CN111141844B - 一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法 - Google Patents

一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法。本发明采用乙腈和水的混合提取液提取后，再以改良的QuEChERS法(无水硫酸镁、氯化钠、C18粉和PSA粉)处理，再经过净化柱净化去除脂肪等基质后，采用Symmetry300 C18色谱柱，以0.3％甲酸水/甲醇为流动相，进行高效液相色谱－串联质谱法检测。该方法简便、快速、净化效果好，霉菌毒素、农药的平均回收率在70.36‑105.75％之间，可以满足对花生中9种霉菌毒素以及20种农药的限量检测要求。

Description

一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法
技术领域
本发明涉及一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法，属于农产品检测技术领域。
背景技术
花生在世界粮油食品中占有重要地位，是主要油料及经济作物，广泛种植于亚非、南美等发展中国家和美国等部分发达国家。花生含有丰富的脂肪和蛋白质，是人民生活重要的植物油脂和蛋白质来源。近年来，随着人们对营养健康理念的追求，花生的保健功能也不断被发掘和青睐，有研究表明，其富含的不饱和脂肪酸具有降胆固醇作用；富含的白藜芦醇具有抗肿瘤、抗衰老和预防心脑血管疾病等功效；花生红衣具有补血止血等功能，此外，花生还具有润肺养胃、提高记忆力等营养价值，可谓天然保健佳品。
花生是我国北方一种重要的经济作物，同时花生也是我国传统的出口农产品品种，主要出口到日本、欧盟等国家和地区。花生种植过程中容易遭受病虫害的侵袭，如根结线虫病、枯萎病、蚜虫、蛴螬、蝼蛄等。为防治病虫害，适当地使用农药是必要的。然而由于我国花生种植分散，农药使用控制困难，影响了花生出口。我国出口到日本的花生多次被检出农药六六六、乙草胺而遭退运。随着各国对于农药残留限量标准制定日趋严格和详细，急需花生中准确高效的农药多残留筛查和定量检测技术。由于花生中脂肪、蛋白质等含量高，样品基质复杂，需要进行有效的样品前处理，并采用高灵敏度的检测仪器检测。目前，对于花生等油料检测通常采用的样品前处理方法有液液萃取法、固相萃取法、凝胶渗透色谱法、快速溶剂萃取法、QuEChERS法等，而检测方法有气相色谱法、气质联用法、液相色谱法、液质联用法等。这些方法多是针对单个或少量农药的检测方法，无法满足日趋繁杂的农药检测项目和快速检测需求。
花生易受黄曲霉毒素污染，严重威胁花生生产和消费安全，随着社会经济发展和人民生活水平的提高，花生及其制品的安全问题也愈来愈引起人们的重视。然而，由于黄曲霉毒素多为自然发生，污染环节多，种、收、储、运等各个环节都存在黄曲霉毒素污染风险，特别是田间生产过程是花生黄曲霉毒素污染的重要环节，其中涉及品种类型、气候环境、采收时期、栽培模式乃至土壤中的微生态环境等多元化的影响因素。除了黄曲霉毒素之外，研究较为深入的是十几种对人类危害较大的真菌毒素，它们一般同时具有毒性强和污染频率高的特点，其中以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，又称呕吐毒素以及呕吐毒素的代谢物15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮(ZEA)、赭曲霉毒素A最为突出。这五种真菌毒素不仅具有致癌、致畸和致突变等作用，还具有肝细胞毒性、中毒性肾损害、生殖紊乱以及免疫抑制等作用，对人类健康造成极大威胁。食品中真菌毒素感染已成为不可忽视的问题。目前食品、农产品中真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、免疫亲和柱净化－荧光光度法和免疫亲和柱净化－高效液相色谱法、高效液相色谱－串联质谱法等。
