CN106950298B - 一种同时检测新会陈皮中真菌毒素和农药残留的方法 - Google Patents

Abstract

一种同时检测新会陈皮中真菌毒素和农药残留的方法，所述方法包括：制备陈皮基质空白提取液；制作陈皮基质匹配标准曲线；样品处理：用提取液对样品进行提取，然后加入改性多壁碳纳米管进行净化处理并进行过滤得到样品净化液；样品检测：对样品净化液进行液相色谱‑串联质谱测定。本发明以改性多壁碳纳米管作为净化吸附剂，将改良QuEChERS法与液相色谱‑串联质谱联用仪结合应用于新会陈皮中真菌毒素和农药残留的同时检测，操作简单，准确度高，稳定性好，满足痕量分析的要求。

Description

一种同时检测新会陈皮中真菌毒素和农药残留的方法

技术领域

本发明涉及真菌毒素和农药残留量的检测方法，特别是涉及一种同时检测新会陈皮中真菌毒素和农药残留的方法。

背景技术

陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮，新会是陈皮的道地产区，新会陈皮为广东十大地道中药材之一，而经年陈藏的新会陈皮更是珍品。2016年新会陈皮种植面积共6.5万亩，陈皮总产量预计达7000吨，行业产值近30亿元，但新会陈皮面临的食品安全风险十分严峻。陈皮在加工储存过程中，由于受温度、湿度等影响，容易霉变而产生真菌，真菌代谢产生有毒的真菌毒素，真菌毒素能损坏人的肝肾功能、致癌、致畸并诱发免疫抑制性疾病。在这些代谢物中，黄曲霉毒素类、赭曲霉毒素类、玉米赤霉烯酮对人体健康危害尤为巨大。此外，农作物种植过程中引入的农药残留，通过食物链进入人体，进而危害人体健康，同样是导致食品安全突发事件频发的主要原因。2,4-二氯苯氧乙酸是应用最为广泛的除草剂，灭多威是一种广谱性氨基甲酸酯类杀虫剂，毒死蜱则是最常用的杀虫剂，这3种农药高效、广谱，具有击倒速度快、作用范围广等特点，在我国农作物种植中使用广泛。因此，由真菌毒素、农药残留产生的食品健康风险问题日益受到人们的关注。

目前，真菌毒素检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)、薄层色谱法、液相色谱法和液质联用法等，但前三个方法选择性较差，只能检测单一类的真菌毒素，不能同时检测多种真菌毒素。而农药定量检测一般采用气相色谱法、气质联用法。现有真菌毒素、农药残留检测方法相对较为独立，真菌毒素和农药残留不能同时检测，无法满足食品安全突发事件快速处置要求的检测时间短、检测目标组分多。近年来，液质联用技术(HPLC-MS/MS)在检测方面的优势逐渐显现，采用选择离子监测技术，可大大提高检测的灵敏度和准确性，被越来越多地应用于高通量分析，但常规前处理方法步骤繁琐、有机试剂消耗量大，对操作人员技能要求高。而且由于新会陈皮特有的挥发油、黄酮化合物、有机酸等化学成分，加之还有大量色素、脂肪、糖等生化成分，用传统的液液萃取、索氏抽提、固相萃取等前处理方法，普遍存在基质干扰严重、步骤繁琐、重现性差且有机溶剂消耗量大等缺点。

2003年，Anastassiades等人建立了QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)新型样品前处理方法，其步骤可以简单归纳为：(1)样品粉碎；(2)单一溶剂乙腈提取；(3)加入MgSO₄等盐类除水；(4)加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等净化吸附剂净化；(5)对提取的上清液进行GC-MS、LC-MS检测。QuEChERS方法因操作简单、通用性强、成本低、环境友好、能满足性质差异较大的多种目标物的同时分析检测，被国内外广泛应用于农药残留检测，但是，用乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)作为净化吸附剂，去除基质中干扰物的能力有限。

而多壁碳纳米管(MWNTs)因其准一维中空管结构加之大的比表面积，使其在净化吸附方面具有优异的性能。目前有文献报道其用于痕量组分样品前处理中的富集与净化。但未处理的多壁碳纳米管由于表面缺少活性官能基团，疏水性强，不溶不熔，会团聚成致密的网络，影响了其作为净化吸附剂的应用。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种同时检测新会陈皮中真菌毒素和农药残留的方法，该方法以改性多壁碳纳米管作为净化吸附剂，将改良QuEChERS法与液相色谱-串联质谱技术结合应用于新会陈皮中真菌毒素和农药残留的检测，能有效除去基质干扰，方法准确、灵敏度高、操作简单快速。

