CN113607845A - 15种真菌毒素的液质检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开15种真菌毒素的液质检测方法，包括如下步骤：步骤A：样品的处理：将样品用提取液浸提后，过滤得到待测液；步骤B：同位素混合内标溶液的配制：分别用15种真菌毒素的同位素内标品配置同位素混合内标溶液；步骤C：混合标准品溶液的配制：分别用所述15种真菌毒素的标准品配置混合标准品溶液；步骤D：分别向待测液和混合标准品溶液中加入等体积的同位素混合内标溶液；步骤E：采用LC‑MS/MS法分别对步骤D中加入了同位素混合内标溶液的待测液和混合标准品溶液进行检测，计算得到样品中15种真菌毒素的含量。本发明的检测方法快速、灵敏、准确且高效，适用于多种基质样品的15种真菌毒素的检测，大大降低了检测人员的工作量。

Description

15种真菌毒素的液质检测方法
技术领域
本发明涉及真菌毒素检测技术领域。具体地说是15种真菌毒素的液质检测方法。
背景技术
真菌毒素是真菌在农作物、食品、饲料等生产及储存过程中产生的代谢产物，是一类小分子生物毒素。真菌毒素种类繁多，对人类和动物产生的毒副作用及机理也不相同。目前，已知的会通过食品对人类产生毒害作用的真菌毒素主要有黄曲霉毒素、伏马毒素、T2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、环匹阿尼酸、桔霉素、呕吐毒素、展青霉素、串珠镰刀菌毒素和玉米赤霉烯酮等。这些真菌毒素中有些会对人类产生致癌作用、肝毒性、肾毒性、神经毒性以及诱导突变等有害作用，严重威胁着人类的健康。真菌毒素会通过被真菌污染的食物进入人体而对人体产生危害，也可能以其它方式进入食物链。因此，快速检测和控制日常食品中各类真菌毒素的含量对维护人体健康至关重要。
目前，针对上述几类真菌毒素，已有很多用于检测其含量的方法。但由于食物种类多样、且性质不同，在进行检测前，需要通过一定的处理手段将食品中的真菌毒素分离并富集出来，这种前处理过程较为繁琐，针对不同食品需要采用不同的处理手段。如果样品处理的方式不合适，可能会使检测结果产生较大的偏差。另外，现在大多数检测方法针只针对某一类毒素，或者针对某一类食品进行检测，若同时检测多种真菌毒素或检测不同食品中的多种真菌毒素，则操作过程复杂、检测效率低，无法满足不同食品中多种真菌毒素的同时快速检测的需求。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种15种真菌毒素的液质检测方法，可以同时适用大米、面粉、玉米、豆制品、糕点、食用油、肉制品和水果等常见食品中15种真菌毒素的同时检测，以解决现有技术中，对不同食品中多种真菌毒素进行检测时，工作量大、检测效率低等问题。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
15种真菌毒素的液质检测方法，包括如下步骤：
步骤A：样品的处理：将样品用提取液浸提后，过滤得到待测液；
步骤B：同位素混合内标溶液的配制：用15种真菌毒素的同位素内标品配置同位素混合内标溶液；
步骤C：混合标准品溶液的配制：分别用所述15种真菌毒素的标准品配置混合标准品溶液；
步骤D：分别向待测液和混合标准品溶液中加入等体积的同位素混合内标溶液；
步骤E：采用LC-MS/MS法分别对步骤D中加入了同位素混合内标溶液的待测液和混合标准品溶液进行检测，计算得到样品中15种真菌毒素的含量；
所述15种真菌毒素分别为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马毒素B1、伏马毒素B2、T2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、环匹阿尼酸、桔霉素、呕吐毒素、展青霉素、串珠镰刀菌毒素和玉米赤霉烯酮。本发明的检测方法快速、灵敏、准确且高效，适用于大米、面粉、玉米、豆制品、糕点、食用油、肉制品和水果等多种基质样品中的15种真菌毒素的检测，大大降低了检测人员的工作量。
上述15种真菌毒素的液质检测方法，在步骤A中，样品处理的具体方法为：将粒径小于或等于1mm的样品置于三角烧瓶中，加入乙腈-水-甲酸的混合溶液A作为提取液，并用封口膜封住瓶口，以200rpm振荡提取2h，用定性滤纸过滤后得到样品的待测液。
上述15种真菌毒素的液质检测方法，所述样品与所述混合溶液A的固液比为250g/L；所述混合溶液A中，乙腈、水与甲酸的体积之比为79:20:1。该处理样品的方法和处理条件适用于大部分食品检测样品的真菌毒素的检验，处理效果好，对检测结果产生的影响较小。
上述15种真菌毒素的液质检测方法，在步骤B中，所述同位素混合内标溶液包括同位素混合内标溶液A和同位素混合内标溶液B两种；