目前霉菌毒素和农药残留的检测方法相对较为独立，不能实现同时检测，且对基质的抗干扰能力不足，易出现假阳性。因此建立花生中这两类常见污染物的同时快速高效处理和准确定性定量检测的方法十分必要。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法。本发明采用乙腈和水的混合提取液提取后，再以改良的QuEChERS法处理，再经过净化柱净化去除脂肪等基质后，采用Symmetry300 C18色谱柱，以0.3％甲酸水/甲醇为流动相，进行高效液相色谱－串联质谱法检测，可以同时检测花生样品中9种霉菌毒素以及20种农药。该方法简便、快速、净化效果好，可以满足对花生中霉菌毒素和农药的限量检测要求。
本发明的技术方案是：一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法，其特征是，包括以下步骤：
1)花生样品处理
将花生样品采用乙腈和水的混合提取液进行超声提取，离心，上清液加入无水硫酸镁、氯化钠、C18粉和PSA粉(乙二胺-N-丙基硅烷)进行萃取，然后离心，上清液采用净化柱进一步去处油脂后和水混合，过滤，得到样品分析液；
所述按体积比计，乙腈：水＝80：20；
所述无水硫酸镁、氯化钠、C18粉和PSA粉的质量比为10：4.5-5.5：0.8-1.2：0.8-1.2，优选10：5：1：1；
所述净化柱为QuECHERS-HF净化柱。
2)采用UPLC-MS/MS对步骤1)中获得的样品分析液进行9种霉菌毒素和20种农药残留的定性、定量分析。
其中色谱条件：Symmetry300 C18柱(75×4.6mm2 I.D，3.5μm)。
流动相A：0.3％甲酸水溶液，流动相B：甲醇，流速：0.6mL/min。
梯度洗脱程序如下：0-1min：流动相B从10％线性增加到20％，平衡0.5min；1.5-2.5min，流动相B从20％线性增加到30％，平衡0.5min；3-4min：流动相B从30％线性增加到40％，平衡1min；5-6min：流动相B从40％线性增加到50％，平衡1min；7-8min：流动相B从50％线性增加到60％，平衡1min；9-10min：流动相B从60％线性增加到70％，平衡1min；11-12min：流动相B从70％线性增加到80％；12-13min：流动相B从80％线性增加到90％，平衡1min；14-15.5min：流动相B从90％线性减少到10％，平衡1.5min。
质谱条件：AB5500型三重四级杆串联质谱仪，电喷雾(ESI)离子源，正负离子扫描模式；各参数如下：离子喷雾电压：4.5kV，气帘气压力：15psi，雾化气压力：50psi，辅助加热气压力：50psi，离子源加热温度：550℃。去簇电压及碰撞能量见表1。
所述9种霉菌毒素为：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；
所述20种农药为：啶虫脒、多菌灵、吡虫啉、毒死蜱、戊唑醇、三唑酮、丙环唑、氟虫腈、三唑磷、克百威、辛硫磷、异丙威、噻嗪酮、嘧菌酯、甲胺磷、吡蚜酮、氯虫苯甲酰胺、噻虫胺、乐果、3-羟基克百威。
进一步的，所述步骤1)具体为：取磨碎均质样品加入20mL混合提取液(乙腈：水＝80：20)匀浆，高速搅拌2min，超声提取15min，4000rpm离心5min，取5ml上清液并加入1g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，0.1g C18粉，0.1gPSA粉，快速震荡混匀，涡旋2分钟，4000rpm下离心5min；待分层后取上清液过QuECHERS-HF净化柱，取1ml上清液和1ml水混合，使用针头过滤器过滤，得到样品分析液。
进一步的，本发明采用标准曲线法对9种霉菌毒素和20种农药残留进行定量分析，标准曲线如表2所示。
本发明的有益效果是：
