CN103713065A - 一种同时检测多种真菌毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种同时检测多种真菌毒素的方法，该方法先对样品进行提取净化；净化液经液相色谱串联质谱技术检测，最后通过同位素内标稀释法准确测定农产品中多种真菌毒素。本发明的一种同时检测多种真菌毒素的方法可以应用于玉米、小麦、香菇等植物中33种真菌毒素的同时检测。本发明的方法具有耗时短，灵敏准确的特点，可适用于大批量样品同时检测。

Description

一种同时检测多种真菌毒素的方法

技术领域

本发明涉及农产品安全检测技术领域，具体地说涉及一种同时检测多种真菌毒素的方法。

背景技术

由于人口和环境的压力，全世界正面临着巨大的食用农产品供给和安全的双重挑战。据联合国粮农组织（FAO）资料，全球每年约有25%的农作物遭受真菌毒素的污染，约有2%的农作物因污染严重而失去营养和经济价值，造成的直接和间接损失达数百亿美元。谷类及其它农作物从田间到餐桌，产业链的各个环节均存在真菌污染的风险。这些真菌可能产生一系列具有不同化学结构的有毒次生代谢产物，称为真菌毒素。真菌毒素污染已成为世界性公共安全问题，其污染的普遍性、严重性和防控的难度远远超过人们的实际感受。目前已发现的真菌毒素有300多种，对人类危害大的有几十种，它们一般同时具有毒性强和污染频率高的特点，其中包括黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2、M1、M2）、赭曲霉毒素(A、B)、玉米赤霉烯酮及其衍生物类毒素(α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇)、A型单端孢霉烯族（T-2毒素、HT2毒素等）、B型单端孢霉烯族（脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯酮、隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇）等。

近年来我国出口的食用农产品特别是花生遭到了欧盟、日本等一些国家的技术壁垒，目前，欧盟和其它发达国家所限制食品中真菌毒素的种类正在不断增加，且在各种农作物中的限量值一降再降，对我国的出口业务产生了很大的影响。出口的农作物由于真菌毒素超过输入国限量标准而遭拒收或降低等级的现象常有发生。美国、欧盟及我国对不同食用农产品中各种真菌毒素的限量标准规定如下：

①美国规定食品中黄曲霉毒素B的总量≤20μg/kg，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量≤1000μg/kg，玉米赤霉烯酮的含量≤100μg/kg；奶及乳制品中黄曲霉毒素M1的含量≤0.5μg/kg。

②欧盟规定农产品中黄曲霉毒素B的总量≤4μg/kg，黄曲霉毒素B1的含量≤2μg/kg，赭曲霉毒素A的含量≤3μg/kg，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量≤1000μg/kg，玉米赤霉烯酮的含量≤50μg/kg；婴幼儿食品中，黄曲霉毒素B的总量≤2μg/kg，黄曲霉毒素B1的含量≤0.1μg/kg，黄曲霉毒素M1的含量≤0.025μg/kg，赭曲霉毒素A的含量≤0.5μg/kg，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量≤150μg/kg，玉米赤霉烯酮的含量≤20μg/kg。

③我国规定玉米、花生及其制品中黄曲霉毒素B1的含量≤20μg/kg，赭曲霉毒素A的含量≤5μg/kg，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量≤1000μg/kg，玉米赤霉烯酮的含量≤60μg/kg；大米、植物油（除玉米油、花生油）中黄曲霉毒素B1的含量≤10μg/kg；其它粮食、豆类、发酵食品中黄曲霉毒素B1的含量≤5μg/kg；婴幼儿食品中黄曲霉毒素B1的含量≤5μg/kg，黄曲霉毒素M1的含量≤0.5μg/kg；鲜乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的含量≤0.5μg/kg。

农产品安全检测能力是衡量一个国家（地区）农产品安全水平的关键指标，在农产品安全控制系统中处于优先地位。目前，食用农产品中真菌毒素的检测方法可以分为两类：酶联免疫分析法和色谱分析法。

酶联免疫吸附测定方法（ELISA）适用于大批量样品的快速筛选，可以在较短的时间内完成大批量样品的分析，具有操作简便、快速、检测成本较低等优点，但缺点是检出结果有假阳性存在，且不能准确定量，每次只能对一种或少数几种毒素进行检测。

色谱分析法包括薄层色谱扫描法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）以及LC、GC与质谱联用法等。其中，TLC法在确证新发现的真菌毒素和检测方法学研究等方面，具有一定的优越性，但是用薄层色谱法定量不够准确，分离效率差，自1985年以后便很少用作真菌毒素的确认法。应用气相色谱结合火焰离子化检测器或质谱检测器联用技术对真菌毒素中的单端孢霉烯族类毒素(如T-2、DON等)的检测报道较多，但是对于其它高沸点或者热不稳定的真菌毒素，需要经过复杂的衍生化过程，因而相对应用较少。

