去，沉淀用适量水洗涤。

4.根据权利要求1-3任一项所述的提取物，其特征在于，紫锥菊为紫锥菊的根或叶，或二者的混合物。

5.根据权利要求1-3任一项所述的提取物，步骤2)中：所述碱为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、浓氨水的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的提取物，步骤2)中：所述碱为碳酸钠。

7.根据权利要求1-4任一项所述的提取物，步骤3)中：

所述阴离子交换树脂柱为凝胶型阴离子交换树脂或大孔型阴离子交换树脂；

所述含酸的乙醇溶液中，所述酸为浓盐酸、磷酸、浓硫酸、冰醋酸、柠檬酸的一种或几种。

8.根据权利要求7所述的提取物，步骤3)中：所述含酸的乙醇溶液中，所述酸为柠檬酸。

9.一种含权利要求1-8任一项所述提取物的注射剂，所述注射剂为冻干粉针或注射液；所述注射液由以下成分组成：紫锥菊提取物10-20％、抗氧剂0.05-0.2％、助溶剂0.1-0.2％、止疼剂0.1-0.5％，余量为注射用水；

所述冻干粉针由紫锥菊提取物和辅料组成，其中辅料为紫锥菊提取物的0.5-0.8倍，所述辅料为甘露醇、亚硫酸氢钠、吐温-80、三氯叔丁醇。

10.根据权利要求9所述的注射剂，其特征在于，所述注射剂的制备方法包括以下步骤：

将注射用的紫锥菊提取物加注射用水至80-800ml，搅拌均匀，用20％的盐酸调节pH＝4.5-6.5，滤过，滤液加配方量的抗氧剂、助溶剂及止疼剂，加注射用水至适量，搅拌均匀，再加0.5％-1％活性炭，加热煮沸10-30分钟，薄膜滤过，将薄膜滤过后所得滤液分装，灭菌，得紫锥菊注射液；或将所述薄膜滤过后所得滤液加适量甘露醇，经冷冻干燥，得紫锥菊注射粉针剂。

11.权利要求1-8任一项所述的提取物或权利要求9或10所述的制剂制备治疗动物免疫功能低下或提高疫苗免疫效果的药物中的应用。