本发明的技术方案如下：

一种同时检测新会陈皮中真菌毒素和农药残留的方法，：所述的真菌毒素包括黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮；所述的农药包括2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威和毒死蜱；该方法步骤包括：

(1)改性多壁碳纳米管的制备：将多壁碳纳米管与浓硫酸混合进行超声处理，再加入浓硝酸，超声处理后静置，吸除上层混酸清液，然后利用超纯水稀释并过滤，将过滤液用水洗至滤液的pH值为7，所得黑色固体干燥后即得被氧化的改性多壁碳纳米管。

(2)制备陈皮基质空白提取液：在新会陈皮空白样品中加入提取液，进行振荡，然后加入改性多壁碳纳米管净化后再离心处理，吸取上层清液，得到陈皮基质空白提取液；

(3)制作陈皮基质匹配标准曲线：用步骤(2)中的陈皮基质空白提取液作为溶剂，配制真菌毒素和农药陈皮基质匹配混合标准溶液，所述的陈皮基质匹配混合标准溶液为6个浓度梯度的真菌毒素和农药混合溶液，其中黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1的浓度分别为0.10ng/mL、0.20ng/mL、0.50ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL，对应的赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的浓度为5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL，对应的2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱的浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，并对陈皮基质匹配混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定，以定量离子色谱峰面积为纵坐标，对应的质量浓度为横坐标作陈皮基质匹配标准曲线；

(4)样品处理：将新会陈皮样品粉碎，然后用提取液对样品中的真菌毒素和农药进行提取，并进行振荡处理，然后加入改性多壁碳纳米管，进行振荡、超声、离心处理，将上层清液过滤，得到样品净化液；

(5)样品检测：将步骤(4)中所得的样品净化液进行液相色谱-串联质谱测定，得到样品净化液的色谱峰面积，根据步骤(3)的陈皮基质匹配标准曲线，计算得到样品中真菌毒素和农药的残留量；

其中所述的提取液为体积比为80：20的乙腈-水混合溶液，所述改性多壁碳纳米管是表面带有羟基、羧基活性官能基团的多壁碳纳米管，其长度为100～200nm；

在步骤(3)和(5)的液相色谱-串联质谱测定中，所采用的色谱条件为：色谱柱：Shimadzu C18，规格为150mm×2.1mm×3.5μm；流速：0.20mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：含1％甲酸的5mmoL/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～2min，流动相A为90％，流动相B为10％；2～20min，流动相A为90％～20％，流动相B为10％～80％；20～26min，流动相A为90％，流动相B为10％；所采用的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；碰撞气压力：60kPa；气帘气压力：250kPa；雾化气压力：550kPa；加热辅助气压力：550kPa。

本发明采用陈皮基质匹配混合标准溶液校正方法进行定量分析和计算，对基质效应进行补偿，提高了定量分析的准确性；本发明采用改性多壁碳纳米管作为净化吸附剂，可有效除去新会陈皮中的水溶性和脂溶性杂质，得到的净化液几乎无色，杂质对真菌毒素和农药检测无影响且回收率高。此外，通过对多壁碳纳米管进行衍生化化学修饰，用强氧化性酸对多壁碳纳米管进行氧化处理，使其表面产生一定量的羟基、羧基活性官能基团，有效提高了多壁碳纳米管在溶液介质中的分散性能和对有机化合物的吸附性能；另外，采用自制的改性多壁碳纳米管作为净化吸附剂，可大幅度降低样品前处理的成本。所述改性多壁碳纳米管能在广泛的pH值范围内保持稳定，保证了净化效果及方法的稳定性和通用性。

乙腈作为提取液能有效沉淀蛋白质、脂肪，此外提取液含水可以湿润基质增强有机溶剂的渗透能力，便于有机溶剂的渗入和萃取从而提高对目标化合物的提取效率；采用体积比为80：20的乙腈-水混合溶液作为新会陈皮中真菌毒素和农药残留的提取液，可以获得较高的提取回收率。

