CN109521135B - 一种固相萃取结合uplc-ms/ms快速测定板栗中14种毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固相萃取结合UPLC‑MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法。该方法将乙腈/水/甲酸溶液与板栗样品混合，离心后上清液中加入无水硫酸镁、氯化钠、C18粉和柠檬酸钠混匀后进行二次离心，上清液过滤后采用UPLC‑MS/MS对T‑2毒素、青霉酸、伏马毒素B1、B2、B3、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3‑乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15‑乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮这14种毒素进行检测。该方法回收率高、灵敏度高、重复性好，在36个采集的板栗样品中有17个样品中检测出7种毒素，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的 方法

技术领域

本发明涉及一种快速测定板栗中14种毒素的方法，属于农产品检测技术领域。

背景技术

霉菌毒素是霉菌在生长过程中产生的对动物、人类和农作物有较大毒性的次生代谢产物。霉菌毒素可在农作物大田收获时形成；在不适宜的贮存条件下，霉菌毒素也可在收获后的农作物上形成。较高的湿度通常有利于霉菌的生长和霉菌毒素的产生。温度是另一个重要的因素，高温下的农作物很容易遭受霉菌孢子的侵害，一旦条件允许，霉菌孢子可产生霉菌毒素。霉菌毒素主要是由三类真菌产生，即曲霉、青霉和镰刀菌。它们所产生的真菌毒素，如黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马毒素B1、B2、B3、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A，由于其普遍存在及其对人体健康的影响，已成为全球关注的问题。而木本坚果是比较容易被霉菌毒素污染的作物品种，它们暴露于日常的外界环境中，而这种环境也十分有利于霉菌的生长和毒素的产生。

板栗是一种传统农产品，种植区域十分广泛，但主要集中在欧洲和亚洲地区。板栗营养价值丰富，由42.2-66.5％的淀粉、40.3-60.1％的水、9.5-23.4％的总糖、4.8-9.6％的粗蛋白、2.2-3.7％的粗脂肪、1.8-3.4％的灰分、2.8-3.2％的脂肪、必须氨基酸和矿物质组成。而板栗丰富的营养也导致其容易在储藏和收获的过程中受到霉菌感染。霉菌会产生霉菌毒素，污染板栗，从而影响人体和动物的健康。不适当的农业收获方式以及不适当的储藏条件都会促使霉菌的生长，提高霉菌毒素的污染风险。为了保持板栗的原味，通常不会做成板栗粉。即使加工成板栗粉，在作坊式的晒干过程中板栗的污染也会非常严重。此外，霉菌通常适于在亚热带和暖温带气候中生存，山东处于暖温带季风气候，极为适于霉菌生存。到目前为止，板栗中还未被报道过伏马毒素、青霉酸等毒素。但是作为木本坚果，板栗是否也容易被别的霉菌毒素感染我们还不能确定，所以对板栗进行多种毒素的残留分析十分有必要。

霉菌毒素的检测方法有很多，如酶联免疫法(ELISA)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、超高效液相色谱-质谱联用法。薄层色谱法和酶联免疫法通常用于作为定性和半定量检测，用于一种或者少数几种毒素的初步测试；气相色谱-质谱联用法在进样前通常需要对样品进行衍生化处理，其使用范围具有一定的局限性；而超高效液相色谱-质谱联用法由于其灵敏度高、特异性强、可靠性高等优势，日益成为广泛进行霉菌毒素分析的方法。近年来，也有不少使用超高效液相色谱-质谱联用法进行霉菌毒素测定的报道，但是这些检测方法仅适用于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A等常规真菌毒素，不能检测T-2毒素、青霉酸、伏马毒素B1、B2、B3、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等有可能出现在板栗中的真菌毒素。比如专利号为201410125596.8的中国专利公开了一种同时检测芝麻酱中多种霉菌毒素的方法，其虽然也是使用超高效液相色谱-串联质谱法，但其前处理方法繁琐，检出限和定量限高，灵敏度低，并且提取步骤比较繁琐，FB1、FB2、FB3的回收率较低，且并没有检测青霉酸。

此外，不同的样品的预处理步骤对检测方法也有一定的影响，因此，一种简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确，能够同时快速测定板栗中多种霉菌毒素残留量的检测方法亟待开发出来。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法。该方法使用优化的QuEChERS方法进行样品的预处理，建立了一种可以同时测定T-2毒素(T-2)、青霉酸(PCA)、伏马毒素B₁(FB1)、B₂(FB2)、B₃(FB3)、黄曲霉毒素B₁(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)、赭曲霉毒素A(OTA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3Ac-DON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15Ac-DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN))的高效液相色谱-串联质谱法，该方法的回收率高、灵敏度高、重复性好，可以为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

