CN114019042B - 基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法及装置,测定方法为：样品提取物制备、G/KCC‑1复合材料制备、G/KCC‑1PT‑SPE、UPLC‑MS/MS分析、数据统计分析；测定装置为：包括液相色谱‑质谱联用仪和色谱柱固定支架。本发明提供基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法，能高选择性、灵敏、准确的分离并定量测定黄颡鱼中蛋白酶抑制剂，而且G/KCC‑1具有吸附剂用量少、有机溶剂用量少、操作简便、吸附容量大、重现性好的优点，是分离富集复杂样品中蛋白酶抑制剂的有效吸附剂，采用本发明进行检测所需的样品量及消耗量均显著低于现有的方法，更有助于对鱼类或鱼制品中蛋白酶抑制剂进行食品质量监测，确保食品的安全。

Description

基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法及装置
技术领域
本发明涉及黄颡鱼成分检测领域，特别是基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法及装置。
背景技术
黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)属于水飞蓟形目中的蓝鲶科，是一种商业上重要的水产养殖鱼类，深受亚洲消费者的喜爱。在中国，黄颡鱼养殖已成为一个新兴产业，2018年的年产量为48万吨，由于其优良的肉质感官品质和丰富的营养，黄鲶养殖呈持续增长趋势。据报道，黄颡鱼含有丰富的粗蛋白质、矿物质元素、多不饱和脂肪、维生素E，必需氨基酸比例较高。然而，国内外市场需求的增加促使黄鲶在密集条件下养殖(约3000kg/667m2)。由于传染病的危害日益严重，养殖黄颡鱼的经济损失巨大。
沙奎那韦、利托那韦和茚地那韦是有效的选择性蛋白酶抑制剂，通常用作抗病毒药物。蛋白酶抑制剂的工作原理是，如果病毒侵入易感宿主细胞，凭借宿主细胞的酶系统、原料和能量复制其核酸，并在宿主细胞核糖体的帮助下翻译病毒的蛋白质，它就能独立生存。这些药物可以与蛋白酶分子活性中心上的化学基团结合，使蛋白酶活性下降甚至失活，达到抵抗病毒的作用。
早在2005年，国家农业部就已经禁止在动物养殖中使用人类抗病毒药物。然而，许多非法企业仍然将其用于农业和水产养殖业的感染预防和疾病治疗，以缩短养殖周期，迅速获得经济效益。长期大量使用这些药物会导致动物中毒，诱发病毒株的变异，严重威胁人类健康。因此，建立一种高效的蛋白酶抑制剂的检测方法是非常重要和迫切的。
准确有效地定量蛋白酶抑制剂仍然是一个挑战，并已引起科学家们对开发检测此类化合物的新技术的兴趣。例如，有人基于液相色谱分析和双紫外检测(Poirier、Robidou和Jaillon，2002)开发了一种选择性和灵敏的同时检测蛋白酶抑制剂的方法(洛比那韦、利托那韦、萨奎那韦、奈非那韦、安普瑞那韦和印地那韦)。有人提出了一种定量分析方法，使用选定的反应监测定量模式和交叉验证，通过基质辅助激光解吸/电离检测人血浆中的沙奎那韦(Wagner、Varesio和Hopfgartner，2008)。有人通过反向酶谱法在三(羟甲基)氨基甲烷三联碱缓冲系统中检测蛋白酶抑制剂(Le&Katunuma，2004)。
然而，现有的这些检测方法仍然不够灵敏，无法检测复杂样品中低水平的蛋白酶抑制剂及其含量，不能满足日常监测的需要，从而无法确保食品安全。
发明内容
本发明的目的在于，提供基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法及装置。本发明具有能检测足够灵敏，能检测复杂样品中低水平的蛋白酶抑制剂及其含量，能满足日常监测需求最终确保食品安全的优点。
本发明的技术方案：基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法，包括如下流程：
A、样品提取物制备：蒸馏水清洗黄颡鱼可食用部分后用高速匀浆器以6000g的浓度均质，最后以改良的QuEChERS方法提取上清液作为样品提取物；
B、KCC-1制备：以改良法制备KCC-1；
C、氧化石墨(GO)制备：采用改进的Hummer发制备GO；
D、石墨烯/KCC-1(G/KCC-1)复合材料制备：采用水蒸气诱导内水解法制备G/KCC-1复合材料；