所述改性多壁碳纳米管是表面带有羟基、羧基活性官能基团的多壁碳纳米管，其长度为100～200nm。表面带有羟基、羧基活性官能团的多壁碳纳米管在有机溶剂中的分散性好，净化吸附能力强。色谱条件的选择，能够快速有效地分离新会陈皮中的各真菌毒素和农药。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为本发明多壁碳纳米管氧化改性前后的透射电镜图，其中图a为氧化改性前，图b为氧化改性后；

图2为本发明多壁碳纳米管氧化改性前后的红外光谱图，其中曲线a为氧化改性前，曲线b为氧化改性后；

图3为本发明具体实施例中新会陈皮样品的总离子流图；

图4为本发明不同体积比的乙腈-水混合溶液对2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮提取回收率的影响；

图5为本发明改性多壁碳纳米管用量对2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮目标化合物回收率的影响；

图6为本发明9种真菌毒素和农药的基质效应；

图7为本发明陈皮基质匹配混合标准溶液的总离子流图；

图8为本发明新会陈皮空白样品添加浓度为0.20ng/mL的黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1，浓度为10ng/mL的赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮，浓度为2.0ng/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱的有机溶剂混合标准溶液的总离子流图；

其中，1为2,4-二氯苯氧乙酸；2为灭多威；3为毒死蜱；4为黄曲霉毒素G2；5为黄曲霉毒素G1；6为黄曲霉毒素B2；7为黄曲霉毒素B1；8为赭曲霉毒素A；9为玉米赤霉烯酮。

具体实施方式

(一)仪器与试剂

LC-20AT高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；API 3200质谱仪(美国ABsciex公司)；H-800-1型透射电子显微镜(日本日立公司)；Nexus 670型傅立叶变换红外光谱扫描仪(美国Thermo公司)；2-16型通用台式高速离心机(德国Sigma公司)；DZF-6050型真空干燥机(上海精密仪表公司)；KQ 2200DB型超声振荡器(昆山超声仪器有限公司)；LAB DANCER涡旋混合器(德国IKA公司)；DN-12W氮吹仪(上海比郎公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；50mm×0.22μm聚四氟乙烯微孔滤膜(美国Millipore公司)。

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、灭多威(Methomyl)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)标准品，均购自美国Sigma公司；甲醇、乙腈(色谱纯，德国默克公司)；甲酸、乙酸铵(优级纯，上海安谱公司)；多壁碳纳米管(纯度＞95％，直径为10～20nm，长度为300～800nm，深圳纳米港有限公司)；弗洛里(Florisil)净化吸附剂(80～100目，上海博势公司)；N-丙基乙二胺(PSA)净化吸附剂(平均粒度45μm，孔体积0.8m³/g，山东奥秘公司)；硅胶(60～100目，青岛海洋化工)；实验用水为超纯水。

本发明实施例所述的真菌毒素包括黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮；所述的农药包括2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威和毒死蜱。本发明所述有机溶剂混合标准溶液的溶剂为乙腈-水混合溶液，溶质为9种真菌毒素和农药；所述陈皮基质匹配混合标准溶液的溶剂为陈皮基质空白提取液，溶质为9种真菌毒素和农药。本发明所述的混合标准溶液具有6个浓度梯度，其中，黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1的浓度分别为0.10ng/mL、0.20ng/mL、0.50ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL，对应的赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的浓度为5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL，对应的2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱的浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。

(二)实施例

实施例1：改性多壁碳纳米管的制备

称取50g多壁碳纳米管置于500mL的烧瓶中，加入50mL浓硫酸，超声30min，再向烧瓶中加入30mL浓硝酸，超声30min，静置，用吸管吸除上层混酸清液，然后加入1000mL超纯水进行稀释，将稀释液过0.22μm的聚四氟乙烯微孔滤膜过滤，将过滤液用水洗至滤液的pH值为7，所得黑色固体经真空烘箱50℃干燥即得被氧化的改性多壁碳纳米管。

图1为多壁碳纳米管氧化改性前后的透射电镜图，由图1可见，氧化改性后所得多壁碳纳米管分散均匀，有一定的长径比、长度分布均匀，说明本发明所采用的氧化改性多壁碳纳米管的方法效果好。图2为多壁碳纳米管氧化改性前后的红外光谱图，由图2可见，氧化改性后的多壁碳纳米管在3414cm^-1波数处出现较宽的吸收峰，该吸收峰是由羟基伸缩振动所引起的，在1704cm^-1处的吸收峰是羧基中的羰基伸缩振动引起的，说明经强酸氧化后多壁碳纳米管的表面产生了羟基和羧基活性官能基团。