本发明的技术方案是：一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，包括以下步骤：

1)对待测板栗样品进行提取

以体积比为79:20:1的乙腈/水/甲酸溶液与板栗样品混合，离心后获得上清液为样品提取液；

优选的，称取5g的板栗样品加入10ml的乙腈/水/甲酸溶液中；离心，取5ml上清液为样品提取液；

2)对样品提取液进行预处理

在步骤1)所获得的样品提取液中加入0.2g/ml无水硫酸镁，0.1g/ml氯化钠，0.02g/ml C18粉，0.02g/ml的柠檬酸钠混匀后进行二次离心，上清液过滤后获得样品分析液；

优选的，取5ml样品提取液加入1g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，0.1g C18粉，0.1g柠檬酸钠，快速震荡混匀，离心；上清液过滤后获得样品分析液；

3)检测

采用UPLC-MS/MS对步骤2)中获得的样品分析液进行14种霉菌毒素的定性和定量分析。

进一步的，所述14种毒素为T-2毒素、青霉酸、伏马毒素B₁、B₂、B₃、黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮。

进一步的，所述步骤3)中UPLC-MS/MS色谱条件如下：

色谱条件：waters I-class超高液相色谱仪，UPLC BEH-C18柱(100×2.1mm²I.D，1.7μm)，流动相A：0.5％甲酸水，流动相B：甲醇，流速：0.3mL/min。

梯度洗脱程序如下：0-1min：流动相A和流动相B体积比为90：10；1-3min流动相B从10％线性增加到30％，平衡1min；4-6min流动相B从30％线性增加到50％，平衡1min；7-9min流动相B从50％线性增加到70％，平衡1min；10-11min流动相B从70％线性增加到90％，平衡3min；14-15min流动相B从90％线性减少到10％，平衡1min。

质谱条件：AB5500型三重四级杆串联质谱仪，电喷雾(ESI)离子源，正负离子扫描模式；各参数如下：离子喷雾电压：4.5kV，气帘气压力：15psi，雾化气压力：50psi，辅助加热气压力：50psi，离子源加热温度：550℃。利用多反应监测模式(MRM)检测。

进一步的，所述14种菌毒素中，正离子条件下可检测的毒素为：T-2毒素、伏马毒素B₁、B₂、B₃、黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇。负离子条件下可检测的毒素为青霉酸、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮。

本发明的有益效果：

1、本发明前处理采用了固相萃取净化技术，方法简便快捷，同时结合灵敏度高的UPLC-MS/MS技术建立了能够同时分析板栗中14种霉菌毒素的分析方法。

2、本发明比较了10种前处理方法，最终选择了改良的QuEChERS方法，用固相分散技术，采用加酸的提取溶剂对极性差别较大(伏马毒素B1、B2、B3与其它毒素相比极性大的多)的毒素进行前处理，能够同时提取板栗中残留的14种不同极性霉菌毒素，回收率高，成本低。

3、目前这类霉菌毒素的分离大部分是用到盐来做流动相的，盐对于仪器损害很大，很容易堵。本发明通过实验研究，采用0.5％甲酸-甲醇就可以获得分离效果很好的峰，从而减少了对仪器的损害。

4、本发明采用UPLC-MS/MS法同时定性定量测定板栗中14种毒素，用0.5％甲酸水和甲醇做流动相就可以使14种毒素完全分开，其检出限和定量限分别为0.02～1μg/kg，0.1～2μg/kg；平均回收率为74.2～108.7％，RSD均小于15％；灵敏度高、重复性好。

5、本发明中首次在36种山东板栗样品中检测出了伏马毒素B1、B2，青霉酸；除此之外还有黄曲霉毒素B1、B2，赭曲霉毒素A，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1为14种霉菌毒素在正离子(a)和负离子(b)模式下的标准溶液的总离子峰。每种分析物的浓度是50μg/kg。其中：(1)脱氧雪腐镰刀菌烯醇，(2)3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，(3)15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，(4)黄曲霉毒素G2，(5)黄曲霉毒素G1，(6)黄曲霉毒素B2，(7)黄曲霉毒素B1，(8)伏马毒素B1，(9)T-2毒素，(10)伏马毒素B3，(11)伏马毒素B2，(12)青霉酸，(13)玉米赤霉烯酮，(14)赭曲霉毒素A；

