CN113624885A - 一种快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及板栗粉鉴别方法，具体为一种快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，包括以下步骤：对板栗粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物进行含量检测，当脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物中的任意一种测定值为5.0‑10μg/kg时，判定为有掺假可能，当脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物总和的测定值≧10μg/kg时，判定为板栗粉掺假。利用通过型固相萃取‑超高效液相色谱‑串联质谱联用的方法对板栗粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物进行含量检测，基于真菌毒素的污染量实现快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的技术目的。

Description

一种快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法
技术领域
本发明涉及板栗粉鉴别方法，具体为一种快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法。
背景技术
板栗是原产于中国的重要作物，素有“干果之王”、“树上面包”、“铁杆庄稼”之美称。新鲜板栗主要以蒸煮、糖炒、炖菜等形式食用，深受大家喜爱。然而板栗收获期较为集中，通常为9月中下旬，此时气温较高，果实呼吸作用强，新鲜板栗含水、含糖量高，不耐贮藏，极易腐败变质。即使是4℃冷藏保存，两个月后仍然会有25％板栗发霉而无法食用，这也极大限制了板栗产业的发展。因此，工业上利用干燥技术对板栗进行脱水后制成板栗粉可有效延长其保质期，使人们在非当季也可品尝到板栗制品。近几年来，已有大量研究显示板栗粉具有高营养、高价值，其所含必需氨基酸、多糖、膳食纤维、黄酮类物质、多酚等均显著高于小麦粉，同时其无麸质的优点也使其替代传统小麦粉成为一种需求量越来越大的优良食品开发原料。但是目前市场上，板栗粉的价格平均为小麦粉的5-7倍，巨大的成本差异使部分不法商贩或生产厂商使用小麦粉对板栗粉进行掺假，以混合粉替代纯板栗粉进行销售，获取高额利润。板栗粉本身呈现淡至深黄色，掺入使用小麦粉掺假后常人无法通过肉眼辨别，即使做成食品，因后二者口感差异也不显著，也无法准确辩识。为打击不法商贩和生产厂商的不法行为，维护板栗粉市场的持续稳定，保障居民的身体健康，开发一种能够快速、高效、准确鉴定掺假的方法十分有必要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法。利用通过型固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱联用的方法对板栗粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物进行含量检测，实现快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的技术目的。
一种快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，对板栗粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物进行含量检测，当脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物中的任意一种测定值为5.0-10μg/kg时，判定为有掺假可能，当脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物测定值总量≥10μg/kg时，判定为板栗粉掺假；
所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇的4种衍生物为：3-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇和环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
进一步地，采用通过型固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱联用的方法对板栗粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物进行含量检测。
进一步地，所述检测方法具体包括以下步骤：
(1)将样品置于提取液中进行震荡提取后离心得上清液；
(2)上清液置于净化柱中净化得滤液；
(3)滤液经氮气吹干后加水混匀后微孔过滤得待测样品；
(4)待测样品进行超高效液相色谱-串联质谱分析得出板栗粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物的含量。
进一步地，所述步骤(1)中，所述提取液为体积比为84：16的乙腈-水溶液，样品和提取液的质量体积比为2g：20mL，所述震荡提取具体为涡旋震荡20min，离心具体为8500rpm离心5min。
进一步地，所述步骤(2)中，所述净化柱的填料为C18、NH2、硅藻土和GCB中的一种或多种混合物，以重力自然流速使上清液通过净化柱。
进一步地，所述净化柱填料为质量比为16:30:10:30的C18、GCB、NH2、硅藻土混合物。
进一步地，所述步骤(3)中，氮气吹干在40℃条件下进行，所述混匀具体为超声30s后涡旋30s，所述微孔过滤为过0.22μm微孔滤膜。