实施例2：新会陈皮中真菌毒素和农药残留的检测

本实施例是基于改良的QuEChERS法与液相色谱-串联质谱技术测定新会陈皮中真菌毒素和农药残留量。本实施例具体方法步骤如下：

(1)称取粉碎的新会陈皮空白样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL体积比为80:20的乙腈-水混合溶液，振荡1min，再加入0.6g改性多壁碳纳米管，振荡1min，超声10min，5000r/min离心5min，吸取上层清液过0.22μm有机相滤膜，得到陈皮基质空白提取液。

(2)用步骤(1)中的陈皮基质空白提取液作为溶剂，配制6个浓度梯度的的真菌毒素和农药混合溶液，即陈皮基质匹配混合标准溶液；然后对陈皮基质匹配混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定，以定量离子色谱峰面积为纵坐标(y)，对应的质量浓度为横坐标(x)作陈皮基质匹配标准曲线；

(3)称取粉碎的新会陈皮2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL体积比为80:20的乙腈-水混合溶液，振荡1min，再加入0.6g改性多壁碳纳米管，振荡1min，超声10min，5000r/min离心5min，吸取上层清液过0.22μm有机相滤膜，得到样品净化液。

(4)将步骤(3)中所得的样品净化液进行液相色谱-串联质谱测定，得到样品净化液色谱峰面积，根据步骤(2)的陈皮基质匹配标准曲线，计算得到样品中2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的残留量。

其中，在进行液相色谱-串联质谱测定中，

所采用的色谱条件为：色谱柱：Shimadzu C18，规格为150mm×2.1mm×3.5μm；流速：0.20mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：含1％甲酸的5mmoL/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～2min，流动相A为90％，流动相B为10％；2～20min，流动相A为90％～20％，流动相B为10％～80％；20～26min，流动相A为90％，流动相B为10％。

所采用的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；碰撞气压力：60kPa；气帘气压力：250kPa；雾化气压力：550kPa；加热辅助气压力：550kPa。其他串联质谱参数见表1。其中，实施例2中新会陈皮样品的总离子流色谱图如图3所示。

表1 9种真菌毒素和农药的串联质谱检测参数

*:定量离子

(三)检测条件的筛选

1、提取液的选择

将目标化合物从样品中有效提取是多残留分析必须解决的首要问题。本发明以2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮作为提取的目标化合物，以加标回收率作为考察指标，在2g新会陈皮空白样品中添加浓度为5.0ng/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威，浓度为0.50ng/mL的黄曲霉毒素B1和浓度为25ng/mL的玉米赤霉烯酮的有机溶剂混合标准溶液，分别考察提取溶液乙腈-水体积比为100：0、90：10、80：20、70：30时的目标化合物的回收率，结果如图4所示。由图4结果可见，当乙腈-水混合溶液的体积比为80：20时提取效果最好。因此，本发明实施例中选用体积比为80：20的乙腈-水混合溶液作为提取液。

2、净化吸附剂的选择

新会陈皮基质复杂，为了消除杂质干扰，本发明以2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮作为提取的目标化合物，对改性多壁碳纳米管，未改性多壁碳纳米管，弗洛里、N-丙基乙二胺、硅胶5种吸附剂的净化作用进行了比较。在2g新会陈皮空白样品中添加浓度为5.0ng/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威，浓度为0.50ng/mL的黄曲霉毒素B1，浓度为25ng/mL的玉米赤霉烯酮的有机溶剂混合标准溶液，分别用改性多壁碳纳米管，未改性多壁碳纳米管，弗洛里、N-丙基乙二胺、硅胶进行净化，以2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的加标回收率作为考察指标。

实验表明，未改性多壁碳纳米管由于相互间强的比表面和范德华作用，并且由于表面缺少带羟基和羧基的官能基团，在有机溶剂和水溶液中的分散尤其差，在样品提取液中加入未改性多壁碳纳米管，未改性多壁碳纳米管团聚成致密的网络沉积在离心管底部，不能起到净化作用；弗洛里能有效地吸附极性化合物，但净化液呈浅黄色，N-丙基乙二胺能有效去除提取液中的有机酸、脂肪酸、糖类，但去除生物碱、色素、维生素、黄酮化合物等的作用不大，用弗洛里和N-丙基乙二胺作净化吸附剂，杂质对目标化合物的提取有干扰；硅胶对蛋白质、脂肪、维生素等杂质有较高的吸附能力，但也能牢固吸附目标化合物，对四种目标化合物的回收率低；而改性多壁碳纳米管可有效除去样品中的水溶性和脂溶性杂质，净化液无色，杂质对四种目标化合物检测无影响且回收率最高。此外，改性多壁碳纳米管能在广泛的pH值范围内保持稳定，保证了净化效果及方法的通用性。因此，本发明实施例采用改性多壁碳纳米管作为净化吸附剂。