图2为采用不同的前处理方法14种霉菌毒素的平均回收率图；

图3为14种霉菌毒素的基质效应。

具体实施方式

1材料和方法

1.1材料和试剂

黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的标准品购自美国SigmaAldrich公司，伏马毒素B1、B2、B3、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、青霉酸购自Romer Labs公司，C18粉(50μm，

)购自美国Agilent Technologies公司，二水合柠檬酸三钠购自中国西陇科学股份有限公司。所用化学药品和溶剂均为ACS等级，用于HPLC分析的甲醇、乙腈和甲酸均为HPLC级。

MycoSep 226多功能净化柱和MycoSpin 400净化柱(用于多毒素)购自于RomerLabs公司。

1.2样品

从2017年4月到2018年9月，申请人从泰安、临沂、济南几个地点随机抽取了36份板栗样品，-18℃保存。用来进行方法验证和优化的样品不含有14种霉菌毒素。通过对比标准样品和测试样品，从而确认测试样品中是否含有目标物霉菌毒素。实验中需要配制合适浓度的标准品溶液，并绘制标准曲线。

1.3标准溶液配制

将霉菌毒素加入到乙腈中，制备浓度为1μg/ml的14种霉菌毒素的标准储备液，-18℃保存，每3个月更新一次。并用乙腈稀释制备了一系列的标准工作液，使用标准工作液制备相应标准溶液的标准曲线。

1.4样品中霉菌毒素的提取

称取5g的板栗样品放入50ml的离心管中，加入10ml的乙腈/水/甲酸溶液(体积比为79:20:1)中，在高速离心机中4000rpm离心5min，取5ml上清液并加入1g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，0.1g C18粉，0.1g柠檬酸钠，快速震荡混匀，涡旋2分钟，高速离心机4000rpm下离心5min。待分层后取上清液，使用0.2μm的微孔滤膜过滤，得到样品提取液。若待测样品溶液中的分析物的浓度在标准曲线范围之外，则需要进一步稀释样品提取液。

2方法验证

2.1分析方法

分析14种霉菌毒素需要建立标准曲线，每种毒素的标准曲线需要选用6个浓度(5.0、10、25、50、100、200ng/mL)的标准溶液，通过绘制LC/MS/MS中每种毒素的峰面积(y轴)与浓度(x轴)的关系曲线，建立了每种毒素的标准曲线。

将14种霉菌毒素的混合标准溶液添加到未被霉菌毒素污染的板栗样品中，以在霉菌毒素感染的情况下分析方法的精密度，各霉菌毒素的添加量如下：青霉酸50.0ng/g、DON50.0ng/g、AFB1 50.0ng/g、AFB2 50.0ng/g、AFG1 50.0ng/g、AFG2 50.0ng/g、FB1 50ng/g、FB2 50ng/g、FB3 50ng/g、T-2 50ng/g、ZEN 50ng/g、OTA50ng/g、3Ac-DON 50ng/g、15Ac-DON50ng/g。用LOD和LOQ测定了LC/MS/MS分析方法的灵敏度，信噪比(S/N)分别为3和10。

2.2基质成分对毒素提取的影响

参照1.4所述的提取方法从板栗中提取基质成分后，将1000ng/mL的霉菌毒素标准溶液与板栗样品中的基质成分以体积比1：4的比例混合，得到200ng/mL霉菌毒素的含基质的标准溶液。

用含有基质成分的提取物连续稀释标准溶液，制备每种霉菌毒素的6个浓度水平(5.0、10、25、50、100、200ng/mL)的标准溶液，在LC/MS/MS检测后构建每种毒素的标准曲线，使用该标准曲线计算14种霉菌毒素的加样回收率。

2.3 LC/MS/MS试验条件

色谱条件：waters I-class超高液相色谱仪，UPLC BEH-C18柱(100×2.1mm²I.D，1.7μm)，流动相A：0.5％甲酸水，流动相B：甲醇，流速：0.3mL/min。

梯度洗脱程序如下：0-1min：流动相A和流动相B体积比为90：10；1-3min流动相B从10％线性增加到30％，平衡1min；4-6min流动相B从30％线性增加到50％，平衡1min；7-9min流动相B从50％线性增加到70％，平衡1min；10-11min流动相B从70％线性增加到90％，平衡3min；14-15min流动相B从90％线性减少到10％，平衡1min。