进一步地，所述步骤(4)的具体条件为：采用Waters BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)进行液相分离，柱温设置40℃，流速0.3mL/min，进样体积10μL，质谱基于电喷雾离子源，采用正/负离子多反应监测模式，离子源电压5.5/-4.5kV，源温度500℃，气帘气20psi，碰撞气7psi。
进一步地，所述超高效液相色谱-串联质谱分析采用同位素内标法进行分析检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明基于通过型固相萃取和化学计量学技术建立初筛方法，对大批量板栗粉、小麦粉中43种真菌毒素的污染状况，包括阳性种类、浓度范围等进行初步评估。经统计学分析阳性毒素在两种基质中的差异性后，选出具有特异性的掺假标记物。结果发现，即使是放置霉变的板栗粉中，其霉变只是菌落数量的增加，真菌毒素的含量并未发生显著变化，对于几种脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物而言无任何变化。因此，小麦粉与板栗粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物(即两种乙酰化衍生物、雪腐镰刀菌烯醇、环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇)为典型性毒素，其在两种食物基质中分布具有显著性差异，根据上述毒素的检测结果是否为阳性及污染浓度来对板栗粉的纯度进行评估。后续利用净化柱、内标法定量对所收集的样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物进行分析。最终，结合实际检测结果得出，当板栗粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇极其4种衍生物(即3-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇及环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇)中的任意一种呈阳性结果(测定值介于检出限5.0μg/kg与定量限10.0μg/kg之间)，则认为该样品有掺假可能；当该类毒素含量总和≧定量检出限(10.0μg/kg)时，则可判定该板栗粉掺假。
附图说明
图1为本发明实施例1中净化柱使用操作步骤图；
图2为本发明实施例1中使用初筛方法和净化柱方法的效果对比图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1(初步评估)
(1)试剂与仪器
黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、交链孢烯、白僵菌素、球毛壳菌素A、蛇形菌素、恩链孢菌素A、恩链孢菌素A1、恩链孢菌素B、恩链孢菌素B1、胶黏霉素、HT-2、新茄病镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、青霉酸、杂色曲霉毒素、T-2、腾毒素、毒黄素、疣孢青霉原、15-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、交链孢酚单甲醚、α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、米酵菌酸、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、黄绿青霉素、环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、烟曲霉素、镰刀菌酮X、雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素、震颤霉素A、渥曼青霉素、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮均采购自青岛Pribolab普瑞邦公司(规格均为1.0mg)，使用乙腈溶解后配制成标准储备溶液(100.0μg/mL)转移至试剂瓶中后，于-20℃条件下避光保存，备用，有效期：6个月；
同位素内标标准工作溶液(1.0μg/mL)：准确移取13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、13C15-雪腐镰刀菌烯醇、13C17-3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液(25μg/mL，Romer公司)1.0mL于25mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，密封避光-20℃条件下避光保存，备用，有效期：6个月；
脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物混合标准工作溶液(5.0μg/mL)：从各支标准储备溶液各吸取0.5mL后用乙腈定容至10.0mL，于-20℃下密封保存，有效期：1个月；其余所有真菌毒素标准品均购自青岛普瑞邦公司。
乙腈(CH3CN，色谱纯)，Fisher Scientific赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
固相萃取混合填料(包括C18，PSA，EMR，碱性硅藻土，中性硅藻土，Florisil，酸性氧化铝，中性氧化铝，碱性氧化铝，NH2，GCB)，Phenomenex飞诺美&博纳艾杰尔科技有限公司、安捷伦科技(中国)有限公司；
空固相萃取小柱(6mL)、固相萃取柱筛板(1/16”，10μm)，Phenomenex飞诺美&博纳艾杰尔科技有限公司；
0.22μm水相微孔滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司；