1)花生中脂肪、蛋白质等含量高，样品基质复杂，本发明采用提取液(乙腈：水＝80：20)提取，霉菌毒素、农药的平均回收率在70.36-105.75％之间。同时加入C18粉和PSA粉，用于去除油脂和有机酸，色素和金属离子等；但是花生的油脂太高，难于用微量的C18粉去除干净，所以在提取之后再用QuECHERS-HF净化柱净化，可以得到理想的分离效果，这种方法快速、简单，大大提高了效率，缩短了提取时间，适用于大量样品的预处理。
2)本发明采用Symmetry300 C18柱能很好的进行霉菌毒素和农药的分离，采用0.3％的甲酸可以获得更好的灵敏度，样品中9种霉菌毒素的检出限为0.02～1.0μg/kg，定量限为0.1～2.0μg/kg，20种农药的检出限为0.01～0.5μg/kg，定量限为0.1～1.0μg/kg。
总之，本发明的方法简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确度高，检出限和定量限大大低于中国标准限量GB2761 2017，GB2763 2016。
附图说明
图1为部分霉菌毒素和农药的标准曲线，其中A表示黄曲霉毒素G2，B表示多菌灵，C表示吡虫啉，D表示戊唑醇；
图2为9种霉菌毒素和20种农药的质谱图，其中：(1)吡蚜酮；(2)甲胺磷；(3)多菌灵；(4)脱氧雪腐镰刀菌烯醇；(5)吡虫啉：(6)噻虫胺；(7)乐果；(8)3-羟基克百威；(9)啶虫脒；(10)15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；(11)3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；(12)黄曲霉毒素G2；(13)黄曲霉毒素G1；(14)黄曲霉毒素B2；(15)黄曲霉毒素B1；(16)克百威；(17)异丙威；(18)氯虫苯甲酰胺；(19)嘧菌酯；(20)三唑酮；(21)玉米赤霉烯酮；(22)三唑磷；(23)赭曲霉毒素A；(24)氟虫腈；(25)噻嗪酮；(26)戊唑醇；(27)丙环唑；(28)辛硫磷；(29)毒死蜱。
具体实施方式
实施例1
1材料和方法
1.1材料和试剂
黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的标准品购自美国SigmaAldrich公司，脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的标准品购自Romer Labs公司，C18粉(50μm，
Figure BDA0002344693520000041
)购自美国Agela Technologies公司，乙二胺-N-丙基硅烷(PSA粉，40-60μm，
Figure BDA0002344693520000042
)购自美国Agela Technologies公司。所用化学药品和溶剂均为ACS等级，用于HPLC分析的甲醇、乙腈和甲酸均为HPLC级。农药啶虫脒、多菌灵、吡虫啉、毒死蜱、戊唑醇、三唑酮、丙环唑、氟虫腈、三唑磷、克百威、辛硫磷、异丙威、噻嗪酮、嘧菌酯、甲胺磷、吡蚜酮、氯虫苯甲酰胺、噻虫胺、乐果、3-羟基克百威标准品购自First Standard公司(天津，中国)。农药贮备原液(1000mg/L)，保存于-20℃。制备了一系列用乙腈稀释的含有各种标准混合物的标准溶液(10mg/L)。来自Millipore公司的MilliQ-Plus超纯水系统(米尔福德，美国)，在整个研究过程中所有用水均来自MilliQ-Plus超纯水。其它溶剂均来自上海国药化工试剂(上海，中国)。PROTM QuECHERS-HF净化柱购自河南华仁健康科技有限公司。
1.2标准溶液配制
将9种霉菌毒素和20种农药加入到乙腈中，制备浓度为2μg/ml的9种霉菌毒素和1μg/ml的20种农药的混合标准储备液，-18℃保存，每3个月更新一次。并用乙腈稀释制备了一系列的标准工作液，使用标准工作液制备相应标准溶液的标准曲线。
1.3样品提取和净化