E、G/KCC-1PT-SPE；
F、UPLC-MS/MS分析；
G、数据统计分析：使用单因素方差分析(ANOVA)对经UPLC-MS/MS分析获得的数据进行分析并与相应标准相匹配，得出黄颡鱼中蛋白酶抑制剂的种类及含量。
前述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法中，步骤A所述的样品提取物制备，其具体步骤如下：
从黄颡鱼中取得可食用的鱼肉然后用蒸馏水洗净；用高速匀浆器Ultra Turrax(T25，德国伊卡-沃卡)以6000g的浓度进行均质；取5g鱼肉匀浆放入50mL离心管中，加入乙腈/水/乙酸(9:1:0.1，v/v/v，25mL)和中性氧化铝(500mg)溶液混合得混合物；将混合物剧烈震动10分钟后在4℃下9000g离心10分钟；提取离心后的上清液得样品提取物。
前述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法中，步骤B所述的KCC-1制备，其具体步骤如下：
B1、将尿素(0.60g)和CPB(1.10g)完全溶解在水(30mL)中；
B2、添加环己烷(30mL)和2-丙醇(0.94mL)；
B3、逐滴添加正硅酸乙酯(3mL)，得B2混合物；
B4、在70℃下搅拌B2混合物20小时，得B3溶液；
B5、将B3溶液在8000g下离心10分钟；
B6、依次用丙酮、去离子水和无水乙醇进行洗涤；
B7、真空下干燥12小时后在500℃下煅烧4小时获得KCC-1。
前述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法中，步骤C所述的氧化石墨(GO)制备，其具体步骤如下：
C1、取石墨片(3.0g)与高锰酸钾(18.0g)混合，并添加浓H2SO4/H3PO4(9:1，v/v，400mL)，冷却至室温，得C1混合物；
C2、将C1混合物倒入冰上并用H2O2(30％，5mL)淬火，得C2混合物；
C3、将C2混合物在8000g下离心30分钟并取其固体残留物，得C3残留物；
C4、将C3残留物在去离子水中透析除盐，最后冻干过夜得GO。
前述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法中，步骤D所述的石墨烯/KCC-1(G/KCC-1)复合材料制备，其具体步骤如下：
D1、将GO分散在水中并进行超声处理，得GO均匀分散体溶液；
D2、在GO均匀分散体溶液中以1:1(w/w)的质量比添加KCC-1，的D2混合物；
D3、将D2混合物在120℃下剧烈搅拌2小时，得D3品；
D4、用乙醇水溶液(50％，v/v)洗涤D3品，得G/KCC-1复合材料。
前述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法中，步骤E所述的G/KCC-1PT-SPE，其具体步骤如下：
E1、使用10％甲醇激活并调节G/KCC-1尖端；
E2、将样品提取物吸入G/KCC-1尖端并分配回样品管中；
E3、重复执行E2不少于20次；
E4、使用1％乙酸(3mL)和水甲醇(2％，3mL)清洗G/KCC-1尖端；
E5、在G/KCC-1针尖上喷洒1mL5％氢氧化铵(25％)并在ACN(乙腈)中循环执行10次，得E5洗脱液；
E6、将E5洗脱液通过0.22μm膜过滤器过滤，得待分析样品。
前述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法中，步骤F所述的UPLC-MS/MS分析，其具体步骤如下：
在Halo-fused core C18柱(100mm×2.1mm，2.7μm粒径)使用流动相A(乙腈)和B(0.1％甲酸/水)以0.6mL·min–1的流速冲洗；采用梯度洗脱模式，起始为5％A，5％A–100％A(8min)，100％A(9min)和5％A(10min)；进样量为2μL，总运行时间为12min；柱温和样品盒分别设置为30℃和4℃；
UPLC的洗脱液通过负离子模式下的电喷雾电离(ESI)离子源直接引入质谱仪；用氮气作气体动力，帘式气体压力为30磅/平方英寸、GS1为40磅/平方英寸和GS2为40磅/平方英寸；电压参数具体为，分散电位(DP)和入口电位(EP)，其值分别为-60eV和-10eV。