一次性针筒(1mL规格)，浙江拱东医疗科技有限公司；
BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)柱，Waters沃特世科技(上海)有限公司；其余常规试剂、耗材均为当地经销商处购买。
(2)多真菌毒素筛查仪器条件
正离子组分筛查条件：采用Waters BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)进行液相分离，柱温设置40℃，流速0.3mL/min，进样体积10μL，流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸-49.5％乙腈-49.5％甲醇，超高效液相色谱分离梯度条件见表1。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子多反应监测模式，离子源电压5.5kV，源温度500℃，气帘气20psi，碰撞气7psi。
表1真菌毒素在ESI源正离子模式筛查时的超高效液相色谱梯度洗脱条件
Figure BDA0003220515060000051
负离子组分筛查条件：采用Waters BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，或相当者进行液相分离，柱温设置40℃，流速0.3mL/min，进样体积10μL，流动相A：纯水，流动相B：乙腈，超高效液相色谱梯度条件见表2。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，负离子多反应监测模式，离子源电压-4.5kV，源温度500℃，气帘气20psi，碰撞气7psi，多真菌毒素多反应监测质谱条件详见表3。
表2真菌毒素在ESI源负离子模式筛查时的超高效液相色谱梯度洗脱条件
Figure BDA0003220515060000052
Figure BDA0003220515060000061
表3真菌毒素的多反应监测质谱条件
Figure BDA0003220515060000062
Figure BDA0003220515060000071
a括号内为碰撞能量
(3)初筛方法建立
首先建立适用于两种基质中多真菌毒素筛查的预处理方法，主要基于通过型固相萃取法，以多毒素回收率为优先考虑对象。本部分实验共考察了12种典型的固相萃取吸附剂净化剂(作用机理覆盖离子交换、极性吸附、螯合作用等)，分别为EMR(脂类吸附剂)、C18、PSA(N-丙基乙二胺)、NH2、酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝、Florisil、硅藻土、GCB(石墨化碳黑)、PCX(混合型阳离子交换吸附剂)、PAX(混合型阴离子交换吸附剂)等，以目标毒素加标溶液的回收率进行评估，结果如表4所示。
表4不同吸附剂对各种真菌毒素的回收率结果
Figure BDA0003220515060000072
Figure BDA0003220515060000081
Figure BDA0003220515060000091
结果显示，EMR与C18，尤其是C18对绝大部分毒素都有着良好的回收率，且二者对提取液中的中等至弱极性杂质均有良好的吸附效果，因此采用这两种作为初筛方法的净化剂。但同时需要注意到的是EMR虽然除脂效果良好，但过量使用会导致弱极性毒素回收率的损失，因此对二者的用量需要进一步进行优化。随后，对其进行中心组合响应曲面设计，每个因素进行五个不同水平的实验来减少操作中偶然误差的影响，实验矩阵设计与结果如表5所示。
表5中心组合设计实验矩阵
Figure BDA0003220515060000092
Figure BDA0003220515060000101
在根据上述实验矩阵进行试验得到结果后，利用Design-expert 8.0.6.0软件(Stat-Ease Inc.,Minneapolis,USA)进行模型拟合度分析，在本实验中，优选模型为二次多项式(Quadratic polynomial)模型。随后对所得数据进行二次多元回归拟合，整理得到对实验因素一次项、交互项和二次项进行评估的回归方程：
Figure BDA0003220515060000102
式中，Y为预测响应值，Xi和Xj代表独立变量，δ0为常数项，δi为线性系数，δii为二次项系数，δij为交互项系数，ε为随机误差补偿项。以黄曲霉毒素B1为例，得到方程：
Figure BDA0003220515060000103
得到回归方程后对结果进行ANOVA方差分析，通过拟合方程模型项(Model)、矢拟项(Lack of Fit)、确定系数(R2)来对生成的多项式模型方程进行评估。首先，所有模型项P值均小于0.0132、矢拟项p值处于0.0809-0.9878范围，均表明生成的多项式模型非常适用于当前条件下的数据预测；确定系数(R2)通常要求至少大于0.8表明理论预测值与实际实验数据之间具有良好的一致性，本实验中所得确定系数(R2)在0.8438-0.9974之间，表明所生成的模型能够解释响应值中84.38％-99.74％的波动。在将得到的二次回归方程进行响应曲面分析后，为了获取最高的毒素回收率，利用软件的Numerical Solutions功能求拟合方程中的响应值Y的最大值，分别对各变量求一阶偏导，计算得到最佳的实验条件为：140mgC18及25mg EMR。
随后，在最佳实验条件下，对初筛方法就灵敏度、精密度及准确度在小麦粉、板栗粉基质中进行方法学验证。结果显示，在板栗粉中，三水平加标回收率可在75.8％-109.4％之间(RSD≤7.5％)，而在小麦粉基质中加标回收率在72.5％-112.9％之间(RSD≤9.3％)，两种基质中的检出限均处于0.1μg/kg-20.0μg/kg之间。综上可发现，初筛方法完全可以满足小麦粉及板栗粉中的多毒素筛查。
(4)样品初筛
