CN114324656A - 电子烟中18种真菌毒素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于烟油安全检测技术领域，尤其涉及电子烟中18种真菌毒素的检测方法。本发明提供的电子烟中18种真菌毒素的检测方法，总体需要的检测设备只有液相色谱质谱联用仪。简化了操作，一次性进行多种真菌毒素的筛查可以极大的降低检测成本，同时可以提高效率。此外，采用同位素内标方法可以有效的校正基质效应，提高检测结果的准确性和可靠性。本发明帮助国内电子烟企业进行了烟油的真菌毒素风险筛查，以获取FDA准入的门槛。
Description
技术领域
本发明属于烟油安全检测技术领域，尤其涉及电子烟中18种真菌毒素的检测方法。
背景技术
电子烟又名虚拟香烟、电子香烟，它有着与香烟一样的外观，与香烟近似的味道，甚至比一般香烟的口味要多很多，也像香烟一样能吸出烟、吸出味道跟感觉来。主要是用于戒烟和替代香烟。电子烟又是一种非燃烧的烟类替代型产品，他与普通香烟的某些特点相似，能够提神、满足吸烟者的快感和多年养成的使用习惯。为了能在最大程度上模拟传统卷烟的香气、香味和口感，目前电子烟烟油最常见的添加物为烟草提取物，通过提取获得的烟草提取物与丙二醇、丙三醇和烟用香精等按一定配比混合而成。
根据美国FDA在2016年颁布的法规将电子烟产品纳入烟草产品范围，并接受FDA监管，未通过PMTA认证的产品不准在美国上市，美国FDA要求所有在美国市场销售的电子烟产品需要进行成分清单提交申请，英文Premarket Tabacco Application，英文缩写PMTA。其中有害及潜在有害物质报告中需要对其潜在有害物质进行评估，而其中由于烟叶存在发霉变质的可能，而其烟油的霉菌毒素检测就成为非常关注的一环。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了电子烟中18种真菌毒素的检测方法，目的是为了解决电子烟使用发霉烟叶导致其烟油中真菌毒素超标时，的技术问题。
本发明提供的电子烟中18种真菌毒素的检测方法，具体技术方案如下：
电子烟中18种真菌毒素的检测方法，包括如下步骤：
S1，将烟油样品加入乙腈溶液中，放入超声提取装置进行超声提取，取下层清夜，即获得提取液；
S2，向步骤S1中的提取液中加入乙酸进行酸化处理，获得混合样品，所述混合样品中加入净化柱并进行涡旋处理，获得含样净化柱；
S3，对步骤S2中的含样净化柱进行离心处理，获得预处理液；
S4，向步骤S3中的预处理液中加入正离子内标和负离子内标，涡旋处理后进行离心处理，获得样品净化液；
S5，步骤S4中的样品净化液上样，采用HPLC-MS/MS对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马菌素B1、B2、B3、蛇形毒素、HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇(NEO)、T-2毒素、15-乙酰基呕吐毒素、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、3-乙酰基呕吐毒素、瓜萎镰刀菌素(FUX)、玉米赤霉烯酮进行定性定量分析。
在某些实施方式中，步骤S1中，所述乙腈溶液的浓度为50％，所述烟油样品与所述乙腈溶液体积比为1:4；所述超声提取的时间为30min。
在某些实施方式中，步骤S2中，所述提取液与所述乙酸的体积比为20:1，所述混合样品中加入净化柱中的体积为750μl。
在某些实施方式中，步骤S3中，离心时间为3min，离心转速为10000rpm。
在某些实施方式中，步骤S4中，所述正离子内标为含0.5％乙酸的2mM乙酸铵溶液和乙腈按体积比9:1混合的混合液分别溶解黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马菌素B1、B2、B3、蛇形毒素、HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇、T-2毒素、15-乙酰基呕吐毒素、赭曲霉毒素A，所述负离子内标为含0.5％乙酸的2mM乙酸铵溶液和乙腈按体积比9:1混合的混合液分别溶解脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基呕吐毒素、瓜萎镰刀菌素、玉米赤霉烯酮。
在某些实施方式中，步骤S5中，所述高效液相的固定相是C18色谱柱，流动相A是含0.5％乙酸的2mM乙酸铵水溶液，流动相B是含0.5％乙酸的2mM乙酸铵甲醇溶液，采用梯度洗脱，流速为1.0ml/min，柱温为40℃，所述质谱采用正负离子两种模式，电喷雾电离离子源，扫描方式为多反应离子监测模式，正负离子模式下，检测对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马菌素B1、B2、B3、蛇形毒素、HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇(NEO)、T-2毒素、15-乙酰基呕吐毒素、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、3-乙酰基呕吐毒素、瓜萎镰刀菌素(FUX)、玉米赤霉烯酮。