质谱条件：AB5500型三重四级杆串联质谱仪，电喷雾(ESI)离子源，正负离子扫描模式；各参数如下：离子喷雾电压：4.5kV，气帘气压力：15psi，雾化气压力：50psi，辅助加热气压力：50psi，离子源加热温度：550℃。

裂解电压及碰撞能量(见表1)，使用Analyst1.6.2软件进行优化。采用多反应监测(MRM)模式采集数据，保证采集点充足(每个峰至少有12个点)。14种霉菌毒素在正离子(a)和负离子(b)模式下的标准溶液的总离子峰如图1所示。

表1 14种霉菌毒素的MRM参数

3结果与分析

3.1串联质谱条件参数的优化

在正和负离子模式下对MS/MS参数进行了研究，将14种霉菌毒素的混合标样上样，用质谱进行全扫描。结果表明如图1所示，11种化合物在正电离模式下([M+H]⁺离子为母离子)具有良好的响应。青霉酸、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A对[M-H]^-离子具有较高响应，因为它们的结构含有-COOH或-OH并容易电离。选择每个霉菌毒素产生响应最强的子离子作为定量离子，第二强的子离子作为定性离子。表1列出了14种霉菌毒素的去簇电压、碰撞能和保留时间。

3.2高液相色谱条件的优化

在建立MS/MS参数后，优化液相方法。通常甲醇或者乙腈作为实验的流动相时都需要加入醋酸铵或者甲酸铵，但是这些成分加入流动相以后在进行大批量的进样时容易形成盐，造成对柱子或者仪器的堵塞，即使少量进样也需要比较长的时间冲洗柱子和仪器。使用乙腈作为流动相时正离子和负离子的响应相对较弱，峰形较宽；而大多数的毒素都是极性成分，含有醇羟基官能团，与甲醇极性更加接近，易于洗脱，峰形也更好，分析物测定更加准确，因此使用甲醇作为流动相。

为了优化霉菌毒素的分离效果，研究了以甲醇(有机相)和水(极性相)为流动相，在甲醇流动相中分别加入0.1％甲酸、0.2％甲酸、0.5％甲酸、1mM的醋酸铵和0.1％氨水溶液后对霉菌毒素分离效果的影响。流动相中加入1mM醋酸铵后3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇的[M+H]⁺离子峰的有干扰峰，而伏马毒素B1离子峰出现了明显的分裂峰；流动相中加入0.1％的氨水溶液对青霉酸、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A具有良好的峰形和较强的响应，但黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素B1和B2以及3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的[M+H]⁺离子的响应值低。而添加甲酸增强了[M+H]⁺离子的响应，对[M-H]^-的响应和峰形几乎没有影响，并且甲酸浓度越大则响应值越高。但是甲酸达到0.5％的浓度时效果最佳，而且酸度再次增加，柱子的耐受力也会达到极限，因此使用0.5％的甲酸可以获得更好的灵敏度，如图1所示。伏马毒素B1、B2、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇难以用常规色谱法进行分离，但用质谱法可以获得较好的分离效果。

3.3样品处理方法的优化

在早期板栗霉菌毒素的研究中，霉菌毒素的提取常使用甲醇和水提取，过免疫亲和柱，操作繁琐、费时费力，并且免疫亲和柱昂贵。QuEChERS方法目前已用于谷物中的多种霉菌毒素的提取。孙娟等人研究的QuEChERS方法(QuEChERS净化UPLC-MS/MS法同时检测谷物中25种毒素，Toxins 2016)给出了多种霉菌毒素的回收率，有些霉菌毒素的回收率低于70％。因此，本发明对样品前处理条件进行了优化，确保对所有目标霉菌毒素的有效提取。

在空白的板栗基质中加入中等浓度的14种霉菌毒素，加入甲酸/乙腈/水的混合溶剂采用改良的QuECHERS方法、MycoSep 226多功能净化柱、MycoSpin 400净化柱从样品中提取目标分析物。

改良的QuEChERS的方法采用加MgSO₄/NaCl、C18粉、柠檬酸钠、PSA、水和甲酸等不同的方法处理，表2中给出了板栗中添加不同净化剂、采用不同的固相萃取柱和不同萃取溶剂的处理组。

表2板栗中添加不同净化剂、采用不同的固相萃取柱和不同萃取溶剂(包括不同配比)的处理组(n＝3)