所述同位素混合内标溶液A的配制的方法为：在20mL西林瓶中加入5mL含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液/乙腈溶液，然后分别加入相应体积的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马毒素B1、伏马毒素B2、T2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、环匹阿尼酸和桔霉素11种真菌毒素的同位素内标品，混匀后得到同位素混合内标溶液A；
所述同位素混合内标溶液B的配制的方法为：在20mL西林瓶中加入5mL含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液，然后分别加入相应体积的呕吐毒素、展青霉素和玉米赤霉烯酮3种真菌毒素的同位素内标品，混匀后得到同位素混合内标溶液B；
所述含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液/乙腈溶液中：含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液与乙腈的体积之比为9:1，含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液配制方法如下：每1000mL水中，加入醋酸铵2mmol，加入醋酸5mL；
所述同位素混合内标溶液A中：13C17黄曲霉毒素B1、13C17黄曲霉毒素B2、13C17黄曲霉毒素G1和13C17黄曲霉毒素G2的浓度均为3.0ppb，13C34伏马毒素B1和13C34伏马毒素B2的浓度均为200ppb，13C24T2毒素的浓度为250ppb，13C22HT-2毒素的浓度为250ppb，13C20赭曲霉毒素A的浓度为10ppb，13C20环匹阿尼酸的浓度为100ppb，13C13桔霉素的浓度为100ppb；
所述同位素混合内标溶液B中：13C15呕吐毒素的浓度为125ppb，13C7展青霉素的浓度为125ppb，13C18玉米赤霉烯酮的浓度为25ppb。同位素内标主要用来校正基质的离子抑制或增强效应；由于同位素内标与目标真菌毒素具有相同的结构和化学性质，其色谱以及色谱行为相同，向待测液中加入同位素内标可以有效补偿进样体积、电喷雾电离源的离子化效率、离子传输导致的目标真菌毒素响应的波动，从而保证质谱分析结果的准确性和稳定性。
上述15种真菌毒素的液质检测方法，在步骤D中：向1mL的待测液中加入等体积的乙腈水溶液，再加入50μL乙酸，并涡旋混匀得到稀释待测液；从稀释待测液中分别移取75μL至两个1.7mL的离心管中，向两个1.7mL的离心管中分别加入75μL同位素混合内标溶液A和同位素混合内标溶液B，并涡旋20s，然后以10000r/min离心3min，分别移取上清液120μL到带有250μL内插管的2mL HPLC西林瓶中待测；所述乙腈水溶液中乙腈的体积分数为50％。
上述15种真菌毒素的液质检测方法，在步骤C中，所述混合标准品溶液包括混合标准品溶液A和混合标准品溶液B；
所述混合标准品溶液A配制的具体方法为：
步骤1-1：以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马毒素B1、伏马毒素B2、T2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、环匹阿尼酸和桔霉素11种真菌毒素的标准品配置二级储备液A，所用溶剂为含5％醋酸的乙腈水溶液；所述二级储备液A中，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2的浓度均为25ppb，伏马毒素B1和伏马毒素B2的浓度均为2500ppb，T2毒素的浓度为2000ppb，HT-2毒素的浓度为2000ppb，赭曲霉毒素A的浓度为50ppb，环匹阿尼酸的浓度为500ppb，桔霉素的浓度为500ppb；
步骤1-2：从所述二级储备液A中移取200μL转移至2mL西林瓶中，用200μL含5％醋酸的乙腈水溶液稀释并混匀，得到Level 6混合标准溶液A；
步骤1-3：从Level 6混合标准溶液A中移取200μL转移至2mL西林瓶中，用200μL含5％醋酸的乙腈水溶液稀释并混匀，得到Level 5混合标准溶液A；
步骤1-4：对Level 5混合标准溶液A采用步骤1-3的方法稀释得到Level 4混合标准溶液A，并依次对Level 4混合标准溶液A采用步骤1-3的方法稀释得到Level 3混合标准溶液A、对Level 3混合标准溶液A采用步骤1-3的方法稀释得到Level 2混合标准溶液A以及对Level 2混合标准溶液A采用步骤1-3的方法稀释得到Level 1混合标准溶液A；
所述混合标准品溶液B配制的具体方法为：
步骤2-1：以呕吐毒素、展青霉素、串珠镰刀菌毒素和玉米赤霉烯酮4种真菌毒素的标准品配置二级储备液B，所用溶剂为含5％醋酸的乙腈水溶液；所述二级储备液B中，呕吐毒素、展青霉素、串珠镰刀菌毒素和玉米赤霉烯酮的浓度均为2000ppb；
步骤2-2：从所述二级储备液B中移取200μL转移至2mL西林瓶中，用200μL含5％醋酸的乙腈水溶液稀释并混匀，得到Level 6混合标准溶液B；