通过网购、市场、超市等途径共收集到板栗粉24份，小麦粉80份，此外，从市场、网购等途径采购新鲜板栗14份、干栗子10份，于实验室内烘干后研磨制成板栗粉。需要说明的是，从这些自制板栗粉中随机选取15份，每份取平行，于30℃、60％湿度条件下放置，使其霉变、得到自制发霉样品。所有上述样品均进行预处理，具体方法如下：称取2.00g样品，于50mL离心管中，加入20.0mL 84/16乙腈水溶液提取20min后，8500rpm离心3min，取出上清液3.0mL，加入140mg C18及25mg EMR涡旋混合净化3min，后以15000rpm离心5min。准确移取上清液2.0mL，于40℃条件下氮吹浓缩，最后使用1.0mL 30％甲醇水溶液复溶、过膜后进样分析，初筛定量方法采用基质匹配曲线完成。
(5)初筛结果及特异性毒素的确定
基于上述初筛方法对所有样品进行检测，采用基质匹配标准曲线外标法定量，结果统计如表6所示。其中，在板栗粉中共检出真菌毒素18种，而在小麦粉基质中检出毒素17种。随后对统计结果进行分析：4种黄曲霉毒素在2种食品中均有检出，但阳性率均不高，且浓度之间不存在明显差异(P>0.05)；交链孢酚单甲醚在两种粉中的污染阳性率较高，但污染浓度相近，不适合作为区分的标记毒素；白僵菌素、腾毒素、玉米赤霉烯酮及4种恩链孢菌素虽然在小麦粉中的污染更为严重一些，但这几类毒素在2种基质中的阳性率和污染浓度仍然缺少显著差异，仅此难以进行准确定性；球毛壳菌素A、青霉酸虽然仅在板栗粉中检出，但阳性率太低，参考价值不大；需要注意的是脱氧雪腐镰刀菌烯醇，该毒素在小麦粉中的检出率可达到100％(平均浓度可达到297.1μg/kg)，几乎很难发现阴性小麦粉，而板栗粉样品中无论是购买的板栗粉、自制板栗粉或是霉变板栗粉，均未检出脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物，该类毒素在这两种基质中的污染分布存在显著性差异，由此可以将脱氧雪腐镰刀菌烯醇作为区分小麦粉和板栗粉的掺假标记物具有重要的参考意义。为了进一步验证，采用GB 5009.111-2016第一法中的免疫亲和柱法和多功能净化柱法进行测定，结果同样为未检出。除脱氧雪腐镰刀菌烯醇外，4种脱氧雪腐镰刀菌烯醇的衍生物包括2种乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇及环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，虽然实际检出率极低且污染浓度通常并不显著，但作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇的衍生物，必然会伴随着脱氧雪腐镰刀菌烯醇而出现，因此这4种毒素也可作为判断的重要补充依据。结合4种毒素的检出率及检出浓度，本发明最终确定脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇作为鉴定小麦粉与板栗粉的掺假标记物。
表6板栗粉和小麦粉中阳性毒素及其检出浓度范围
Figure BDA0003220515060000121
Figure BDA0003220515060000131
(6)净化柱吸附剂的选择及配比优化
为达到快速净化的目的结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇等毒素的性质，采用混合填料作为固相萃取小柱的吸附剂进行净化柱的设计。参照表4结果，可以发现，除了4种填料C18、NH2、硅藻土和GCB对脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物的吸附作用较小，其余吸附剂均对目标毒素具有一定程度的吸附效应，因此不适合作为净化剂使用，而C18(疏水非极性吸附)、GCB(苯环平面结构吸附)、NH2(弱阴离子交换、氢键吸附)、硅藻土(助滤)可有效去除样品基质溶液中的有机酸、色素、脂肪和糖类杂质。但是各种吸附剂的用量仍需要进一步进行优化，再次设计中心组合设计试验，以C18、NH2、硅藻土和GCB的用量作为考察对象，以脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物的回收率作为响应值，实验矩阵设计如表7所示。
表7板栗粉小麦粉中阳性毒素及其检出浓度范围
Figure BDA0003220515060000132
Figure BDA0003220515060000141
得到回归方程后对结果进行ANOVA方差分析，通过拟合方程模型项(Model)、矢拟项(Lack of Fit)、确定系数(R2)、调整确定系数(Adj-R2)来对生成的多项式模型方程进行评估，结果统计如下表8所示。
表8二次多项式模型方差分析结果
Figure BDA0003220515060000142
通过结果可以发现，脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物的方程模型项P值均远远小于0.05表明其为极显著项；模型矢拟项均大于0.05，表明该实验所得数据受到误差影响的可能性低于0.01％；多项式模型方程的拟合程度和模型质量由确定系数(R2)表示，模型拟合良好一般至少要求R2至少大于0.8，本实验中R2最低为0.9376，调整确定系数(Adj-R2)为0.8793，表明生成的方程与实验数据拥有93.76％的符合度，能够解释87.93％的变化效应，对响应值的预测能力优秀，可信度较高。最终，在将得到的二次回归方程进行分析、设定目标项范围(A、B、C、D均为所设置范围内，因素项均为最大值)后，得到理论最佳配比：C18用量为160mg，GCB用量为300mg，NH2用量为100mg，硅藻土用量为300mg。
(7)准确定量分析