进一步，所述质谱的离子源温度：正离子模式：650℃，负离子模式：600℃；气帘气为35.0psi；碰撞气为中等；离子喷雾电压为正离子模式:5000.0V，负离子模式:-4500.0V；雾化气为60.0psi，辅助加热气为65psi。
本发明具有以下有益效果：本发明提供的电子烟中18种真菌毒素的检测方法，总体需要的检测设备只有液相色谱质谱联用仪。简化了操作，一次性进行多种真菌毒素的筛查可以极大的降低检测成本，同时可以提高效率。此外，采用同位素内标方法可以有效的校正基质效应，提高检测结果的准确性和可靠性。本发明帮助国内电子烟企业进行了烟油的真菌毒素风险筛查，以获取FDA准入的门槛。
附图说明
图1是本发明提供的电子烟中18种真菌毒素的检测方法的流程图；
图2是本发明实施例1提供的检测方法检测烟油中13种正离子加标质谱图；
图3是本发明实施例1提供的检测方法烟油中5中负离子加标质谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
实施例1
本实施提供的电子烟中18种真菌毒素的检测方法，具体技术方案如下：
电子烟中18种真菌毒素的检测方法，包括如下步骤：
S1，称取烟油2mL置于50mL离心管中，加入50％乙腈溶液8mL进行霉菌毒素提取。放入超声提取装置进行30min超声提取，充分混合后取下层清夜，即获得提取液。
S2，取步骤S1中的提取液2mL加入试管中，同时加入100uL乙酸进行酸化处理，涡旋振荡混匀，获得混合样品，750μl混合样品中加入净化柱(MycoSpin400)并进行3分钟涡旋振荡，获得含样净化柱。如此，去除杂质，且对目标毒素无吸附效应。
S3，对步骤S2中的含样净化柱装入2mL小离心管内进行离心处理(10000rpm离心3分钟)，取下层清液涡旋振荡1分钟，获得预处理液。
S4，移取75μl步骤S3中的预处理液中到2mL离心管中，然后分别依次加入正离子内标和负离子内标，涡旋处理30s后进行离心处理(10000rpm离心3分钟)，获得样品净化液；
S5，步骤S4中的样品净化液上样，采用HPLC-MS/MS对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马菌素B1、B2、B3、蛇形毒素、HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇(NEO)、T-2毒素、15-乙酰基呕吐毒素、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、3-乙酰基呕吐毒素、瓜萎镰刀菌素(FUX)、玉米赤霉烯酮进行定性定量分析。
具体地，本实施例中HPLC-MS/MS的具体参数如下：
正离子内标溶液
正离子内标溶液配置方法:含0.5％乙酸的2mM乙酸铵溶液和乙腈按照体积比90:10混合作为内标溶剂。
在20mL安剖瓶中加入12.5mL正离子内标溶剂，然后按下表加入相应体积的毒素内标:
负离子内标溶液
负离子内标溶液:含0.5％乙酸的2mM乙酸铵溶液和乙腈按照体积比90:10混合作为内标溶剂。
在20mL安剖瓶中加入12.5mL负离子内标溶剂，然后按下表加入相应体积的毒素内标:
液相色谱参数
设备：安捷伦1290液相色谱仪
色谱柱及保护柱:
飞诺美Gemini HPLC C18色谱柱，4.6x 150mm，5μm
飞诺美保护柱芯,Gemini C18 4x 3.0mm
流动相A：ESI+&ESI-：含0.5％乙酸的2mM乙酸铵水溶液
流动相B：ESI+&ESI-：含0.5％乙酸的2mM乙酸铵甲醇溶液
流速：1.0ml/min
梯度如下表所示：
| 时间(分钟) | 0 | 1 | 14 | 15 | 15.1 | 16 | 20 |
| ％流动相B | 10 | 10 | 97 | 97 | 10 | 10 | 10 |
柱温：40℃
进样体积:正离子模式：20μl
负离子模式：10μl
吸样速度：200.0μl/min
注射速度：200.0μl/min
洗针信息：需要洗针(洗针位置：在线冲洗&冲洗时间：30秒)
进样针高度：0.0mm
样品盘温度控制：启用(10℃)
质谱条件
仪器：AB Sciex Triple Quad 5500
离子源温度:正离子模式：650℃
负离子模式：600℃
气帘气：35.0
碰撞气：Medium
离子化电压：正离子模式：5000.0
负离子模式：-4500.0