步骤2-3：从Level 6混合标准溶液B中移取200μL转移至2mL西林瓶中，用200μL含5％醋酸的乙腈水溶液稀释并混匀，得到Level 5混合标准溶液B；
步骤2-4：对Level 5混合标准溶液B采用步骤2-3的方法稀释得到Level 4混合标准溶液B，并依次对Level 4混合标准溶液B采用步骤2-3的方法稀释得到Level 3混合标准溶液B、对Level 3混合标准溶液B采用步骤2-3的方法稀释得到Level 2混合标准溶液B以及对Level 2混合标准溶液B采用步骤2-3的方法稀释得到Level 1混合标准溶液B；
所述含5％醋酸的乙腈水溶液配制方法如下：乙腈和水按照体积比1:1配制成乙腈水溶液，然后每100mL乙腈水溶液中加入5mL醋酸，即得含5％醋酸的乙腈水溶液；所述含5％醋酸的乙腈水溶液的pH为4。
上述15种真菌毒素的液质检测方法，在步骤D中：分别吸取Level 1～Level 6混合标准溶液A到不同的带有250μL内插管的2mL HPLC西林瓶中，并分别加入等体积的同位素混合内标溶液A，涡旋混匀，备用；分别吸取Level 1～Level 6混合标准溶液B到不同的带有250μL内插管的2mL HPLC西林瓶中，并分别加入等体积的同位素混合内标溶液B，涡旋混匀后，备用。
上述15种真菌毒素的液质检测方法，在步骤E中，色谱条件：HPLC为安捷伦1290HPLC；色谱柱及保护柱分别为4.6x150mm，3μm的Waters
Figure BDA0003193920700000061
T3色谱柱和4x3.0mm的GeminiC18柱；
流动相A为含0.5％醋酸的2mM醋酸铵水溶液，含0.5％醋酸的2mM醋酸铵水溶液配制方法如下：每1000mL水中，加入醋酸铵2mmol，加入醋酸5mL；流动相B为含0.5％醋酸的2mM醋酸铵甲醇溶液，含0.5％醋酸的2mM醋酸铵甲醇溶液配制方法如下：每997.5mL甲醇中，加入醋酸铵2mmol，加入醋酸5mL，加入水2.5mL；流速为1.0mL/min，进样量为10μL，吸样速度为200.0μL/min，注射速度为200.0μL/min，柱温为40℃，样品盘温度控制为10℃；
洗脱模式为：0-1min，10％B；1-14min，10％-97％B；14-15min，97％B；15-15.1min，97％-10％B；15.1-20min，10％B。
上述15种真菌毒素的液质检测方法，在步骤E中，质谱条件：离子源温度：正离子模式650℃，负离子模式600℃；气帘气CUR：35psi；碰撞气：Medium；离子源电压：正离子模式5500V，负离子模式-4500V；喷雾气：60psi；辅助加热气：65psi。
上述15种真菌毒素的液质检测方法，在步骤E中，色谱条件：HPLC为安捷伦1290HPLC；色谱柱及保护柱分别为4.6x150mm，3μm的Waters
Figure BDA0003193920700000062
T3色谱柱和4x3.0mm的GeminiC18柱；
流动相A为含0.5％醋酸的2mM醋酸铵水溶液，含0.5％醋酸的2mM醋酸铵水溶液配制方法如下：每1000mL水中，加入醋酸铵2mmol，加入醋酸5mL；流动相B为含0.5％醋酸的2mM醋酸铵甲醇溶液，含0.5％醋酸的2mM醋酸铵甲醇溶液配制方法如下：每997.5mL甲醇中，加入醋酸铵2mmol，加入醋酸5mL，加入水2.5mL；流速为1.0mL/min，进样量为10μL，吸样速度为200.0μL/min，注射速度为200.0μL/min，柱温为40℃，样品盘温度控制为10℃；
洗脱模式为：0-1min，10％B；1-14min，10％-97％B；14-15min，97％B；15-15.1min，97％-10％B；15.1-20min，10％B；
质谱条件：离子源温度：正离子模式650℃，负离子模式600℃；气帘气CUR：35psi；碰撞气：Medium；离子源电压：正离子模式5500V，负离子模式-4500V；喷雾气：60psi；辅助加热气：65psi。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
(1)本发明的检测方法快速、灵敏、准确且高效，适用于大米、面粉、玉米、豆制品、糕点、食用油、肉制品和水果等多种基质样品中的15种真菌毒素的检测，大大降低了检测人员的工作量。
(2)本发明的样品处理方法和处理条件适用于大部分食品检测样品的真菌毒素的检验，处理效果好，对检测结果产生的影响较小。本发明中，同位素内标主要用来校正基质的离子抑制或增强效应；由于同位素内标与目标真菌毒素具有相同的结构和化学性质，其色谱以及色谱行为相同，向待测液中加入同位素内标可以有效补偿进样体积、电喷雾电离源的离子化效率、离子传输导致的目标真菌毒素响应的波动，从而保证质谱分析结果的准确性和稳定性。
具体实施方式
1.仪器设备
(1)2mL HPLC进样小瓶，蓝色PTFE盖子；
(2)旋风搅拌器、pH计；
