CN111053795A - 一种四季青提取物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种四季青提取物的制备方法及其应用，属于兽药领域。其技术方案为：制备方法包括以下步骤：S1、取适量四季青干燥后粉碎，过10目～24目筛，得到四季青粉，备用；S2、取步骤S1中得到的四季青粉加适量浓度的酸性乙醇回流提取1.5～3.0小时，并进行过滤，收集药渣和滤液，将滤液备用；S3、将步骤S2中得到的滤液减压浓缩至60℃并测定得到相对密度为1.01～1.06的浸膏；S4、将步骤S3中得到的浸膏进行喷雾干燥，得到四季青提取物。本发明的有益效果为：本发明的四季青提取物，对猪伪狂犬病病毒感染增殖具有抑制作用，同时针对四季青中所含的多酚类成分，而多酚类成分一般是以其盐类存在，采用酸性乙醇进行回流提取，使提取率大大提升。

Description

一种四季青提取物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种兽药领域，尤其涉及四季青提取物的制备方法及其应用。
背景技术
猪伪狂犬病(Pseudorabies PR)是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies PRV）引起的一种急性传染病。该病在猪呈暴发性流行。可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。病毒性疾病的治疗药物研发较迟缓，主要是由于病毒有严格的寄生性，病毒感染病毒后，在宿主细胞内利用细胞酶系统复制；有些病毒核酸整合于细胞染色体，难以清除；病毒寄生在细胞内，使得药物杀伤病毒的同时对机体细胞也有损害。现有的抗病毒化学药物因为毒性太大或耐药性，其临床难以取得令人满意的效果。现有疫苗不能对猪群提供完全保护，给其防制带来了巨大困难，急需寻找新的防控方案。传统中药毒副作用小，耐药性低，价格低廉，药物作用靶点多，并且具有免疫调节的功能，筛选高效低毒的抗病毒中药是当前抗病毒研究热点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种四季青提取物，对猪伪狂犬病病毒感染增殖具有抑制作用，同时针对四季青中所含的多酚类成分，而多酚类成分一般是以其盐类存在，采用酸性乙醇进行回流提取，使提取率大大提升。
本发明是通过如下措施实现的：
一种四季青提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、取适量四季青干燥后粉碎，过10目～24目筛，得到四季青粉，备用；
S2、取步骤S1中得到的四季青粉加适量浓度的酸性乙醇回流提取1.5～3.0小时，并进行过滤，收集药渣和滤液，将滤液备用；
S3、将步骤S2中得到的滤液减压浓缩至60℃并测定得到相对密度为1.01～1.06的浸膏；
S4、将步骤S3中得到的浸膏进行喷雾干燥，得到四季青提取物。
本发明的具体特点还有：
所述制备方法包括以下步骤：
S1、取适量四季青干燥后粉碎，过10目～24目筛，得到四季青粉，备用；
S2、取步骤S1中得到的四季青粉加适量浓度的酸性乙醇回流提取2小时，并进行过滤，收集药渣和滤液，将滤液备用；
S3、将步骤S2中得到的滤液减压浓缩至60℃并测定得到相对密度为1.03的浸膏；
S4、将步骤S3中得到的浸膏进行喷雾干燥，得到四季青提取物。
所述S2步骤中的加四季青粉重量7-10倍量体积的含0.1%-0.5%酸的20%-70%乙醇溶液进行回流提取。
所述S2步骤中的酸性乙醇为含0.1%～0.5%酸的20%～70%乙醇，所述性酸乙醇，是将0.1～0.5%的酸溶于100ml浓度为20～70%的乙醇中。
所述步骤S1中的四季青为四季青的全草或叶的一种或几种混合物，所述S2步骤中的酸为浓盐酸、磷酸、冰醋酸、柠檬酸中的一种或几种。
所述四季青提取物用于制备抗猪伪狂犬病病毒的药物中的应用。
本发明的有益效果为：本发明的四季青提取物，对猪伪狂犬病病毒感染增殖具有抑制作用，同时针对四季青中所含的多酚类成分，而多酚类成分一般是以其盐类存在，加入适量酸后，多酚类成分呈游离态，亲脂性增强，易溶于高浓度乙醇中，比单独用水或一定浓度乙醇提取率要高，采用酸性乙醇进行回流提取，使提取率大大提升。