此外，本发明还考察了改性多壁碳纳米管的用量对2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮四种目标化合物回收率的影响，其中改性多壁碳纳米管的用量分别为0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g，结果见图5。相对于其他杂质，四种目标化合物含π电子少，随着改性多壁碳纳米管用量增加，杂质与改性多壁碳纳米管能形成更强的π-π吸附而减少了对目标化合物的干扰，使得目标化合物回收率增大，当改性多壁碳纳米管用量为0.6g时回收率最高，继续增加改性多壁碳纳米管用量，目标化合物回收率没有明显变化。因此，本发明实施例选择改性多壁碳纳米管的最佳用量为0.6g。

3、质谱条件优化

首先用体积比为80:20的乙腈-水混合溶液配制2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的有机溶剂混合标准溶液，用蠕动泵以10μL/min的流速连续注射，在正离子模式下进行一级母离子全扫描，得到9种真菌毒素和农药的分子离子峰，优化去簇电压、雾化气、气帘气等参数。根据欧盟2002/657/EC《质谱分析方法鉴定点数》指令要求，在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子，打碎目标分子离子峰进行二级质谱扫描(子离子扫描)，采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，对碰撞能、碰撞室出口电压等参数进行优化，最终每种目标化合物分别选择1个定量离子外标法定量，2个定性离子和丰度比为定性依据，串联质谱检测参数见表1。

(四)实施例的试验结果

1、基质效应

基质效应指样品中被分析物以外的组分，对分析过程及结果准确性的影响和干扰。真菌毒素、农药在同一基质中具有不同的基质效应，同一真菌毒素、农药在不同基质中基质效应也不同，同时基质效应与浓度具有一定的关系，随着浓度增加，基质效应逐渐减弱。本发明对新会陈皮的基质效应进行了研究。

分别用体积比为80:20的乙腈-水混合溶液和陈皮基质空白提取液作为溶剂，配制6个浓度梯度的有机溶剂混合标准溶液和陈皮基质匹配混合标准溶液。在上述优化的色谱和质谱条件下，对两种混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定，分别绘制有机溶剂标准曲线和陈皮基质匹配标准曲线，采用陈皮基质匹配标准曲线斜率和有机溶剂标准曲线斜率之比(K)来评价基质效应：若K值介于0.9～1.1之间，基质效应不明显，K大于1.1时为基质增强效应，小于0.9则是基质抑制效应，结果如图6所示。由图6可见，新会陈皮作为基质，黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素B1表现为基质减弱效应，2,4-二氯苯氧乙酸和玉米赤霉烯酮表现为基质增强效应，其他三种目标化合物则无明显的基质效应。所以，为了提高定量分析的准确性，本发明采用陈皮基质匹配混合标准溶液校正方法进行定量分析和计算，对基质效应进行补偿。

2、线性范围和检出限

以陈皮基质空白提取液作为溶剂，配制6个浓度梯度的陈皮基质匹配混合标准溶液。在上述优化的色谱和质谱条件下，对上述陈皮基质匹配混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定，以定量离子仪器响应峰面积对各目标化合物质量浓度进行线性回归，对本发明所建立的方法的性能进行评价，9种真菌毒素和农药的线性范围、相关系数和检出限见表2，由表2可见目标化合物在各自线性范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9838～0.9982，满足测定的要求，以信噪比S/N＝3计算检出限(LOD)，9种目标化合物的检出限在0.18～10μg/kg之间。陈皮基质匹配混合标准溶液的总离子流图见图7。

表2 9种目标化合物的线性范围、相关系数、检出限、平均回收率及相对标准偏差(n＝6)