(3)移液器：艾本德1-5mL、艾本德200-1000μL、艾本德20-200μL、艾本德2-20μL；
(4)4&20ml棕色带盖西林瓶；
(5)Waters
Figure BDA0003193920700000071
T3色谱柱，规格：4.6x150mm，3μm；
(6)飞诺美保护柱芯，Gemini C18 4x3.0mm。
2.试剂
2.1真菌毒素的标准品
黄曲霉毒素(Afla)混标：0.5μg/mL黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2；
伏马毒素(F)混标：50μg/mL伏马毒素B1，B2；
T2毒素：100μg/mL；
HT-2毒素：100μg/mL；
赭曲霉毒素A(OTA)：10μg/mL；
环匹阿尼酸(CPA)：100μg/mL；
桔霉素(CIT)：100μg/mL；
呕吐毒素(DON)：100μg/mL；
展青霉素(PAT)：100μg/mL；
串珠镰刀菌素(MON)：100μg/mL；
玉米赤霉烯酮(ZEN)：100μg/mL。
2.2真菌毒素的同位素内标品
混标Mix11(13C黄曲霉毒素内标)：U-[13C17]-黄曲霉毒素B1，U-[13C17]-黄曲霉毒素B2，U-[13C17]-黄曲霉毒素G1，U-[13C17]-黄曲霉毒素G2；0.5μg/mL；
混标Mix12(13C伏马毒素B1，B2内标)：U-[13C34]-伏马毒素B1内标，U-[13C34]-伏马毒素B2内标；5μg/mL；
U-[13C20]-环匹阿尼酸内标：10μg/mL；
U-[13C13]-桔霉素内标：10μg/mL；
U-[13C15]-呕吐毒素内标：25μg/mL；
U-[13C18]-玉米赤霉烯酮内标：25μg/mL；
U-[13C20]-赭曲霉毒素A内标：10μg/mL；
U-[13C22]-HT-2毒素内标：25μg/mL；
U-[13C24]-T2毒素内标：25μg/mL；
U-[13C7]-展青霉素内标：25μg/mL；
2.3其它试剂
乙腈(HPLC级)、超纯水、甲醇(HPLC级)、冰醋酸(HPLC级)、乙酸铵(LCMS级)、氨水；
流动相A(MPA)：含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液(pH＝4)，即由4000mL超纯水、20mL醋酸(HPLC级)和0.6166g乙酸铵混合而成；
流动相B(MPB)：含0.5％醋酸的2mM醋酸铵甲醇溶液，即由3990mL甲醇、20mL醋酸(HPLC级)、0.6166g乙酸铵和10mL超纯水混合而成。
3.样品的处理
本实施例以大米和面粉为例，对大米和面粉中15种真菌毒素进行检测。大米样品的前处理：将大米样品置于粉碎机中粉碎，并过1mm孔径试验筛；准确称取25g(精确到0.01g)大米样品于250mL三角烧瓶中，加入100mL乙腈-水-甲酸的混合溶液(79:20:1，体积比)作为提取液，用封口膜封住瓶口，以200rpm振荡提取2h，用定性滤纸过滤，收集滤液于50mL离心管中备用；
面粉样品的前处理：准确称取25g(精确到0.01g)面粉样品于250mL三角烧瓶中，加入100mL乙腈-水-甲酸的混合溶液(79:20:1，体积比)，用封口膜封住瓶口，以200rpm振荡提取2h，用定性滤纸过滤，收集滤液于50mL离心管中备用。
本实施例采用正负两种离子模式同时扫描，其中正离子模式的真菌毒素有：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马毒素B1、伏马毒素B2、T2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、环匹阿尼酸和桔霉素；负离子模式的真菌毒素有：呕吐毒素、展青霉素、串珠镰刀菌毒素和玉米赤霉烯酮。
4.同位素混合内标溶液的配制
4.1正离子模式同位素混合内标溶液A的配制
在20mL西林瓶中加入5mL 90/10v/v含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液/乙腈溶液，然后按表1加入相应体积的真菌毒素的同位素内标品，混匀备用。在含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液/乙腈溶液中：含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液(MPA)与所述乙腈的体积之比为9:1。同位素混合内标溶液A需要在-20℃冷冻保存，有效期为一个月。
表1
Figure BDA0003193920700000101
4.2负离子模式同位素混合内标溶液B的配制
在20mL西林瓶中加入5mL含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液(即MPA)，然后按表2加入相应体积的真菌毒素的同位素内标品，混匀备用。同位素混合内标溶液B需要在-20℃冷冻保存，有效期为一个月。
表2