基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定装置，包括用于UPLC-MS/MS分析的液相色谱-质谱联用仪和相对应用于放置色谱柱的固定支架；所述固定支架包括底座、设于底座左端上方的主立柱、可滑动套设于主立柱上的第一调节支座和第二调节支座；所述第一调节支座和第二调节支座的一侧均设有水平设置用于固定色谱柱的固定圈，每个所述固定圈均通过水平伸缩调节支柱与相对应的第一调节支座或第二调节支座相连；每个所述固定圈内设有可收缩调节的卡套；所述水平伸缩调节支柱上设有防尘单元；所述防尘单元包括设于位于上方的水平伸缩调节支柱上的上固定座、设于位于下方的水平伸缩调节支柱上的下固定座、呈L型设有上固定座上的支撑架、呈L型设于下固定座下方的安装架和收卷设于支撑架上的透明防尘罩；所述支撑架、安装架和固定圈在垂直线上相对应设置；所述底座上方远离主立柱处设有水平滑槽，所述水平滑槽上设有可滑动用于安装集液器的安装台；所述底座的底部均匀设有多个缓冲垫；所述安装台设有能实现是否可滑动切换的卡扣单元；所述主立柱底部设有与底座转动连接的调节盘。
前述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定装置中，相邻所述水平伸缩调节支柱之间设有加固调节单元，所述水平调节伸缩支柱包括第一调节支座或第二调节支座相连的伸缩套管和可伸缩设于伸缩套管内的伸缩杆；所述加固调节单元包括两根竖直设置的竖直伸缩加强杆、两根水平设置并连接竖直伸缩加强杆的水平伸缩加强杆和设于水平伸缩杆之间的辅助伸缩加强杆。
前述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定装置中，所述主立柱上设有导槽，所述第一调节支座和第二调节支座设有与导槽相对应的滑动导条；所述第一调节支座和第二调节支座远离固定圈一侧设有调节旋钮；所述主立柱与防尘单元之间通过支撑单元相连；所述支撑单元包括转动设于主立柱一侧的一号调节杆、转动设于下固定座下方的二号调节杆和分别连接二号调节杆与主立柱的三号伸缩调节杆；所述一号调节杆与二号调节杆转动连接；所述一号调节杆、二号调节杆和三号伸缩调节杆均通过转动连接块与各自相对应的主立柱或下固定座转动连接。
前述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定装置中，所述透明防尘罩包括位于支撑架上的收卷部、位于支撑架下方带魔术贴的拉伸部、与水平伸缩调节支柱相对应的带魔术贴的贴合部和位于顶部的盖板；所述安装架顶部设有与拉伸部相对应的魔术贴。
与现有技术相比，本发明通过提供基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法，其中包括合成新型的PT-SPE吸附剂G/KCC-1的方法及基于该G/KCC-1检测黄颡鱼中蛋白酶抑制剂的检测方法，能高选择性、灵敏、准确的分离并定量测定黄颡鱼中蛋白酶抑制剂(利托那韦、萨奎那韦和印地那韦)，而且G/KCC-1具有吸附剂用量少、有机溶剂用量少、操作简便、吸附容量大、重现性好的优点，是分离富集复杂样品中蛋白酶抑制剂的有效吸附剂，采用本发明进行检测所需的样品量及消耗量均显著低于现有的方法，更有助于对鱼类或鱼制品中蛋白酶抑制剂进行食品质量监测，确保食品的安全；
本发明提供的测定装置，固定圈对色谱柱进行固定，通过第一调节支座和第二调节支座等的相互配合，能上下调节固定圈的位置，满足对不同规格固定圈的固定，还设置了可上下拉伸并固定的防尘单元，通过防尘单元来防止色谱柱在固定时收到污染影响实验，最后还在底座上设置用于放置集液器的安装台，方便对色谱柱中液体的收集，防止其直接滴落污染装置。
所以，本发明具有能检测足够灵敏，能检测复杂样品中低水平的蛋白酶抑制剂及其含量，能满足日常监测需求最终确保食品安全的优点。
进一步的，本发明的测定装置，还通过加设加固调节单元，提高固定圈、第一调节支座、第二调节支座和水平调节伸缩支柱的稳定性，装置更为稳固；
通过设置包括一号调节杆、二号调节杆和三号伸缩调节杆的支撑单元，对防尘单元进行支撑，进一步提高装置的稳固性。
附图说明
图1是本发明测定方法的流程图；
图2是本发明检测装置的结构示意图；
图3是本发明检测装置(透明防尘罩使用时)的结构示意图；
图4是本发明实施例实验中KCC-1在SEM下的表征图；