总体上看，我国对食用农产品中真菌毒素的分析方法研究尚不完善，即使是研究相对广泛的黄曲霉毒素，也主要针对黄曲霉毒素B1和M1，而对其它结构相似且同样具有毒性的黄曲霉毒素，如黄曲霉毒素M2，则较少涉及。赭曲霉毒素、伏马毒素等也是具有类似结构的一组化合物，受限于分析技术水平，目前报道的分析方法多数只测定其中的一类毒素。然而，来自全球和我国地方省市的调查研究表明，各类食用农产品，各个地区，各个季节均有真菌毒素污染，检出率可高达70％-100％。污染农产品中的检出毒素少则两三种，多则十几种，呈现多种真菌、多种毒素复合污染的特征，一旦检出某种毒素，必定还有其他毒素存在。可见，一种食用农产品可以同时被多种真菌污染，从而产生多种真菌毒素。因此建立高通量、多残留的真菌毒素分析方法非常有必要。

然而，由于不同种类真菌毒素化学结构、色谱行为、光学特性相似，一般的分离方法无法将其在短时间内同时分离，而农产品的复杂成分产生的基质干扰作用，更使得多种真菌毒素同时高效检测极具挑战性。目前，尚缺乏能够同时对不同食用农产品（玉米、小麦、香菇）中能够涵盖六大类主要真菌毒素多残留检测的分析方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测多种真菌毒素的方法，该方法为：

先对样品进行提取净化；净化液经液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）检测，最后通过同位素内标稀释法准确测定样品中多种真菌毒素。

该方法尤其适合同时检测玉米、小麦和香菇中的多中国真菌毒素。

具体的说，本发明的一种同时检测多种真菌毒素的方法，包括如下步骤：

①对样品进行提取净化：

将样品粉末中加入样品含量的0.0001%-0.1%的同位素内标混合液（m/m）；

然后加入样品量的2-5倍的水（v/m），浸泡5-10min后，超声30-90min；

然后加入样品量的2-5倍量（v/m）的含0.1%-2%（v/v）甲酸的乙腈溶液，涡旋混匀后，超声30-90min；

再加入样品重量的0.5-2倍（重量）的无水硫酸镁和0.1-1倍（重量）的氯化钠，加入后剧烈震摇10-60s，超声5-15min，在5000-15000r/min转速下离心5-15min；

然后取离心上清液于30-50℃下氮气吹干；

残渣用乙腈/醋酸铵水溶液溶解，过0.22μm的滤膜后，过滤液（即净化液）待进样分析；

其中所用的同位素内标混合液为¹³C-AFB1、¹³C-OTA、¹³C-T2、¹³C-ZEN和¹³C-DON的混合液；

具体的同位素内标混合液为：50ng mL^-1的¹³C-AFB1、¹³C-OTA、¹³C-T2以及500ngmL^-1的¹³C-ZEN、¹³C-DON的混合液；

②液相色谱质谱串联分析：

其中液相分离的条件为：色谱柱为Agilent Poroshell120EC-C18柱（100mm×3mm,2.7μm）或与其性质类似的反相色谱柱，采用线性梯度洗脱，流动相为醋酸铵水溶液或甲醇/乙腈溶液；

通过多反应监测（MRM）方式进行准确定量，33种真菌毒素及5种同位素内标的母离子、子离子、碰撞能量等参数见表1；

③同位素内标法定量：

采用同位素内标稀释法建立各种真菌毒素标准曲线，采用内标法定量算出测定液待测

组分的浓度，按式（1）计算真菌毒素含量。

$X=\frac{C*V}{M}---\left(1\right)$

式中：

X——样品中待测组分的含量，单位微克每千克，μg/kg；

C——测定液中待测组分的浓度，单位纳克每毫升，ng/mL；

V——定容体积，单位毫升，mL；

M——样品称样量，单位克，g。

其中本发明所用的液相色谱串联质谱仪为LC-MS/MS，SHIMADZU，Kyoto，Japan及其性质类似仪器，如超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）。