负离子内标 浓度，μg/mL 加入体积，uL 计算浓度值，ppb
<sup>13</sup>C<sub>15</sub>呕吐毒素 25 25 125
<sup>13</sup>C<sub>7</sub>展青霉素 25 25 125
<sup>13</sup>C<sub>18</sub>玉米赤霉烯酮 25 5 25
5.混合标准品溶液的配制
5.1正离子模式混合标准品溶液A的配制
(1)按照表3配置11种正离子模式真菌毒素的混标。具体方法为：按照表3移取相应体积真菌毒素的标准品到4mL棕色西林瓶中，加入795μL含5％醋酸的乙腈水溶液(pH＝4)，盖上盖子涡旋30秒混匀，得到11种真菌毒素的二级储备液A，各浓度见表3。含5％醋酸的乙腈水溶液(pH＝4)的制备方法如下：乙腈和水按照体积比1:1配制成乙腈水溶液，然后每100mL乙腈水溶液中加入5mL醋酸，即得含5％醋酸的乙腈水溶液；所述含5％醋酸的乙腈水溶液的pH为4。配制的多毒素二级储备液A需要在-20℃冷冻保存，有效期为2周。
表3
Figure BDA0003193920700000111
注：*多毒素混标
(2)按照表4的方法将二级储备液A依次稀释成Level 1-6。具体方法为：移取200μL各级混合标准品溶液到2mL HPLC西林瓶中，用200μL含5％醋酸的乙腈水溶液(pH＝4)稀释混匀，得到各级混合标准溶液A。
表4
Figure BDA0003193920700000121
5.2负离子模式混合标准品溶液B的配制
(1)按照表5配置4种负离子模式真菌毒素的混标。具体方法为：按照表5移取相应体积真菌毒素的标准品到4mL棕色西林瓶中，加入920μL含5％醋酸的乙腈水溶液(pH＝4)，盖上盖子涡旋30秒混匀，得到4种真菌毒素的二级储备液B，各浓度见表6。配制的多毒素二级储备液B需要在-20℃冷冻保存，有效期为2周。
表5
Figure BDA0003193920700000122
(2)按照表6的方法将二级储备液B依次稀释成Level 1-6。具体方法为：移取200μL各级混合标准品溶液到2mL HPLC西林瓶中，用200μL含5％醋酸的乙腈水溶液(pH＝4)稀释混匀，得到各级混合标准溶液B。
表6
Figure BDA0003193920700000123
6.分别向待测液和混合标准品溶液中加入等体积同位素混合内标溶液
6.1待测液中加入等体积的同位素混合内标溶液
取1mL的大米样品待测液中加入等体积的乙腈水溶液，再加入50μL乙酸，并涡旋混匀得到稀释待测液；从稀释待测液中分别移取75μL至两个1.7mL的离心管中，向两个1.7mL的离心管中分别加入75μL正离子模式同位素混合内标溶液A和负离子模式同位素混合内标溶液B，并涡旋20s，然后以10000r/min离心3min，分别移取上清液120μL到带有250μL内插管的2mL HPLC西林瓶中，得到大米样品的正离子模式待测液A和负离子模式待测液B；所述乙腈水溶液中乙腈的体积分数为50％。
采用上述方法处理面粉样品的待测液，得到面粉样品的正离子模式待测液A和负离子模式待测液B。
6.2混合标准品溶液中加入等体积同位素混合内标溶液
分别吸取Level 1～Level 6混合标准溶液A75μL到带有250μL内插管的2mL HPLC西林瓶中，并分别加入等体积的同位素混合内标溶液A，涡旋混匀，得到的各级校准溶液A，各级校准溶液A中真菌毒素的浓度见表7；
表7
浓度等级 Level 1 Level 2 Level 3 Level 4 Level 5 Level 6
真菌毒素浓度 ppb ppb ppb ppb ppb ppb
黄曲霉毒素B1 0.196 0.391 0.781 1.563 3.125 6.25
黄曲霉毒素B2 0.196 0.391 0.781 1.563 3.125 6.25
黄曲霉毒素G1 0.196 0.391 0.781 1.563 3.125 6.25
黄曲霉毒素G2 0.196 0.391 0.781 1.563 3.125 6.25
伏马毒素B1 19.531 39.063 78.125 156.25 312.5 625
伏马毒素B2 19.531 39.063 78.125 156.25 312.5 625
T2毒素 15.625 31.25 62.5 125 250 500
HT-2毒素 15.625 31.25 62.5 125 250 500
赭曲霉毒素A 0.391 0.781 1.563 3.125 6.25 12.5
环匹阿尼酸 3.906 7.813 15.625 31.25 62.5 125
桔霉素 3.906 7.813 15.625 31.25 62.5 125
分别吸取Level 1～Level 6混合标准溶液B75μL到带有250μL内插管的2mL HPLC西林瓶中，并分别加入等体积的同位素混合内标溶液B，涡旋混匀后，得到的各级校准溶液B，各级校准溶液B中真菌毒素的浓度见表8。
表8
浓度等级 Level 1 Level 2 Level 3 Level 4 Level 5 Level 6