称取2.00g试样于50mL塑料离心管中，加入400μL同位素内标(其中3C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇及环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标、13C15-雪腐镰刀菌烯醇作为雪腐镰刀菌烯醇内标、13C17-3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇作为3-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇及15-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标)后震荡混合静置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84/16，v/v)涡旋振荡提取20min，后以8500rpm离心5min，上清液待净化。
净化柱使用操作步骤如图1所示：直接准确移取2.0mL提取液于净化柱中，以重力自然流速使提取液通过净化柱得到充分净化，再使用2mL乙腈淋洗，合并收集滤液，该方法整个过程仅需3min左右。将所得滤液于40℃条件下氮吹至干，随后加入1.0mL纯水，超声30s后涡旋30s，过0.22μm微孔滤膜后完成制样，待仪器进样分析。
(8)方法学参数考察
在确定好混合填料比例后从准确度、精密度、净化效果、基质效应等方面进行考察。在空白(低背景)基质中设置三水平加标试验(200μg/kg、500μg/kg、1000μg/kg)，以验证该净化填料的准确度。结果显示，经同位素内标校准后脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回收率处于84.8％-106.1％，RSD<5.7％；3-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回收率处于92.6％-105.3％，RSD<4.8％；15-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回收率处于93.2％-107.6％，RSD<5.1％；环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回收率处于77.4％-92.5％，RSD<6.1％；雪腐镰刀菌烯醇的回收率处于76.3％-91.8％，RSD<5.1％。上述结果表明，使用该净化柱对提取液进行净化不会影响测定的准确度、精密度。选择典型小麦粉和板栗粉基质，对比使用初筛方法和净化柱方法的效果，结果如图2所示。图中A和C分别为初筛方法净化的小麦粉和板栗粉，可以发现初筛方法虽然对绝大部分毒素保持有良好的回收率，但高通量的特点使其无法兼顾净化效果，随着进样次数的增加会对色谱柱、质谱仪毛细管等部件造成严重污染。小麦粉、板栗粉样品复溶液分别呈白色和黄色乳浊状，使用冷冻离心与过滤均无效果，推测其主要为脂溶性杂质；而使用了混合填料柱净化的小麦粉(B)、板栗粉(D)溶液则几乎为澄清透明，主要原因在于GCB对具有苯环平面结构、弱极性杂质有着极强的针对性吸附作用，而脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物均为强极性毒素，因此可以在去除绝大部分干扰杂质的前提下不影响目标化合物的回收率。此外，NH2能够除去部分有机酸、糖类物质，而硅藻土也具有很强的吸附能力，良好的过滤性，能吸附除去溶液中的微细粒子，提高过滤速度和得到澄清的滤液。
最后，本实施例还对比了目标毒素在两种净化方法净化后的提取液中的基质效应，操作方法为使用样品溶液、纯溶剂溶液配制标准曲线(10.0ng/mL，20.0ng/mL，50.0ng/mL，100.0ng/mL，200.0ng/mL，500.0ng/mL，1000.0ng/mL，2000.0ng/mL)，分别取二者曲线斜率进行比较所得比值小于80％，则说明存在比较明显的基质抑制效应，若比值大于120％，则说明存在比较明显的基质增强效应，若比值处于80％-120％之间则说明基质效应为可接受水平。结果如表9所示，相比于板栗粉基质，小麦粉的基质效应可基本忽略，且经过净化后基质效应进一步减少；尽管板栗粉中目标毒素的基质效应仍然不可忽视，但经混合填料柱净化后不管是肉眼可见的效果还是基质抑制效应都得到了显著的改善，再结合同位素内标进行校正后完全可满足这两种基质中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物的准确分析。
表9初筛方法与混合填料净化柱对两种基质中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物基质效应的影响
Figure BDA0003220515060000161
Figure BDA0003220515060000171
(9)准确定量分析
使用净化柱净化、同位素内标校正，对所有样品再次进行测定，结果统计如表10所示。发现，小麦粉基质中共有3种毒素被检出，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇阳性率仍然为100％。而板栗粉制品中，无论是新鲜板栗粉亦或是霉变板栗粉，都未检出脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物，表明使用真菌毒素进行掺假鉴定具有令人满意的可靠性。
表10板栗粉小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物检出浓度范围
Figure BDA0003220515060000172
a依次为平均浓度，检出范围，阳性率
(10)掺假灵敏度试验