喷雾气：60.0
辅助加热气:65.0
正离子模式如下表所示：
负离子模式如下表所示：
如图2所示，本实施例提供的检测方法检测烟油中13种正离子加标质谱图。如图3所示，本实施例提供的检测方法烟油中5中负离子加标质谱图，由于分成了正负离子一些容易产生干扰和化学反应的物质可以不进行混合而实现分离，同时母离子用来定量，子离子用来定性。
上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.电子烟中18种真菌毒素的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将烟油样品加入乙腈溶液中，放入超声提取装置进行超声提取，取下层清夜，即获得提取液；
S2，向步骤S1中的提取液中加入乙酸进行酸化处理，获得混合样品，所述混合样品中加入净化柱并进行涡旋处理，获得含样净化柱；
S3，对步骤S2中的含样净化柱进行离心处理，获得预处理液；
S4，向步骤S3中的预处理液中加入正离子内标和负离子内标，涡旋处理后进行离心处理，获得样品净化液；
S5，步骤S4中的样品净化液上样，采用HPLC-MS/MS对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马菌素B1、B2、B3、蛇形毒素、HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇、T-2毒素、15-乙酰基呕吐毒素、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基呕吐毒素、瓜萎镰刀菌素、玉米赤霉烯酮进行定性定量分析。
2.根据权利要求1所述的电子烟中18种真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述乙腈溶液的浓度为50％，所述烟油样品与所述乙腈溶液体积比为1:4；所述超声提取的时间为30min。
3.根据权利要求1所述的电子烟中18种真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述提取液与所述乙酸的体积比为20:1，所述混合样品中加入净化柱中的体积为750μl。
4.根据权利要求1所述的电子烟中18种真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤S3中，离心时间为3min，离心转速为10000rpm。
5.根据权利要求1所述的电子烟中18种真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤S4中，所述正离子内标为含0.5％乙酸的2mM乙酸铵溶液和乙腈按体积比9:1混合的混合液分别溶解黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马菌素B1、B2、B3、蛇形毒素、HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇、T-2毒素、15-乙酰基呕吐毒素、赭曲霉毒素A，所述负离子内标为含0.5％乙酸的2mM乙酸铵溶液和乙腈按体积比9:1混合的混合液分别溶解脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基呕吐毒素、瓜萎镰刀菌素、玉米赤霉烯酮。
6.根据权利要求1所述的电子烟中18种真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤S5中，所述高效液相的固定相是C18色谱柱，流动相A是含0.5％乙酸的2mM乙酸铵水溶液，流动相B是含0.5％乙酸的2mM乙酸铵甲醇溶液，采用梯度洗脱，流速为1.0ml/min，柱温为40℃，所述质谱采用正负离子两种模式，电喷雾电离离子源，扫描方式为多反应离子监测模式，正离子模式下，检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马菌素B1、B2、B3、蛇形毒素、HT-2毒素、新茄镰孢菌醇(NEO)、T-2毒素、15-乙酰基呕吐毒素、赭曲霉毒素A；负离子模式下，检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基呕吐毒素、雪腐镰刀菌烯醇、瓜萎镰菌醇、玉米赤霉烯酮。
7.根据权利要求6所述的电子烟中18种真菌毒素的检测方法，其特征在于，所述质谱的离子源温度：正离子模式：650℃，负离子模式：600℃；气帘气为35.0psi；碰撞气为中等；离子喷雾电压为正离子模式:5000.0V，负离子模式:-4500.0V；雾化气为60.0psi，辅助加热气为65psi。
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