真菌毒素浓度 ppb ppb ppb ppb ppb ppb
呕吐毒素 15.625 31.25 62.5 125 250 500
展青霉素 15.625 31.25 62.5 125 250 500
串珠镰刀菌毒素 15.625 31.25 62.5 125 250 500
玉米赤霉烯酮 15.625 31.25 62.5 125 250 500
上述稀释配置的混合标准品需要在2-8℃保存，有效期为7天。
表9为混合标准品中15种真菌毒素浓度的最高点和最低点。当样品浓度超过此浓度范围时，需要将样品进行稀释后再进行检测分析。
表9
Figure BDA0003193920700000141
7.采用LC-MS/MS法进行测定
7.1标准校准曲线的测定和样品的测定
利用LC-MS/MS法分别测定“6.2”中正离子模式下各级校准溶液A和负离子模式下各级校准溶液B，得到正离子模式的标准校准曲线和负离子模式的标准校准曲线。然后测定“6.1”中的大米样品的正离子模式待测液A和负离子模式待测液B以及面粉样品的正离子模式待测液A和负离子模式待测液B。
7.2测试条件
(1)色谱条件：HPLC为安捷伦1290HPLC；
色谱柱及保护柱分别为4.6x150mm，3μm的Waters
Figure BDA0003193920700000151
T3色谱柱和飞诺美4x3.0mm的Gemini C18柱保护柱芯；
流动相A为含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液，流动相B为含0.5％醋酸的2mM醋酸铵甲醇溶液；
进样针高度：0.0mm，进样量：10μL，吸样速度：200.0μL/min，注射速度：200.0μL/min；
柱温为40℃，样品盘温度控制为10℃；
洗针信息：需要洗针；洗针位置：在线冲洗；冲洗时间：30秒；
流速：1.0mL/min；
洗脱模式为：0-1min，10％B；1-14min，10％-97％B；14-15min，97％B；15-15.1min，97％-10％B；15.1-20min，10％B；具体见下表：
Minute(min) 0 1 14 15 15.1 16 20
流动相B(V％) 10 10 97 97 10 10 10
(2)质谱条件：
仪器：AB Sciex Triple Quad 5500；
离子源温度：正离子模式：650℃；负离子模式：600℃；
气帘气：35.0psi；碰撞气：Medium；
离子化电压：正离子模式：5000.0V；负离子模式：-4500.0V；
喷雾气：60.0psi；
辅助加热气：65.0psi。
(3)三重四级杆串联质谱仪参数(负离子模式)，见表10。
表10
Figure BDA0003193920700000161
(4)三重四级杆串联质谱仪参数(正离子模式)，见表11。
表11
Figure BDA0003193920700000162
Figure BDA0003193920700000171
注：-P表示该离子优先用来定量。
-S表示该二级离子主要用来定性。
IS内标只考虑一级离子。内标主要用来校正基质的离子抑制或增强效应，不参与定量，故不需要二级离子。
8.检测结果
表12为大米和面粉中15种真菌毒素的检测结果。
表12
Figure BDA0003193920700000172
在本实施例中，15种真菌毒素在0.196～625ng/L范围内线性关系良好,相关系数为0.9974～1.0000；除串珠镰刀菌素(没有内标校正)外，所有毒素的回收率以及在低浓度和高浓度两个添加水平的回收率均在72.09％～131.28％范围之间,相对标准偏RSD在1.17％-18.20％(n＝6),定量限为1～90μg/kg。
说明该方法灵敏、准确、快速且高效，可以适用于多种不同基质样品，每种样品仅需40min既可以同时检测出15种真菌毒素，大大降低了检测人员的工作量。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。

Claims (10)

1.15种真菌毒素的液质检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：样品的处理：将样品用提取液浸提后，过滤得到待测液；
步骤B：同位素混合内标溶液的配制：用15种真菌毒素的同位素内标品配置同位素混合内标溶液；
步骤C：混合标准品溶液的配制：分别用所述15种真菌毒素的标准品配置混合标准品溶液；
步骤D：分别向待测液和混合标准品溶液中加入等体积的同位素混合内标溶液；
步骤E：采用LC-MS/MS法分别对步骤D中加入了同位素混合内标溶液的待测液和混合标准品溶液进行检测，计算得到样品中15种真菌毒素的含量；
所述15种真菌毒素分别为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马毒素B1、伏马毒素B2、T2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、环匹阿尼酸、桔霉素、呕吐毒素、展青霉素、串珠镰刀菌毒素和玉米赤霉烯酮。