图5是本发明实施例实验中pH值对萃取效率影响的线形图；
图6是本发明实施例实验中抽吸/分配提取循环对萃取效率影响的线形图；
图7是本发明实施例实验中解吸溶剂对萃取效率影响的柱形图；
图8是本发明实施例实验中氯化钠溶度对萃取效率影响的线形图。
附图中的标记为：1-底座，11-水平滑槽，12-安装台，13-缓冲垫，2-主立柱，21-调节盘，31-第一调节支座，32-第二调节支座，33-调节旋钮，4-固定圈，41-伸缩套管，42-伸缩杆，5-上固定座，51-下固定座，52-支撑架，53-安装架，6-透明防尘罩，61-收卷部，71-竖直伸缩加强杆，72-水平伸缩加强杆，73-辅助伸缩加强杆，81-一号调节杆，82-二号调节杆，83-三号伸缩调节杆，9-连接块。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例。基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法，如图1所示，包括如下流程：
A、样品提取物制备：蒸馏水清洗黄颡鱼可食用部分后用高速匀浆器以6000g的浓度均质，最后以改良的QuEChERS方法提取上清液作为样品提取物；
B、KCC-1制备：以改良法制备KCC-1；
C、氧化石墨(GO)制备：采用改进的Hummer发制备GO；
D、石墨烯/KCC-1(G/KCC-1)复合材料制备：采用水蒸气诱导内水解法制备G/KCC-1复合材料；
E、G/KCC-1PT-SPE；
F、UPLC-MS/MS分析；
G、数据统计分析：使用单因素方差分析(ANOVA)对经UPLC-MS/MS分析获得的数据进行分析并与相应标准相匹配，得出黄颡鱼中蛋白酶抑制剂的种类及含量。
步骤A所述的样品提取物制备，其具体步骤如下：
从黄颡鱼中取得可食用的鱼肉然后用蒸馏水洗净；用高速匀浆器Ultra Turrax(T25，德国伊卡-沃卡)以6000g的浓度进行均质；取5g鱼肉匀浆放入50mL离心管中，加入乙腈/水/乙酸(9:1:0.1，v/v/v，25mL)和中性氧化铝(500mg)溶液混合得混合物；将混合物剧烈震动10分钟后在4℃下9000g离心10分钟；提取离心后的上清液得样品提取物。
步骤B所述的KCC-1制备，其具体步骤如下：
B1、将尿素(0.60g)和CPB(1.10g)完全溶解在水(30mL)中；
B2、添加环己烷(30mL)和2-丙醇(0.94mL)；
B3、逐滴添加正硅酸乙酯(3mL)，得B2混合物；
B4、在70℃下搅拌B2混合物20小时，得B3溶液；
B5、将B3溶液在8000g下离心10分钟；
B6、依次用丙酮、去离子水和无水乙醇进行洗涤；
B7、真空下干燥12小时后在500℃下煅烧4小时获得KCC-1。
步骤C所述的GO制备，其具体步骤如下：
C1、取石墨片(3.0g)与高锰酸钾(18.0g)混合，并添加浓H2SO4/H3PO4(9:1，v/v，400mL)，冷却至室温，得C1混合物；
C2、将C1混合物倒入冰上并用H2O2(30％，5mL)淬火，得C2混合物；
C3、将C2混合物在8000g下离心30分钟并取其固体残留物，得C3残留物；
C4、将C3残留物在去离子水中透析除盐，最后冻干过夜得GO。
步骤D所述的G/KCC-1复合材料制备，其具体步骤如下：
D1、将GO分散在水中并进行超声处理，得GO均匀分散体溶液；
D2、在GO均匀分散体溶液中以1:1(w/w)的质量比添加KCC-1，的D2混合物；
D3、将D2混合物在120℃下剧烈搅拌2小时，得D3品；
D4、用乙醇水溶液(50％，v/v)洗涤D3品，得G/KCC-1复合材料。
步骤E所述的G/KCC-1PT-SPE，其具体步骤如下：
E1、使用10％甲醇激活并调节G/KCC-1尖端；
E2、将样品提取物吸入G/KCC-1尖端并分配回样品管中；
E3、重复执行E2不少于20次；
E4、使用1％乙酸(3mL)和水甲醇(2％，3mL)清洗G/KCC-1尖端；
E5、在G/KCC-1针尖上喷洒1mL5％氢氧化铵(25％)并在ACN(乙腈)中循环执行10次，得E5洗脱液；
E6、将E5洗脱液通过0.22μm膜过滤器过滤，得待分析样品。
步骤F所述的UPLC-MS/MS分析，其具体步骤如下：