附图说明
图1 为本发明实施例实验一中空斑形成试验测定6种中草药提取物对PRV增殖的抑制效果图。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1：
所述制备方法包括以下步骤：
S1、取适量四季青干燥后粉碎，过10目～24目筛，得到四季青粉，备用；
S2、取步骤S1中得到的四季青粉加适量浓度的酸性乙醇回流提取1.5小时，并进行过滤，收集药渣和滤液，将滤液备用；
S3、将步骤S2中得到的滤液减压浓缩至60℃并测定得到相对密度为1.02的浸膏；
S4、将步骤S3中得到的浸膏进行喷雾干燥，得到四季青提取物。
所述S2步骤中的加四季青粉重量7倍量体积的含0.2%酸的30%乙醇溶液进行回流提取。
所述S2步骤中的酸性乙醇为含0.2%酸的30%乙醇，所述性酸乙醇，是将0.2%的酸溶于100ml浓度为30%的乙醇中。
所述步骤S1中的四季青为四季青的全草或叶的一种或几种混合物，所述S2步骤中的酸为浓盐酸、磷酸、冰醋酸、柠檬酸中的一种或几种。
所述四季青提取物用于制备抗猪伪狂犬病病毒的药物中的应用。
实施例2：
所述制备方法包括以下步骤：
S1、取适量四季青干燥后粉碎，过10目～24目筛，得到四季青粉，备用；
S2、取步骤S1中得到的四季青粉加适量浓度的酸性乙醇回流提取2小时，并进行过滤，收集药渣和滤液，将滤液备用；
S3、将步骤S2中得到的滤液减压浓缩至60℃并测定得到相对密度为1.03的浸膏；
S4、将步骤S3中得到的浸膏进行喷雾干燥，得到四季青提取物。
所述S2步骤中的加四季青粉重量8倍量体积的含0.3%酸的40%乙醇溶液进行回流提取。
所述S2步骤中的酸性乙醇为含0.3%酸的40%乙醇，所述性酸乙醇，是将0.3%的酸溶于100ml浓度为40%的乙醇中。
所述步骤S1中的四季青为四季青的全草或叶的一种或几种混合物，所述S2步骤中的酸为浓盐酸、磷酸、冰醋酸、柠檬酸中的一种或几种。
所述四季青提取物用于制备抗猪伪狂犬病病毒的药物中的应用。
实施例3：
所述制备方法包括以下步骤：
S1、取适量四季青干燥后粉碎，过10目～24目筛，得到四季青粉，备用；
S2、取步骤S1中得到的四季青粉加适量浓度的酸性乙醇回流提取3小时，并进行过滤，收集药渣和滤液，将滤液备用；
S3、将步骤S2中得到的滤液减压浓缩至60℃并测定得到相对密度为1.05的浸膏；
S4、将步骤S3中得到的浸膏进行喷雾干燥，得到四季青提取物。
所述S2步骤中的加四季青粉重量9倍量体积的含0.4%酸的65%乙醇溶液进行回流提取。
所述S2步骤中的酸性乙醇为含0.4%酸的65%乙醇，所述性酸乙醇，是将0.4%的酸溶于100ml浓度为65%的乙醇中。
所述步骤S1中的四季青为四季青的全草或叶的一种或几种混合物，所述S2步骤中的酸为浓盐酸、磷酸、冰醋酸、柠檬酸中的一种或几种。
所述四季青提取物用于制备抗猪伪狂犬病病毒的药物中的应用。
本四季青提取物的制备方法的发明人在针对PRV感染增殖具有抑制作用方面，进行了一系列实验研究，确定了本四季青提取物对PRV感染增殖具有抑制作用。
实验一、空斑试验检测中草药提取物对PRV感染增殖的抑制作用
1、中药对细胞无毒浓度的测定
取穿心莲、灵芝、大青叶、蒲公英和海藻提取物以及本发明中制备完成的四季青提取物，加水配成不同浓度的溶液，根据不同提取物的溶解度将其分别融入DMEM细胞培养基，0.22um滤器过滤，-80℃保存。运用MTT法和显微镜观察6种中草药提取物对Vero细胞的细胞毒性。获得这6种中草药提取物对Vero细胞的安全浓度分别是：1.69g/L、3.75g/L、2.5g/L、6.25g/L、3.125g/L、0.59g/L，以上安全浓度说明6种中草药提取物对Vero细胞毒性很低，灵芝提取物甚至可以促进细胞增长。
2、空斑试验
在对细胞无毒性的条件下，使用空斑形成实验检测6种中草药提取物在体外对PRV感染增殖的抑制效果。
病毒空斑试验是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中，病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。