2.根据权利要求1所述的15种真菌毒素的液质检测方法，其特征在于，在步骤A中，样品处理的具体方法为：将粒径小于或等于1mm的样品置于三角烧瓶中，加入乙腈-水-甲酸的混合溶液A作为提取液，并用封口膜封住瓶口，以200rpm振荡提取2h，用定性滤纸过滤后得到样品的待测液。
3.根据权利要求2所述的15种真菌毒素的液质检测方法，其特征在于，所述样品与所述混合溶液A的固液比为250g/L；所述混合溶液A中，乙腈、水与甲酸的体积之比为79:20:1。
4.根据权利要求1所述的15种真菌毒素的液质检测方法，其特征在于，在步骤B中，所述同位素混合内标溶液包括同位素混合内标溶液A和同位素混合内标溶液B两种；
所述同位素混合内标溶液A的配制的方法为：在20mL西林瓶中加入5mL含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液/乙腈溶液，然后分别加入相应体积的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马毒素B1、伏马毒素B2、T2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、环匹阿尼酸和桔霉素11种真菌毒素的同位素内标品，混匀后得到同位素混合内标溶液A；
所述同位素混合内标溶液B的配制的方法为：在20mL西林瓶中加入5mL含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液，然后分别加入相应体积的呕吐毒素、展青霉素和玉米赤霉烯酮3种真菌毒素的同位素内标品，混匀后得到同位素混合内标溶液B；
所述含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液/乙腈溶液中：含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液与乙腈的体积之比为9:1；所述含0.5％醋酸的2mM醋酸铵溶液配制方法如下：每1000mL水中，加入醋酸铵2mmol，加入醋酸5mL；
所述同位素混合内标溶液A中：13C17黄曲霉毒素B1、13C17黄曲霉毒素B2、13C17黄曲霉毒素G1和13C17黄曲霉毒素G2的浓度均为3.0ppb，13C34伏马毒素B1和13C34伏马毒素B2的浓度均为200ppb，13C24T2毒素的浓度为250ppb，13C22HT-2毒素的浓度为250ppb，13C20赭曲霉毒素A的浓度为10ppb，13C20环匹阿尼酸的浓度为100ppb，13C13桔霉素的浓度为100ppb；
所述同位素混合内标溶液B中：13C15呕吐毒素的浓度为125ppb，13C7展青霉素的浓度为125ppb，13C18玉米赤霉烯酮的浓度为25ppb。
5.根据权利要求4所述的15种真菌毒素的液质检测方法，其特征在于，在步骤D中：向1mL的待测液中加入等体积的乙腈水溶液，再加入50μL乙酸，并涡旋混匀得到稀释待测液；从稀释待测液中分别移取75μL至两个1.7mL的离心管中，向两个1.7mL的离心管中分别加入75μL同位素混合内标溶液A和同位素混合内标溶液B，并涡旋20s，然后以10000r/min离心3min，分别移取上清液120μL到带有250μL内插管的2mL HPLC西林瓶中待测；所述乙腈水溶液中乙腈的体积分数为50％。
6.根据权利要求1所述的15种真菌毒素的液质检测方法，其特征在于，在步骤C中，所述混合标准品溶液包括混合标准品溶液A和混合标准品溶液B；
所述混合标准品溶液A配制的具体方法为：
步骤1-1：以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马毒素B1、伏马毒素B2、T2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、环匹阿尼酸和桔霉素11种真菌毒素的标准品配置二级储备液A，所用溶剂为含5％醋酸的乙腈水溶液；所述二级储备液A中，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2的浓度均为25ppb，伏马毒素B1和伏马毒素B2的浓度均为2500ppb，T2毒素的浓度为2000ppb，HT-2毒素的浓度为2000ppb，赭曲霉毒素A的浓度为50ppb，环匹阿尼酸的浓度为500ppb，桔霉素的浓度为500ppb；
步骤1-2：从所述二级储备液A中移取200μL转移至2mL西林瓶中，用200μL含5％醋酸的乙腈水溶液稀释并混匀，得到Level 6混合标准溶液A；
步骤1-3：从Level 6混合标准溶液A中移取200μL转移至2mL西林瓶中，用200μL含5％醋酸的乙腈水溶液稀释并混匀，得到Level 5混合标准溶液A；