UPLC实验在Waters Acquity UPLC系统上进行；在Halo-fused core C18柱(100mm×2.1mm，2.7μm粒径)使用流动相A(乙腈)和B(0.1％甲酸/水)以0.6mL·min–1的流速冲洗；采用梯度洗脱模式，起始为5％A，5％A–100％A(8min)，100％A(9min)和5％A(10min)；进样量为2μL，总运行时间为12min；柱温和样品盒分别设置为30℃和4℃；
UPLC的洗脱液通过负离子模式下的电喷雾电离(ESI)离子源直接引入质谱仪(4000QTRAP)；用氮气作气体动力，帘式气体压力为30磅/平方英寸、GS1为40磅/平方英寸和GS2为40磅/平方英寸；电压参数具体为，分散电位(DP)和入口电位(EP)，其值分别为-60eV和-10eV。
基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定装置，如图2-3所示，包括用于UPLC-MS/MS分析的液相色谱-质谱联用仪和相对应用于放置色谱柱的固定支架；所述固定支架包括底座1、设于底座1左端上方的主立柱2、可滑动套设于主立柱2上的第一调节支座31和第二调节支座32；所述第一调节支座31和第二调节支座32的一侧均设有水平设置用于固定色谱柱的固定圈4，每个所述固定圈4均通过水平伸缩调节支柱与相对应的第一调节支座31或第二调节支座32相连；每个所述固定圈4内设有可收缩调节的卡套；所述水平伸缩调节支柱上设有防尘单元；所述防尘单元包括设于位于上方的水平伸缩调节支柱上的上固定座5、设于位于下方的水平伸缩调节支柱上的下固定座51、呈L型设有上固定座5上的支撑架52、呈L型设于下固定座5下方的安装架53和收卷设于支撑架52上的透明防尘罩6；所述支撑架52、安装架53和固定圈4在垂直线上相对应设置；所述底座1上方远离主立柱2处设有水平滑槽11，所述水平滑槽11上设有可滑动用于安装集液器的安装台12；所述底座1的底部均匀设有多个缓冲垫13；所述安装台12设有能实现是否可滑动切换的卡扣单元；所述主立柱2底部设有与底座1转动连接的调节盘21。
相邻所述水平伸缩调节支柱之间设有加固调节单元，所述水平调节伸缩支柱包括第一调节支座31或第二调节支座32相连的伸缩套管41和可伸缩设于伸缩套管41内的伸缩杆42；所述加固调节单元包括两根竖直设置的竖直伸缩加强杆71、两根水平设置并连接竖直伸缩加强杆71的水平伸缩加强杆72和设于水平伸缩杆72之间的辅助伸缩加强杆73。
所述主立柱2上设有导槽，所述第一调节支座31和第二调节支座32设有与导槽相对应的滑动导条；所述第一调节支座31和第二调节支座32远离固定圈4一侧设有调节旋钮33；所述主立柱2与防尘单元之间通过支撑单元相连；所述支撑单元包括转动设于主立柱2一侧的一号调节杆81、转动设于下固定座51下方的二号调节杆82和分别连接二号调节杆82与主立柱2的三号伸缩调节杆83；所述一号调节杆81与二号调节杆82转动连接；所述一号调节杆81、二号调节杆82和三号伸缩调节杆83均通过转动连接块9与各自相对应的主立柱2或下固定座51转动连接。
所述透明防尘罩6包括位于支撑架52上的收卷部61、位于支撑架52下方带魔术贴的拉伸部、与水平伸缩调节支柱相对应的带魔术贴的贴合部和位于顶部的盖板；所述安装架53顶部设有与拉伸部相对应的魔术贴。
基于本发明的实验例如下：
实验方法：取黄颡鱼采用本发明进行检测。
实验结果及分析：
1、G/KCC-1的表征
研究了氧化石墨、KCC-1和G/KCC-1的形貌和结构。KCC-1通过扫描电子显微镜(SEM)进行表征，其图像如图4所示。介孔KCC-1纳米颗粒的外径约为500nm。观察到其具有中心径向纳米皱纹的褶皱结构，这显著扩大了表面积，并增加了吸收目标蛋白酶抑制剂的能力。
2、G/KCC-1PT-SPE条件的影响
为了通过移液管尖端微萃取法获得蛋白酶抑制剂的最佳萃取效率，研究了最有影响的参数，包括pH值、萃取和解吸的抽吸/分配循环次数以及洗脱溶剂类型；采用UHPLC-MS的最大响应来评价不同萃取参数下的萃取效率；每项分析进行三次，具体内容如下：
2.1、pH值
样品溶液的pH值对于分析物的提取至关重要，因为它会影响化合物的分子形式和吸附剂的表面电荷，从而影响三种蛋白酶抑制剂的回收；当pH值小于pKa时，G/KCC-1将促进分析物的吸附，在此条件下，分析物主要以质子化形式存在；
对pH值在3-8范围内对萃取效率的影响进行了研究，分析物的pKa(沙奎那韦:pKa11.05；利托那韦：pKa 11.47；印地那韦：pKa 3.8)；