每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料溴化二苯基四氮唑（MTT）染色，黄色的MTT能将活细胞染成深蓝色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的空斑/蚀斑(plaque)。加入穿心莲、四季青、灵芝、大青叶、蒲公英和海藻溶液，由于中药提取物溶液具有一定的抗病毒活性，可减少空斑的形成。
按常规培养细胞，待长成致密细胞单层后，将含中药的维持液与猪伪狂犬病毒液等量混合，25℃作用2h后感染新形成的细胞单层，弃去上清液后加入含1.5%琼脂糖凝胶覆盖液，待其凝固成胶冻状，将培养板翻转，置35℃、5%CO2培养箱中培养3d。每日观察细胞病变情况，除去胶冻状培养基，用10%甲醛固定30min，弃去甲醛，用活性染料溴化二苯基四氮唑（MTT）染色，用自来水漂洗，记录空斑数。
3、空斑试验结果
空斑试验可以精确测定病毒的感染程度，病毒空斑数目减少意味着某一病毒液中感染性病毒颗粒含量减少，病毒的感染力下降，本试验结果如图1所示，四季青组几乎没有空斑形成，提示该药物基本上抑制了病毒的复制，能阻断猪伪狂犬病毒空斑的形成。
附图1中结果表明：6种中草药提取物对PRV感染增殖具有抑制作用。四季青、灵芝提取物抑制效果最明显，这可能是由于提取物中的醇基、酮基与PRV吸附蛋白相互作用从而影响病毒的吸附。
实验二、含量测定
1、色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm。理论板数按长梗冬青苷峰计算应不低于3000。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
对照品溶液的制备：取长梗冬青苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每lml含O.3mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本发明制备的四季青提取物粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，含长梗冬青苷(C36H58010)不得少于1.35％。

Claims (6)

1.一种四季青提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、取适量四季青干燥后粉碎，过10目～24目筛，得到四季青粉，备用；
S2、取步骤S1中得到的四季青粉加适量浓度的酸性乙醇回流提取1.5～3.0小时，并进行过滤，收集药渣和滤液，将滤液备用；
S3、将步骤S2中得到的滤液减压浓缩至60℃并测定得到相对密度为1.01～1.06的浸膏；
S4、将步骤S3中得到的浸膏进行喷雾干燥，得到四季青提取物。
2.根据权利要求1所述四季青提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、取适量四季青干燥后粉碎，过10目～24目筛，得到四季青粉，备用；
S2、取步骤S1中得到的四季青粉加适量浓度的酸性乙醇回流提取2小时，并进行过滤，收集药渣和滤液，将滤液备用；
S3、将步骤S2中得到的滤液减压浓缩至60℃并测定得到相对密度为1.03的浸膏；
S4、将步骤S3中得到的浸膏进行喷雾干燥，得到四季青提取物。
3.根据权利要求2所述四季青提取物的制备方法，其特征在于，所述S2步骤中的加四季青粉重量7-10倍量体积的含0.1%-0.5%酸的20%-70%乙醇溶液进行回流提取。
4.根据权利要求3所述四季青提取物的制备方法，其特征在于，所述S2步骤中的酸性乙醇为含0.1%～0.5%酸的20%～70%乙醇。
5.根据权利要求4所述四季青提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的四季青为四季青的全草或叶的一种或几种混合物，所述S2步骤中的酸为浓盐酸、磷酸、冰醋酸、柠檬酸中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的四季青提取物的制备方法，其特征在于，所述四季青提取物用于制备抗猪伪狂犬病病毒药物中的应用。
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