步骤1-4：对Level 5混合标准溶液A采用步骤1-3的方法稀释得到Level 4混合标准溶液A，并依次对Level 4混合标准溶液A采用步骤1-3的方法稀释得到Level 3混合标准溶液A、对Level 3混合标准溶液A采用步骤1-3的方法稀释得到Level 2混合标准溶液A以及对Level 2混合标准溶液A采用步骤1-3的方法稀释得到Level 1混合标准溶液A；
所述混合标准品溶液B配制的具体方法为：
步骤2-1：以呕吐毒素、展青霉素、串珠镰刀菌毒素和玉米赤霉烯酮4种真菌毒素的标准品配置二级储备液B，所用溶剂为含5％醋酸的乙腈水溶液；所述二级储备液B中，呕吐毒素、展青霉素、串珠镰刀菌毒素和玉米赤霉烯酮的浓度均为2000ppb；
步骤2-2：从所述二级储备液B中移取200μL转移至2mL西林瓶中，用200μL含5％醋酸的乙腈水溶液稀释并混匀，得到Level 6混合标准溶液B；
步骤2-3：从Level 6混合标准溶液B中移取200μL转移至2mL西林瓶中，用200μL含5％醋酸的乙腈水溶液稀释并混匀，得到Level 5混合标准溶液B；
步骤2-4：对Level 5混合标准溶液B采用步骤2-3的方法稀释得到Level 4混合标准溶液B，并依次对Level 4混合标准溶液B采用步骤2-3的方法稀释得到Level 3混合标准溶液B、对Level 3混合标准溶液B采用步骤2-3的方法稀释得到Level 2混合标准溶液B以及对Level 2混合标准溶液B采用步骤2-3的方法稀释得到Level 1混合标准溶液B；
所述含5％醋酸的乙腈水溶液配制方法如下：乙腈和水按照体积比1:1配制成乙腈水溶液，然后每100mL乙腈水溶液中加入5mL醋酸，即得含5％醋酸的乙腈水溶液；所述含5％醋酸的乙腈水溶液的pH为4。
7.根据权利要求6所述的15种真菌毒素的液质检测方法，其特征在于，在步骤D中：分别吸取Level 1～Level 6混合标准溶液A到不同的带有250μL内插管的2mL HPLC西林瓶中，并分别加入等体积的同位素混合内标溶液A，涡旋混匀，备用；分别吸取Level 1～Level 6混合标准溶液B到不同的带有250μL内插管的2mL HPLC西林瓶中，并分别加入等体积的同位素混合内标溶液B，涡旋混匀后，备用。
8.根据权利要求1所述的15种真菌毒素的液质检测方法，其特征在于，在步骤E中，色谱条件：HPLC为安捷伦1290HPLC；色谱柱及保护柱分别为4.6x150mm，3μm的Waters
Figure FDA0003193920690000041
T3色谱柱和4x3.0mm的Gemini C18柱；
流动相A为含0.5％醋酸的2mM醋酸铵水溶液，含0.5％醋酸的2mM醋酸铵水溶液配制方法如下：每1000mL水中，加入醋酸铵2mmol，加入醋酸5mL；流动相B为含0.5％醋酸的2mM醋酸铵甲醇溶液，含0.5％醋酸的2mM醋酸铵甲醇溶液配制方法如下：每997.5mL甲醇中，加入醋酸铵2mmol，加入醋酸5mL，加入水2.5mL；流速为1.0mL/min，进样量为10μL，吸样速度为200.0μL/min，注射速度为200.0μL/min，柱温为40℃，样品盘温度控制为10℃；
洗脱模式为：0-1min，10％B；1-14min，10％-97％B；14-15min，97％B；15-15.1min，97％-10％B；15.1-20min，10％B。
9.根据权利要求1所述的15种真菌毒素的液质检测方法，其特征在于，在步骤E中，质谱条件：离子源温度：正离子模式650℃，负离子模式600℃；气帘气CUR：35psi；碰撞气：Medium；离子源电压：正离子模式5500V，负离子模式-4500V；喷雾气：60psi；辅助加热气：65psi。
10.根据权利要求1所述的15种真菌毒素的液质检测方法，其特征在于，在步骤E中，色谱条件：HPLC为安捷伦1290HPLC；色谱柱及保护柱分别为4.6x150mm，3μm的Waters
Figure FDA0003193920690000051
T3色谱柱和4x3.0mm的Gemini C18柱；
流动相A为含0.5％醋酸的2mM醋酸铵水溶液，含0.5％醋酸的2mM醋酸铵水溶液配制方法如下：每1000mL水中，加入醋酸铵2mmol，加入醋酸5mL；流动相B为含0.5％醋酸的2mM醋酸铵甲醇溶液，含0.5％醋酸的2mM醋酸铵甲醇溶液配制方法如下：每997.5mL甲醇中，加入醋酸铵2mmol，加入醋酸5mL，加入水2.5mL；流速为1.0mL/min，进样量为10μL，吸样速度为200.0μL/min，注射速度为200.0μL/min，柱温为40℃，样品盘温度控制为10℃；
洗脱模式为：0-1min，10％B；1-14min，10％-97％B；14-15min，97％B；15-15.1min，97％-10％B；15.1-20min，10％B；
质谱条件：离子源温度：正离子模式650℃，负离子模式600℃；气帘气CUR：35psi；碰撞气：Medium；离子源电压：正离子模式5500V，负离子模式-4500V；喷雾气：60psi；辅助加热气：65psi。
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