花生样品的制备：将花生磨碎均质，取5.0g磨碎均质样品加入20mL(乙腈：水＝80：20)在50ml的离心管中匀浆，高速搅拌2min，超声提取15min，在高速离心机中4000rpm离心5min，取5ml上清液并加入1g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，0.1g C18粉，0.1gPSA粉，快速震荡混匀，涡旋2分钟，高速离心机4000rpm下离心5min。待分层后取上清液过PROTM QuECHERS-HF净化柱，取1ml上清液和1ml水混合，使用0.22μm的Biosharp BS-QT-013(13mm*0.22μm)针头过滤器过滤，装瓶待上机。
1.4仪器方法
色谱条件：waters I class超高液相色谱仪，Symmetry300 C18柱(75×4.6mm2I.D，3.5μm)。柱温：35℃，样品室温度20℃；进样体积：1.0μL。
流动相A：0.3％甲酸水溶液，流动相B：甲醇，流速：0.6mL/min。
梯度洗脱程序如下：0-1min：流动相B从10％线性增加到20％，平衡0.5min；1.5-2.5min，流动相B从20％线性增加到30％，平衡0.5min；3-4min：流动相B从30％线性增加到40％，平衡1min；5-6min：流动相B从40％线性增加到50％，平衡1min；7-8min：流动相B从50％线性增加到60％，平衡1min；9-10min：流动相B从60％线性增加到70％，平衡1min；11-12min：流动相B从70％线性增加到80％；12-13min：流动相B从80％线性增加到90％，平衡1min；14-15.5min：流动相B从90％线性减少到10％，平衡1.5min。
质谱条件：AB5500型三重四级杆串联质谱仪，电喷雾(ESI)离子源，正负离子扫描模式；各参数如下：离子喷雾电压：4.5kV，气帘气压力：15psi，雾化气压力：50psi，辅助加热气压力：50psi，离子源加热温度：550℃。
去簇电压及碰撞能量见表1，使用Analyst1.6.2软件进行优化。采用多反应监测(MRM)模式采集数据，保证采集点充足(每个峰至少有12个点)。9种霉菌毒素及20种农药的标准溶液的MRM参数如表1所示，质谱图如图2所示。
表1 9种霉菌毒素和20种农药的MRM参数
Figure BDA0002344693520000051
Figure BDA0002344693520000061
Figure BDA0002344693520000071
2方法验证
2.1分析方法
分析9种霉菌毒素和20种农药需要建立标准曲线，每种霉菌毒素的标准曲线选用5个浓度(2、20、40、100、200ng/mL)，每种农药选用5个浓度(1.0、10、20、50、100ng/mL)的标准溶液，通过绘制LC/MS/MS中每种霉菌毒素和农药的峰面积(y轴)与浓度(x轴)的关系曲线，建立了每种霉菌毒素和农药的标准曲线(部分标准曲线图见图1)。
将9种霉菌毒素和20种农药的混合标准溶液添加到未被霉菌毒素和农药污染的花生样品中，以在霉菌毒素和农药感染的情况下分析9种霉菌毒素和20种农药的混合标准溶液方法的精密度，图2中各霉菌毒素和农药的添加量如下：9种霉菌毒素100.0ng/g：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；20种农药20.0ng/g：啶虫脒、多菌灵、吡虫啉、毒死蜱、戊唑醇、三唑酮、丙环唑、氟虫腈、三唑磷、克百威、辛硫磷、异丙威、噻嗪酮、嘧菌酯、甲胺磷、吡蚜酮、氯虫苯甲酰胺、噻虫胺、乐果、3-羟基克百威，用LOD和LOQ测定了LC/MS/MS分析方法的灵敏度。
2.2方法验证
在2、20、40、100、200ng/ml浓度水平上进行添加不同的霉菌毒素建立标准曲线，及1、10、20、50、100ng/ml浓度水平上进行添加不同的农药建立标准曲线。表2给出了标准曲线的线性和检测限，在实验浓度范围内R值高于0.9990，有良好的线性，每种毒素和农药的检测限和定量限分别是信噪比的3倍和10倍，样品的9种霉菌毒素的检出限为0.02～1.0μg/kg，定量限为0.1～2.0μg/kg，20种农药的检出限为0.01～0.5μg/kg，定量限为0.1～1.0μg/kg。结果表明：该方法对花生中霉菌毒素、农药的检测是灵敏的。