图2给出了上述10个处理的平均回收率。从图2可以看出：不加MgSO₄/NaCl和柠檬酸钠的实验组(处理2)中，14种霉菌毒素的回收率明显下降；不加水(实验组3)，有一些霉菌毒素的回收率低于70％，这可能是没有水的浸湿，不能充分的浸润板栗，不能很好的提取毒素，导致回收率下降。加入PSA的实验组(实验组8)，没有检测到伏马毒素B1、B2、B3，可能是因为PSA吸附水溶性的伏马毒素B1、B2、B3；不加酸(实验组6)的实验组伏马毒素B1、B2、B3的回收率低于5％；用MycoSep 226多功能净化柱进行样品处理的实验组(处理9)，黄曲霉毒素G1、青霉酸、赭曲霉毒素A的回收率均小于70％，不能检出伏马毒素B1、B2、B3等极性霉菌毒素；使用MycoSpin 400净化柱(处理10)柱处理样品，青霉酸的回收率低于70％。实验组1的改良的QuEChERS的方法，可以有效的处理样品，所有霉菌毒素的回收率在74.2～108.71％之间。此外，固相萃取柱是一次性的消耗实验材料，实验成本较高。QuEChERS法使用较少的有机溶剂，并且提取时间更短，适用于大量样品的预处理。实验证明：改良后的QuEChERS法是检测板栗中14种霉菌毒素残留量的最佳预处理方法。

3.4方法验证

对板栗空白基质在5、10、25、50、100、200ng/ml浓度水平上进行添加不同的霉菌毒素建立标准曲线，表3给出了标准曲线的线性和检测限，在实验浓度范围内R值高于0.9990，有良好的线性，每种毒素的检测限和定量限分别是信噪比的3倍和10倍，样品的霉菌毒素的检测限为0.02～1μg/kg，定量限为0.15～2μg/kg。结果表明：该方法对板栗中霉菌毒素的检测是灵敏的。

表3 14种霉菌毒素的线性、检出限和定量限

3.5精密度和回收率

加样回收率试验，在三份空白样品中进行低、中、高三个浓度水平上添加混合标准物质进行测定，来分析方法的准确度。

计算峰面积日内和日间的变化以及相对标准偏差来分析其精密度，表4给出了分析物的平均回收率和相对标准偏差。表4中可以看出，使用该方法所有的霉菌毒素的平均回收率在74.2-109.5％之间，所有相对标准偏差低于15％，符合欧盟第2002/657/EC号现行法规的要求。

表4分析方法的精密度和回收率

3.6基质效应的评价

在UPLC-MS/MS中，由基质成分引起的基质效应是常见且不可避免的。基质成分的存在可以增强或抑制分析物在电离过程中的响应，因此可能干扰定量，产生错误的结果。在本研究中，通过比较基质配制的标准曲线和纯溶剂配制的标准曲线的斜率比来检验基质效应。图3给出了14种霉菌毒素由基质配制的标准溶液和纯溶剂配制的标准溶液之间的基质效应差异。

由图3可以看出：在正离子模式下，基质效应的增强范围在2.4-53.8％之间，其中伏马毒素B3(53.8％)最强，其次是伏马毒素B1、黄曲霉毒素G1、伏马毒素B2、黄曲霉毒素G2、B2。在正离子模式下其它被分析成分的基质效应被抑制，抑制比例在7.3～13.9％之间，被抑制最强的成分是T-2毒素，其次是黄曲霉毒素B1、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇。11种霉菌毒素中有五种毒素的抑制率低于15％，15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇表现出最小的抑制作用(7.3％)。在负离子模式下，玉米赤霉烯酮表现出轻微的抑制作用(0.8％)，赭曲霉毒素A和青霉酸的基质增强作用明显。

这些结果表明：基质配制的标准曲线是定量测定板栗中霉菌毒素的必要条件。

4、结论

建立一种板栗中同时快速提取并测定T-2毒素、青霉酸、伏马毒素B1、B2、B3、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀烯醇和玉米赤霉烯酮的UPLC-MS/MS方法。这种方法简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确度高，检出限和定量限低于欧盟2002/657/EC(只有黄曲霉毒素B1的限量，规定在坚果中的限量是2μg/kg)和中国标准限量GB2761 2017(只有黄曲霉毒素B1的限量，规定在熟制坚果中的限量是5μg/kg)。