3、回收率和精密度

为了评价方法的适用性，在上述最优色谱和质谱条件下，取新会陈皮空白样品，按低、中、高三种浓度水平分别添加混合标准液，添加水平见表2，每个浓度水平重复测定6次，结果见表2。从表2得出，目标化合物的加标回收率为72.4％～106％，相对标准偏差(RSD)为2.2％～7.4％。方法的准确度高、稳定性好，满足痕量分析的要求。其中，新会陈皮空白样品添加浓度为0.20ng/mL的黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1，浓度为10ng/mL的赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮，浓度为2.0ng/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱的有机溶剂混合标准溶液的总离子流图如图8所示。

4、实际样品检测

在上述最优条件下将所建立的方法对日常送检新会陈皮进行检测，采用实验室空白、平行样和样品加标进行质量控制，其中6份样本测出含有2,4-二氯苯氧乙酸8.9～12μg/kg，3份样本含有赭曲霉毒素A26.8～95.5μg/kg，其余样品未检出真菌毒素和农药。

本发明采用陈皮基质匹配混合标准溶液校正方法进行定量分析和计算，对基质效应进行补偿，提高了定量分析的准确性；本发明以改性多壁碳纳米管作为净化吸附剂，将改良QuEChERS法与液相色谱-串联质谱技术结合应用于新会陈皮中真菌毒素和农药残留的同时检测。在各自线性范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9838～0.9982，检出限(S/N＝3)为0.18～9.7μg/kg，平均加标回收率为72.4％～106％，相对标准偏差(RSD)为2.2％～7.4％，本发明方法简便快速，准确度高，稳定性好，成本低，能够满足国内外标准的限量要求，应用于实际样品的检测，得到满意的结果，符合食品真菌毒素和农药残留分析从繁琐的传统方法向快速、简便的方法发展的趋势，具有一定的实际应用参考价值。

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种同时检测新会陈皮中真菌毒素和农药残留的方法，其特征在于：所述的真菌毒素包括黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮；所述的农药包括2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威和毒死蜱；

该方法包括以下步骤：

(1)改性多壁碳纳米管的制备：将多壁碳纳米管与浓硫酸混合进行超声处理，再加入浓硝酸，超声处理后静置，吸除上层混酸清液，然后利用超纯水稀释并过滤，将过滤液用水洗至滤液的pH值为7，所得黑色固体干燥后即得被氧化的改性多壁碳纳米管；

(2)制备陈皮基质空白提取液：在新会陈皮空白样品中加入提取液，进行振荡，然后加入改性多壁碳纳米管净化后再离心处理，吸取上层清液，得到陈皮基质空白提取液；

(3)制作陈皮基质匹配标准曲线：用步骤(2)中的陈皮基质空白提取液作为溶剂，配制真菌毒素和农药陈皮基质匹配混合标准溶液，所述的陈皮基质匹配混合标准溶液为6个浓度梯度的真菌毒素和农药混合溶液，其中黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1的浓度分别为0.10ng/mL、0.20ng/mL、0.50ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL，对应的赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的浓度为5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL，对应的2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱的浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，并对陈皮基质匹配混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定，以定量离子色谱峰面积为纵坐标，对应的质量浓度为横坐标作陈皮基质匹配标准曲线；

(4)样品处理：将新会陈皮样品粉碎，然后用提取液对样品中的真菌毒素和农药进行提取，并进行振荡处理，然后加入改性多壁碳纳米管，进行振荡、超声和离心处理，将上层清液过滤，得到样品净化液；

(5)样品检测：将步骤(4)中所得的样品净化液进行液相色谱-串联质谱测定，得到样品净化液的色谱峰面积，根据步骤(3)的陈皮基质匹配标准曲线，计算得到样品中真菌毒素和农药的残留量；

其中所述的提取液为体积比为80：20的乙腈-水混合溶液，所述改性多壁碳纳米管是表面带有羟基、羧基活性官能基团的多壁碳纳米管，其长度为100～200nm；

在步骤(3)和(5)的液相色谱-串联质谱测定中，所采用的色谱条件为：色谱柱：Shimadzu C18，规格为150mm×2.1mm×3.5μm；流速：0.20mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：含1％甲酸的5mmoL/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～2min，流动相A为90％，流动相B为10％；2～20min，流动相A为90％～20％，流动相B为10％～80％；20～26min，流动相A为90％，流动相B为10％；所采用的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；碰撞气压力：60kPa；气帘气压力：250kPa；雾化气压力：550kPa；加热辅助气压力：550kPa。

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