表2 9种霉菌毒素和20种农药的线性、检出限和定量限
Figure BDA0002344693520000072
Figure BDA0002344693520000081
3.4精密度和回收率
加样回收率试验，在三份花生空白样品中进行低(2μg/kg)、中(40μg/kg)、高(200μg/kg)三个浓度水平上添加9种霉菌毒素的混合标准物质及低(1μg/kg)、中(50μg/kg)、高(100μg/kg)三个浓度水平上添加20种农药的混合标准物质进行测定。
计算峰面积日内和日间的变化以及相对标准偏差来分析其精密度，表3-4给出了分析物的平均回收率和相对标准偏差。表3-4中可以看出，使用该方法所有的霉菌毒素、农药的平均回收率在70.36-105.75％之间，所有相对标准偏差低于15％。
表3 9种霉菌毒素分析方法的精密度和回收率
Figure BDA0002344693520000082
Figure BDA0002344693520000091
表4 20种农药分析方法的精密度和回收率
Figure BDA0002344693520000092
3.结果与讨论
3.1样品处理方法的优化
在早期花生中黄曲霉毒素的研究中，黄曲霉毒素的提取常使用甲醇和水提取，过免疫亲和柱净化，操作繁琐、费时费力，并且免疫亲和柱昂贵。之后有在霉菌毒素的萃取中，用提取液(乙腈：水：甲酸＝79：20：1)提取，这个方法对于同时提取黄曲霉毒素和伏马毒素时回收率高。对于没有伏马毒素的霉菌毒素可以不用酸的提取，并且在同时提取霉菌毒素和农药时，农药的回收率不好，如啶虫脒(62.3％)、嘧菌酯(65.8％)等。因此可以只用提取液(乙腈：水＝80：20)提取，同时加入C18粉和PSA粉，用于去除油脂和有机酸，色素和金属离子等；但是花生的油脂太高，难于用微量的C18粉去除干净，所以在提取之后再用PROTMQuECHERS-HF净化柱净化，QuECHERS-HF柱是多层修饰复合碳纳米材料与C18、弗罗里硅土等传统吸附材料结合，大大增加了吸附材料比表面积，增强了材料的吸附能力，对脂肪、糖类等杂质提取更有针对性，可以得到理想的分离效果。这种方法快速、简单，大大提高了效率，缩短了提取时间，适用于大量样品的预处理。实验证明：改良后的QuEChERS法是检测花生中9种霉菌毒素和20种农药残留量的最佳预处理方法。
3.2高液相色谱条件的优化
在建立MS/MS参数后，优化液相方法。只进行霉菌毒素的提取应用UPLC BEH C18柱能很好的进行分离，并且响应值高；但是对于加入20种农药，分离效果、灵敏度不好，因此改用Symmetry300 C18柱，能很好的进行霉菌毒素和农药的分离，并且灵敏度高。只检测霉菌毒素的时候使用0.5％甲酸和甲醇作为流动相，对分离霉菌毒素效果很好，但是对农药的响应值低，降低甲酸的浓度，当甲酸浓度降到0.3％时效果最佳，而且酸度再次减少，毒素的灵敏度降低，因此使用0.3％的甲酸可以获得更好的灵敏度，如图2所示。用质谱法可以获得较好的分离效果。
4.结论
建立一种花生中同时快速提取并测定9种霉菌毒素黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀烯醇和玉米赤霉烯酮，20种农药啶虫脒、多菌灵、吡虫啉、毒死蜱、戊唑醇、三唑酮、丙环唑、氟虫腈、三唑磷、克百威、辛硫磷、异丙威、噻嗪酮、嘧菌酯、甲胺磷、吡蚜酮、氯虫苯甲酰胺、噻虫胺、乐果、3-羟基克百威的UPLC-MS/MS方法。这种方法简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确度高，检出限和定量限大大低于中国标准限量GB2761 2017，GB2763 2016。
实施例2：实际样品的测定
从市场上买了10份花生，采用本文建立的方法对10份花生样品进行分析，其中2份样品检出黄曲霉毒素B1，含量分别为3.1μg/kg和10.1μg/kg；2份样品检出玉米赤霉烯酮，含量为1.2μg/kg和8.3μg/kg；3份样品检出毒死蜱，含量为15.51、17.95和48.63μg/kg。