如图5所示，当pH为4.0时，蛋白酶抑制剂的最高回收率为83.1％-86.3％，在此条件下，蛋白酶抑制剂以阳离子形式存在，其可能的吸附机制为静电作用、氢相互作用、带正电的分析物与带负电的G/KCC-1之间的π-π相互作用；
随着pH值的增加，印地那韦的电流形式从中间形式转变为阴离子形式，其回收率急剧下降；由于印地那韦与带负电的G/KCC-1之间存在静电排斥作用，印地那韦的阴离子形式无法有效吸附在G/KCC-1上；
因此，样品溶液的pH值为4.0最佳。
2.2、抽吸/分配提取循环
萃取和解吸的吸气/分配循环次数在G/KCC-1PT-SPE过程中起着关键作用；实验结果表明，随着萃取次数的增加，萃取效率逐渐提高；当达到25个吸气/分配循环时，三种蛋白酶抑制剂的信号响应没有明显变化，可认为其达到平衡；为了找出从G/KCC-1中洗脱分析物的最小解吸循环次数，通过将抽吸/分配循环次数从1次调整到20次进行研究；
如图6显示，当脱附循环次数超过10次时，蛋白酶抑制剂的响应不再提高；
因此，优化的提取和解吸周期分别为25和10为最佳。
2.3、解吸溶剂
选择合适的解吸溶剂从吸附剂中洗脱分析物，从而能获得满意的分析物回收率。比较具有不同体积比的不同极性溶剂来获取最佳解吸溶剂，其中包括乙腈、甲醇、去离子水、甲醇/氨(95:5，v/v)和甲醇/乙酸(95:5，v/v)；
如图7中的结果表明，当使用甲醇/氨(95:5，v/v)时，由于其在甲醇中的高溶解度，氢键可以被氨破坏，从而实现最大萃取回收率。因此，三种蛋白酶抑制剂和吸附剂之间的吸附减弱。碱性介质有利于分析物的电离，导致捕获的分析物和吸附剂。
因此，甲醇/氨(95:5，v/v)是最佳的洗脱溶剂。
进一步的，在0-0.1mol·L–1浓度范围内，以氯化钠为模型电解质，研究了离子强度的影响。
如图8所示，离子强度的增加会降低分析物的溶解度。随着氯化钠浓度从0增加到0.02mol·L–1，蛋白酶抑制剂的回收率从79.0％提高，其中最大萃取回收率在0.02mol·L–1时达到。
高浓度的盐可能会对结果产生负面影响，因为盐会沉积在材料表面，防止目标物吸附。此外，高于0.02mol·L–1的氯化钠浓度会提高样品粘度，从而减少分析物转移到G/KCC-1。
因此，选择0.02mol·L–1的氯化钠浓度为最佳。
3、与商用吸附剂的比较
采用加标回收实验评估G/KCC-1和七种商用吸附剂(C18、HLB和SCX)对鱼类样品中三种蛋白酶抑制剂的提取效率。结果表明，G/KCC-1对蛋白酶抑制剂的回收率(83.1％-86.3％)高于市售吸附剂(P<0.05)。
此外，C18回收了分析物(80.9％-85.2％)，表明与分析物的非极性相互作用具有重要作用。HLB可提取81.6％以上的分析物，证明吸附剂的氢键和亲水性对三种蛋白酶抑制剂的吸附有显著贡献。SCX的回收能力相对较低(<78.2％)，以π-π键为主，但不是分析物与吸附剂之间的主要作用力。这可能是由于吸附剂表面的羟基、氨基和亚氨基在空间上阻碍了π-π键的形成。
综上所述，G/KCC-1与分析物发生多重吸附作用，表明三种蛋白酶抑制剂具有极好的恢复能力。
4、UPLC-MS/MS条件
制备浓度为1.0μg·mL–1的萨奎那韦、利托那韦和印地那韦标准混合物，并直接注入质谱仪以优化MS条件。在正离子模式下，四种蛋白酶抑制剂专一质子化为[M+H]+。这些药物的母体离子很容易获得，它们是m/z 671.5(萨奎那韦)、m/z 721.6(利托那韦)和z/m614.7(印地那韦)。
为了在MRM模式下确定药物，遵循欧盟第2002/657/EC号决定，该决定规定至少应获得四个识别点(前体离子1分，两种产品离子1.5分)。因此，母体离子进一步碎片化，以MS/MS模式获得其产物离子。可以很容易地观察到，每种药物的MS2分布很容易受到去聚势(DP)和碰撞能(CE)条件的影响。通过分别从20-120eV和0-80eV调节DP和CE，分别研究蛋白酶抑制剂的片段。选择两种最重要的产物离子进行药物的定量和定性。例如，m/z 671.5>570.6和m/z 671.5>416.4的转换分别用于测定和确认萨奎那韦。
随后，进一步优化并总结了雾化气体压力、幕气压力等MS条件，如下表1所示：
The retention behavior and MS parameters of ritonavir,saquinavir,andindinavir.