选择空白板栗粉(未检出上述五种毒素)和典型小麦粉(脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度为282.4μg/kg，即最接近平均污染浓度)作为考察对象进行测试，分别以5％、10％、20％、50％、75％比例混合均匀后进行测定。结果显示即使以最低5％的比例掺假，本方法同样可以在掺假板栗粉中检出脱氧雪腐镰刀菌烯醇。根据本研究的实际测定结果(检出限为5.0μg/kg，未检出结果按照检出限一半的值，即2.5μg/kg纳入计算)，将板栗粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的平均浓度±3倍标准偏差推荐为疑似警告值，平均浓度±10倍标准偏差推荐为掺假定性值。板栗粉样品中均未检出上述毒素，因此我们认为只要当板栗粉中有脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物检出时(检出限为5.0μg/kg，定量限为10.0μg/kg)时，就应怀疑该板栗粉有掺假可能，当测定值≧定量限时可以判定该板栗粉掺假。
结论：经过本研究的大范围真菌毒素初筛后，确定以脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物作为区分小麦粉和板栗粉的标记毒素。随后筛选出适用于上述毒素快速净化的填料(即C18、NH2、硅藻土和GCB)，同时设计中心组合试验，优选混合填料最佳配比。设计的混合填料净化柱经方法学参数测试后，证实其可用于小麦粉、板栗粉基质中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物的预处理，其耗材成本低，分析速度快，净化效果好，结合同位素内标法可大大提高测定准确度。最终，结合本研究实际检测结果，当板栗粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇极其4种衍生物(即3-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇及环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇)中的任意一种呈阳性结果(测定值介于检出限5.0μg/kg与定量限10.0μg/kg之间)，则认为该样品有掺假可能；当该类毒素含量总和≧定量检出限(10.0μg/kg)时，则可判定该板栗粉掺假。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：对板栗粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物进行含量检测，当脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物中的任意一种测定值为5.0-10μg/kg时，判定为有掺假可能，当脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物测定值总量≧10μg/kg时，判定为板栗粉掺假；
所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇的4种衍生物为：3-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇和环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，其特征在于，采用通过型固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱联用的方法对板栗粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物进行含量检测。
3.根据权利要求2所述的快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：
(1)将样品置于提取液中进行震荡提取后离心得上清液；
(2)上清液置于净化柱中净化得滤液；
(3)滤液经氮气吹干后加水混匀后微孔过滤得待测样品；
(4)待测样品进行超高效液相色谱-串联质谱分析得出板栗粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物的含量。
4.根据权利要求3所述的快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述提取液为体积比为84：16的乙腈-水溶液，样品和提取液的质量体积比为2g：20mL，所述震荡提取具体为涡旋震荡20min，离心具体为8500rpm离心5min。
5.根据权利要求3所述的快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述净化柱的填料为C18、NH2、硅藻土和GCB中的一种或多种混合物，以重力自然流速使上清液通过净化柱。
6.根据权利要求4所述的快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，其特征在于，所述净化柱填料为质量比为16:30:10:30的C18、GCB、NH2、硅藻土混合物。
7.根据权利要求3所述的快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，氮气吹干在40℃条件下进行，所述混匀具体为超声30s后涡旋30s，所述微孔过滤为过0.22μm微孔滤膜。
8.根据权利要求3所述的快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体条件为：采用规格为100mm×2.1mm，1.7μm的Waters BEH C18色谱柱进行液相分离，柱温设置40℃，流速0.3mL/min，进样体积10μL，质谱基于电喷雾离子源，采用正/负离子多反应监测模式，离子源电压5.5/-4.5kV，源温度500℃，气帘气20psi，碰撞气7psi。
9.根据权利要求3所述的快速鉴别板栗粉中掺假小麦粉的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-串联质谱分析采用同位素内标法进行分析检测。
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