表1真菌毒素的MRM参数

本发明的一种同时检测多种真菌毒素的方法可以应用于玉米、小麦、香菇等植物中33种真菌毒素（黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2）、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮及其衍生物类毒素(α-玉米赤霉烯醇（α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZOL）、玉米赤霉烯酮（ZON）、玉米赤霉酮（ZAN）、α-玉米赤霉醇（α-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL）)、A型单端孢霉烯族（T-2毒素、HT2毒素、新茄病镰刀菌烯醇（NEO）、二乙酰藨草镰刀菌烯醇（DAS）等）、B型单端孢霉烯族（脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、雪腐镰刀菌烯醇（NIV）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ADON）、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-ADON）、镰刀菌烯酮（Fus X）、去环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deepoxy-DON））、伏马毒素（FB1、FB2）、杂色曲霉素（SMC）、胶黏毒素（gliotoxin）、展青霉素（PAT）、镰刀菌酸（fusaric acid）、桔青霉素（CIT）、环匹阿尼酸（CPA）、震颤毒素（VER）、霉酚酸（MPA））的同时提取、净化和检测。

本发明与其他检测方法相比具有耗时短，灵敏准确的特点，可适用于大批量样品同时检测。同时本发明解决了传统的真菌毒素由于化学性质不同难以同时提取检测的问题。本方法的建立使玉米、小麦和香菇等植物和食用菌中广泛污染的涵盖六大类33种主要真菌毒素的含量得以准确测定，能为农产品真菌毒素风险评估提供准确的分析方法，保证本国经济增长的同时打破国际贸易壁垒，促进食用农产品的进出口贸易。

具体实施方式

实施例一

取市场采集的玉米、小麦、香菇样品，分别按下述操作过程进行分析检测。

取玉米、小麦、香菇样品，粉碎后过筛，置于-20℃的冰箱内保存待用。

将样品取出恢复至室温后，取2g样品粉末置于50mL离心管中，加入200μL的上述五种同位素内标混合液（50ng mL^-1的¹³C-AFB1、¹³C-OTA、¹³C-T2以及500ng mL^-1的¹³C-ZEN、¹³C-DON）。

将加入同位素内标溶液的样品室温下静置1h，加入5mL水浸泡5min，超声40min，然后加入5mL含1%甲酸的乙腈溶液，涡旋混匀30s，超声40min。

加入2g无水硫酸镁和0.5g氯化钠，加入后立即剧烈震摇30s，超声10min，在10000r/min转速下离心10min；。

取4mL离心上清液40℃下氮气吹干。

残渣先加入200μL的乙腈，涡旋30s，然后加入800μL的乙腈/5mM的醋酸铵水溶液（20/80，v/v），再次涡旋30s后，过0.22μm的滤膜后，进样LC-MS/MS分析。

液相色谱串联质谱仪为LC-MS/MS，SHIMADZU,Kyoto,Japan。

液相分离条件为：色谱柱为Agilent Poroshell120EC-C18柱（100mm×3mm,2.7μm），线性梯度洗脱，流动相为（A）5mM的醋酸铵水溶液（B）甲醇。梯度洗脱条件为：5%B（初始），5-20%B（2min），20-100%B（2-13min），100%B（13-14.5min），100-5%B（14.5-15min），平衡3min，总共单次样品运行时间为18min。流动相流速为0.2mL min^-1，进样量为5μL。

串联质谱检测条件为：雾化器流量：3L min^-1；干燥气流量：3L min^-1；接口电压：4.5kV；DL温度：250℃；热阻温度：400℃。通过MRM方式进行定量。

进一步对方法进行验证，包括以下几部分内容：

（1）标准曲线：将标准储备液分别用空白玉米、小麦和香菇基质稀释，配成（0.5,1,2,5,10,20,50,100,200,500,800ng mL^-1）的系列标准溶液，每份标准溶液中含100μL的同位素内标混合溶液（50ng mL^-1的¹³C-AFB1,¹³C-OTA,¹³C-T2以及500ng mL^-1的¹³C-ZEN,¹³C-DON），其中28种真菌毒素采用内标法构建标准曲线，分别为（1）¹³C-AFB1为AFB1,AFB2,AFG1,AFG2,AFM1,AFM2,SMC和NEO的内标，（2）¹³C-OTA为OTA和DAS的内标，（3）¹³C-T2为T-2,HT2,MPA,FB1,FB2和VER的内标，（4）¹³C-ZEN为ZEN,ZAN,α-ZOL,α-ZAL,β-ZOL和β-ZAL的内标，（5）¹³C-DON为DON,Fus X,Deepoxy-DON,3-ADON,15-ADON和CPA的内标。另外五种真菌毒素（fusaric acid,glitoxin,CIT,PAT,NIV.）采用基质加标法建立标曲，在相应的线性范围内，所有的真菌毒素在不同的基质中均线性良好，相关系数R2≥0.99。