Figure BDA0003327565080000151
色谱条件对蛋白酶抑制剂的保留行为至关重要，包括流动相、色谱柱和添加剂。首先，对色谱吸附剂分离目标化合物的性能进行了研究和比较。使用了三种类型的色谱柱，包括Luna C18(150×4.6mm，3μm)、Altima C8(150×4.6mm，3μm)和Cosmosil HILIC(150×4.6mm，3μm)，其中C18色谱柱广泛用于各种研究。在Luna C18(150×4.6mm，3μm)柱上可以很好地分离目标蛋白酶抑制剂，但利托那韦除外，利托那韦表现出明显的拖尾效应。当使用C18柱时，利托那韦的峰对称性很容易受到影响。HILIC是正相液相色谱法的一种变体，适用于亲水性固定相和RP型流动相。HILIC通常用于分离亲水性化合物，如磷脂、糖肽、极性药物等。尽管利托那韦的峰值形状有所改善，但HILIC的整体性能却越来越差。此外，四种蛋白酶抑制剂在洗脱时的流动相中缓冲盐含量较高，因此其信号强度受到抑制。测试了AlltimaC8(150×4.6mm，3μm)柱，在该柱上，四种蛋白酶抑制剂分离良好，具有尖锐对称的峰和信号响应。
5、方法验证
5.1、特异性
通过比较沙奎那韦、利托那韦和印地那韦标准物质与空白样品之间的色谱曲线和保留时间，验证了建立的G/KCC-1/PT-SPE UHPLC-MS/MS方法的特异性。目标蛋白酶抑制剂可以很好地分离，在其附近没有遇到干扰峰，表明所提出的G/KCC-1/PT-SPE UHPLC-MS/MS方法具有良好的选择性。
5.2、线性度
使用线性回归模型评估方法的线性。在一系列浓度梯度中测试每种蛋白酶抑制剂的校准曲线，并使用峰面积(y)与分析物浓度(x，ng·mL–1)绘制其校准曲线，加权因子为1/x。结果如下表2，The method performance in terms of linearity,sensitivity,precision and recovery of G/KCC-1/PT-SPE UHPLC-MS/MS for ritonavir,saquinavir,and indinavir.
Figure BDA0003327565080000161
Figure BDA0003327565080000171
由此可见，对于每种蛋白酶抑制剂，模型在LOQ-1000μg·mL-1的浓度范围内呈线性，R2为0.9993-0.9996，这表明G/KCC-1/PT-SPE UHPLC-MS/MS方法具有良好的线性。
5.3、灵敏度
LOD和LOQ是敏感度的两个指标，分别代表可以自信地确定(3倍S/N)和量化(10倍S/N)的最低浓度。方法采用LOD法，相应的定量限为≤0.8ng·mL–1，结果表明，G/KCC-1/PT-SPE-UHPLC-MS/MS方法具有足够的灵敏度，可用于黄鲶蛋白酶抑制剂的筛选和定量。
5.4、精度
方法精密度通过计算三个峰值水平的RSD以日内和日间精密度表示。前者是通过使用相同的仪器、化学品和操作计算三次加标溶液的复制品获得的，而后者是在相同条件下连续五天进行研究的。如上表2所示，该方法显示出良好的日内精密度，SD在0.11-0.31范围内，日间精密度的RSD为≤6.23％。
结果表明，G/KCC-1/PT-SPE-UHPLC-MS/MS法检测蛋白酶抑制剂的精密度是准确的。
5.5、恢复
回收率试验是通过比较在三个浓度水平下加入真实样品的参考物质的试验结果与在相同水平下空白溶液中制备的参考物质(代表100％回收率)的试验结果来进行的。如上表2表明，该G/KCC-1/PT-SPE UHPLC-MS/MS方法对沙奎那韦、利托那韦和印地那韦的回收率为73.2％-86.3％(RSD 3.25％-5.21％)。
实验结论：
本发明合成了一种新型的PT-SPE吸附剂G/KCC-1，用于滥用蛋白酶抑制剂的SPE。建立了一种高选择性、灵敏、准确的G/KCC-1/PT-SPE-UHPLC-MS/MS方法，用于同时分离和定量测定黄颡鱼中的利托那韦、萨奎那韦和印地那韦。G/KCC-1具有吸附剂用量少、有机溶剂用量少、操作简便、吸附容量大、重现性好等优点，是分离富集复杂黄颡鱼样品中蛋白酶抑制剂的一种潜在吸附剂。在样品溶液pH、提取和解吸的抽吸/分配循环、洗脱溶剂和盐添加剂的优化条件下，利托那韦、萨奎那韦和茚地那韦被完全分离，具有对称和尖锐的峰。在MRM模式下，通过UHPLC-MS/MS对这些药物进行定量和定性分析。由于有机溶剂消耗量显著减少，建议的G/KCC-1/PT-SPE UHPLC-MS/MS是一种环境友好的方法。