Claims (5)

1.一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法，其特征是，
所述9种霉菌毒素为：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；
所述20种农药为：啶虫脒、多菌灵、吡虫啉、毒死蜱、戊唑醇、三唑酮、丙环唑、氟虫腈、三唑磷、克百威、辛硫磷、异丙威、噻嗪酮、嘧菌酯、甲胺磷、吡蚜酮、氯虫苯甲酰胺、噻虫胺、乐果和3-羟基克百威；
具体包括以下步骤：
1)花生样品处理
将花生样品采用体积比80：20的乙腈和水的混合提取液进行超声提取，离心，上清液加入无水硫酸镁、氯化钠、C18粉和PSA粉进行萃取，然后离心，上清液采用QuECHERS-HF净化柱进一步去除油脂后和水混合，过滤，得到样品分析液；所述无水硫酸镁、氯化钠、C18粉和PSA粉的质量比为10：4.5-5.5：0.8-1.2：0.8-1.2；
2)以Symmetry300 C18柱为色谱柱，采用UPLC-MS/MS方法对步骤1)中获得的样品分析液进行9种霉菌毒素和20种农药残留的定性、定量分析；
检测采用的流动相A：0.3％甲酸水溶液，流动相B：甲醇，梯度洗脱；
所述梯度洗脱程序如下：0-1min：流动相B从10％线性增加到20％，平衡0.5min；1.5-2.5min，流动相B从20％线性增加到30％，平衡0.5min；3-4min：流动相B从30％线性增加到40％，平衡1min；5-6min：流动相B从40％线性增加到50％，平衡1min；7-8min：流动相B从50％线性增加到60％，平衡1min；9-10min：流动相B从60％线性增加到70％，平衡1min；11-12min：流动相B从70％线性增加到80％；12-13min：流动相B从80％线性增加到90％，平衡1min；14-15.5min：流动相B从90％线性减少到10％，平衡1.5min。
2.如权利要求1所述的一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法，其特征是，质谱条件：AB5500型三重四级杆串联质谱仪，电喷雾ESI离子源，正负离子扫描模式；各参数如下：离子喷雾电压：4.5kV，气帘气压力：15psi，雾化气压力：50psi，辅助加热气压力：50psi，离子源加热温度：550℃。
3.如权利要求1或2所述的一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法，其特征是，去簇电压、碰撞能量、定量离子对、定性离子对及保留时间见下表：
Figure FDA0003853894240000011
Figure FDA0003853894240000021
Figure FDA0003853894240000031
4.如权利要求1所述的一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法，其特征是，所述步骤1)无水硫酸镁、氯化钠、C18粉和PSA粉的质量比为10：5：1：1。
5.如权利要求4所述的一种快速测定花生中9种霉菌毒素和20种农药残留的方法，其特征是，所述步骤1)具体为：取磨碎均质花生样品加入20mL体积比80：20的乙腈和水的混合提取液匀浆，高速搅拌2min，超声提取15min，4000rpm离心5min，取5ml上清液并加入1g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，0.1g C18粉，0.1gPSA粉，震荡混匀，涡旋2分钟，4000rpm下离心5min；待分层后取上清液过QuECHERS-HF净化柱后取1ml，与1ml水混合，使用针头过滤器过滤，得到样品分析液。
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