（2）灵敏度：将标准品溶液用基质梯度稀释的方法测定方法的灵敏度，方法的定量限范围为0.2-15ng mL^-1，检出限为0.1-10ng mL^-1。

（3）回收率：采用基质加标法对方法的回收率进行考察，高、中、低三个浓度平行3份的添加回收率范围为67.7-118.8%。

（4）精密度：33种真菌毒素在小麦基质中的日内精密度范围为0.2-20.0%，日间精密度范围为3.2-19.1%；33种真菌毒素在玉米基质中的日内精密度范围为1.8-18.5%，日间精密度范围为3.3-18.5%；33种真菌毒素在香菇基质中的日内精密度范围为0.8-19.5%，日间精密度范围为1.1-17.1%。

不同样品中各真菌毒素的检测结果见表2。

表2不同样品中真菌毒素检测结果（μg kg^-1）

Names	玉米-1	玉米-2	小麦-1	小麦-2	香菇-1	香菇-2
							AFB1	-a	-	-	-	-	-
AFB2	-	-	-	-	-	-
							AFG1	-	-	-	-	-	-
AFG2	-	-	-	-	-	-
							AFM1	-	-	-	-	-	-
AFM2	-	-	-	-	-	-
							SMC	-	-	-	-	-	-
NEO	33.2	212.7	60.9	-	-	-
							OTA	-	-	-	-	-	-
DAS	-	1101.9	1274.3	-	-	-
							T-2	74.0	8.1	139.8	-	-	-
HT2	13.1	-	24.8	-	-	-
							MPA	-	-	-	-	8.7	34.8
FB1	2731.0	828.3	65.8	289.7	-	-
							FB2	470.2	480.1	9.7	152.6	-	71.5
VER		-	-	-	-	-
							DON	27.4	-	-	-	8.2	-
Fus X	1259.9	1838.4	136.5	-	-	-
							Deep-DON	-	-	-	-	-	-
15-DON	-	-	-	-	-	-
							3-ADON	-	-	-	-	-	-
CPA	-	-	-	-	-	-
							ZEN	203.8	-	-	-	-	-
ZAN	-	-	-	-	-	-
							α-ZOL	-	-	-	-	-	-
α-ZAL	-	-	-	-	-	-
							β-ZOL	-	-	-	-	-	-
β-ZAL	-	-	-	-	-	-
							Fusaric acid	-	-	-	-	-	-

Glitoxin	-	-	-	-	-	-
							CIT	-	-	-	-	-	-
PAT	-	-	-	-	-	-
							NIV	2039.3	979.1	2130.8	-	-	-
总量	6818.7	5448.6	3842.6	442.3	16.9	106.3

^a低于检出限。

同时，为了验证方法的精密度及准确性，分别采用国标GB/T5009.23-2006（测定黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2）、GB/T23501-2009（测定T-2）毒素，GB/T23502-2009（测定赭曲霉毒素）、GB/T23503-2009（测定DON）以及GB/T23504-2009（测定ZEN）测定相关的真菌毒素，结果可以看出，通过本方法所得到的真菌毒素的含量与国标法得到的含量基本一致，偏差≤20%，证明本方法准确可靠。并且本方法一次性可以对33种真菌毒素准确定量，而国标及现有的分析方法需分别对每一大类真菌毒素进行分析，极大的节省了成本及分析时间。

本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本发明方案中心的修改都属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种同时检测多种真菌毒素的方法，其特征在于该方法为：先对样品进行提取净化；净化液经液相色谱串联质谱技术检测，最后通过同位素内标稀释法准确测定样品中多种真菌毒素。

2.根据权利要求1所述的同时检测多种真菌毒素的方法，其特征在于该方法为：

①对样品进行提取净化：

将样品粉末中加入样品含量的0.0001%-0.1%的同位素内标混合液；

然后加入样品量的2-5倍的水，浸泡5-10min后，超声30-90min；

然后加入样品量的2-5倍量的含0.1%-2%甲酸的乙腈溶液，涡旋混匀后，超声30-90min；

再加入样品重量的0.5-2倍重量的无水硫酸镁和0.1-1倍重量的氯化钠，加入后剧烈震摇10-60s，超声5-15min，在5000-15000r/min转速下离心5-15min；

然后取离心上清液于30-50℃下氮气吹干；

吹干后残渣用乙腈/醋酸铵水溶液溶解，过0.22μm的滤膜后，过滤液待进样分析；其中所用的同位素内标混合液为¹³C-AFB1、¹³C-OTA、¹³C-T2、¹³C-ZEN和¹³C-DON的混合液；

②液相色谱质谱串联分析：

其中液相分离的条件为：色谱柱为Agilent Poroshell120EC-C18柱（100mm×3mm,2.7μm）或与其性质类似的反相色谱柱，采用线性梯度洗脱，流动相为醋酸铵水溶液或甲醇/乙腈溶液；

③同位素内标法定量：

采用同位素内标稀释法建立各种真菌毒素标准曲线，采用内标法定量算出测定液待测组分的浓度，计算真菌毒素含量。