本发明实验表面，该方法有助于对鱼类和鱼制品中蛋白酶抑制剂进行食品质量监测，以确保食品安全。

Claims (2)

1.基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法，其特征在于,包括如下流程：
A、样品提取物制备：从黄颡鱼中取得可食用的鱼肉然后用蒸馏水洗净；用高速匀浆器Ultra Turrax以6000g的离心力进行均质；取5g鱼肉匀浆放入50mL离心管中，加入25ml乙腈、水、乙酸混合液和500mg中性氧化铝，混合得混合物；将混合物剧烈震动10分钟后在4℃下9000g离心10分钟；提取离心后的上清液得样品提取物；高速匀浆器Ultra Turrax采用德国伊卡-沃卡的T25；乙腈、水、乙酸混合液中各成分体积比乙腈：水：乙酸为9:1:0.1；
B、KCC-1制备：将0.6g尿素和1.1gCPB完全溶解在30ml的水中；添加30mL环己烷和0.94mL2-丙醇；逐滴添加共3mL的正硅酸乙酯，得B2混合物；在70℃下搅拌B2混合物20小时，得B3溶液；将B3溶液在8000g下离心10分钟；依次用丙酮、去离子水和无水乙醇进行洗涤；真空下干燥12小时后在500℃下煅烧4小时获得KCC-1；
C、氧化石墨制备：取3.0g石墨片与18.0g高锰酸钾混合，并添加400ml浓H2SO4、H3PO4混合液，冷却至室温，得C1混合物，浓H2SO4、H3PO4混合液中各成分体积比H2SO4：H3PO4为9:1；将C1混合物倒入冰上并用5mL 30％的H2O2淬火，得C2混合物；将C2混合物在8000g下离心30分钟并取其固体残留物，得C3残留物；将C3残留物在去离子水中透析除盐，最后冻干过夜得氧化石墨；
D、G/KCC-1复合材料制备：将氧化石墨分散在水中并进行超声处理，得氧化石墨均匀分散体溶液；在氧化石墨均匀分散体溶液中以1:1的质量比添加KCC-1，得D2混合物；将D2混合物在120℃下剧烈搅拌2小时，得D3品；用50％体积浓度的乙醇水溶液洗涤D3品，得G/KCC-1复合材料；G/KCC-1复合材料即为石墨烯/KCC-1复合材料；
E、G/KCC-1PT-SPE：使用10％甲醇激活并调节G/KCC-1尖端；将样品提取物吸入G/KCC-1尖端并分配回样品管中至少20次重复循环；使用3ml的1％乙酸和3mL的2％水甲醇清洗G/KCC-1尖端；在G/KCC-1针尖上喷洒1mL5％氢氧化铵并在乙腈中循环执行10次，得洗脱液；将洗脱液通过0.22μm膜过滤器过滤，得待分析样品；
F、UPLC-MS/MS分析；
G、数据统计分析：使用单因素方差分析对经UPLC-MS/MS分析获得的数据进行分析并与相应标准相匹配，得出黄颡鱼中蛋白酶抑制剂的种类及含量。
2.根据权利要求1所述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法，其特征在于，步骤F所述的UPLC-MS/MS分析，其具体步骤如下：
在Halo-fused core C18柱使用流动相A和B以0.6mL·min–1的流速冲洗；采用梯度洗脱模式，起始为5％A，5％A–100％A 8min，100％A 9min和5％A 10min；进样量为2μL，总运行时间为12min；柱温和样品盒分别设置为30℃和4℃；
Halo-fused core C18柱规格为100mm×2.1mm，2.7μm粒径；
流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的甲酸水溶液；
UPLC的洗脱液通过负离子模式下的电喷雾电离离子源直接引入质谱仪；用氮气作气体动力，帘式气体压力为30磅/平方英寸、GS1为40磅/平方英寸和GS2为40磅/平方英寸；电压参数具体为，分散电位和入口电位，其值分别为-60eV和-10eV。
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