实施例2实际样品测定

使用实施例1中提供的方法测定了36个从山东地区采集的板栗样品中霉菌毒素的残留量，其中17个板栗样品中检测出7种霉菌毒素，其含量为1.2-60.5μg/kg，结果如表5所示，从山东地区采集的样品中最常见的霉菌毒素是伏马毒素B2(41.7％)，赭曲霉毒素A(27.8％)，有三个样品中也检测出了黄曲霉毒素B1和B2，浓度分别为1.2-3.5μg/kg和1.4-3.1μg/kg。我国还没有专门制定板栗中霉菌毒素限量的标准，只制定了熟制坚果中黄曲霉毒素B1的限量是5μg/kg，而欧盟规定了坚果中黄曲霉毒素B1的限量是2μg/kg，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2之和的限量是4μg/kg，根据欧盟标准限量，有2个样品是超标的。

本次检测中还首次检出了板栗中含有伏马毒素B1、B2、青霉酸，它们含量都分别为2.4-24.6、35.4-60.5和13.3μg/kg；检测到的赭曲霉毒素A的含量是1.8-4.8μg/kg，结果如表5所示，此次检测未观察到T-2毒素、黄曲霉毒素G1和G2、伏马毒素B3、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的污染。

上述结果表明，板栗中霉菌毒素的污染水平要低于此前调查报告中的水平，而山东地区采集的板栗样品中还含有伏马毒素、青霉酸，因此板栗中霉菌毒素的污染也是需要被重视的。

表5山东地区采集的板栗样品中多种霉菌毒素的污染率，阳性样品的平均值和范围

Claims (5)

1.一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，所述14种毒素为：T-2毒素，青霉酸，伏马毒素B1、B2、B3，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，脱氧雪腐镰刀菌烯醇，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮，

其测定方法包括以下步骤：

1)对待测板栗样品进行提取

将乙腈/水/甲酸溶液与板栗样品混合，离心后获得上清液为样品提取液；所述乙腈/水/甲酸溶液的体积比为79:20:1；

2)对样品提取液进行预处理

在步骤1)所获得的样品提取液中加入0.2g/ml无水硫酸镁，0.1g/ml氯化钠，0.02g/mlC18粉和0.02g/ml的柠檬酸钠混匀后进行二次离心，上清液过滤后获得样品分析液；

3)检测

采用UPLC-MS/MS方法对步骤2)中获得的样品分析液进行14种霉菌毒素的定性和定量分析；

所述UPLC-MS/MS色谱条件如下：色谱柱为UPLC BEH-C18柱；流动相A：0.5％甲酸水，流动相B：甲醇；

梯度洗脱程序如下：0-1min：流动相A和流动相B体积比为90：10；1-3min流动相B从10％线性增加到30％，平衡1min；4-6min流动相B从30％线性增加到50％，平衡1min；7-9min流动相B从50％线性增加到70％，平衡1min；10-11min流动相B从70％线性增加到90％，平衡3min；14-15min流动相B从90％线性减少到10％，平衡1min；

所述UPLC-MS/MS的质谱条件：电喷雾ESI离子源，正负离子扫描模式；质谱各参数如下：离子喷雾电压：4.5kV，气帘气压力：15psi，雾化气压力：50psi，辅助加热气压力：50psi，离子源加热温度：550℃，利用多反应监测模式检测。

2.如权利要求1所述的一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，所述14种毒素中，正离子条件下检测的毒素为：T-2毒素，伏马毒素B1、B2、B3，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，脱氧雪腐镰刀菌烯醇，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇；负离子条件下检测的毒素为青霉酸、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮。

3.如权利要求1所述的一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，所述14种毒素的MRM参数如下：

其中T-2为T-2毒素，PCA为青霉酸；FB1、FB2、FB3分别为：伏马毒素B1、B2、B3；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2分别为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2；OTA为赭曲霉毒素A，DON为脱氧雪腐镰刀菌烯醇，3Ac-DON为3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15Ac-DON为15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，ZEN为玉米赤霉烯酮。

4.如权利要求1所述的一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，所述步骤1)具体为：称取5g的板栗样品加入10ml的乙腈/水/甲酸溶液中；离心，取5ml上清液为样品提取液。

5.如权利要求1所述的一种固相萃取结合UPLC-MS/MS快速测定板栗中14种毒素的方法，其特征是，所述步骤2)具体为：取5ml样品提取液加入1g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，0.1gC18粉，0.1g柠檬酸钠，快速震荡混匀，离心；上清液过滤后获得样品分析液。

Images