CN114487189B - 一种基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品安全检测技术领域,公开了一种基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,包括:制备黄曲霉毒素B1衍生溶液;称取一定量的待检测样品,并放置于离心管中;向所述离心管中加入乙腈、水、氯化钠,摇匀后进行离心;取全部乙腈层于新的离心管中,加入净化吸附材料、震荡、静置得到净化液;将所述净化液转移至新的具塞离心管中,吹干;加入乙腈水溶液复溶;加入制备的黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,反应、过滤反应液;将过滤好的反应液以及衍生的标准溶液利用高效液相色谱仪定量分析,得到检测结果。本发明提供了一种样品处理时间短、无需过固相萃取小柱净化、衍生稳定且高效的测定食品中黄曲霉毒素B1的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域,尤其涉及一种基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法。
背景技术
目前,黄曲霉毒素B1(AFB1)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物,含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮。黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1对包括人和若干动物具有强烈的毒性,其毒性作用主要是对肝脏的损害。在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见,危害性也最强,黄曲霉毒素B1的极性毒性是氰化钾的10倍,砒霜的68倍,慢性毒性可诱发癌变,致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍,比二甲基偶氨苯高900倍,人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关,黄曲霉严重威胁到人民的身体健康。
目前,检测黄曲霉毒素B1的方法有薄层色谱法法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、液相色谱串联质谱法。HPLC法是当前国内外使用的最权威的检测AFB1的方法,该方法测定准确,分辨率高,可同时测定多种黄曲霉成分,完成定性、定量的测定。但试验过程中样品提取纯化程序繁琐,实验过程耗时长,稳定性不好,回收率不高。因此建立一种简单,快捷,稳定,回收率高的样品前处理提取方法是很有必要的。
通过上述分析,现有技术存在的问题及缺陷为:现有的测定食品中黄曲霉毒素B1的方法样品提取纯化程序繁琐,实验过程耗时长,稳定性不好,灵敏度及回收率不高。
解决以上问题及缺陷的难度为
需要通过大量试验筛选出合适的净化吸附材料,用来去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物;找到合适的衍生溶液,增加荧光响应,且在衍生后不需要二次氮吹可以直接进样测定;通过实验筛选出黄曲霉毒素B1衍生的最佳温度及时间,以确保衍生效果最好。
解决以上问题及缺陷的意义为:使测定食品中黄曲霉毒素B1的方法中样品提取纯化程序简单化,不需要过固相萃取小柱,衍生稳定且荧光响应高,整个实验过程耗时短,稳定性好,回收率高。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法。
本发明是这样实现的,一种基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,所述基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法利用由PSA、C18组成的净化吸附材料快速测定食品中黄曲霉毒素B1。
进一步,所述净化吸附材料由PSA和C18按照质量比1:1至2:1组成。
进一步,所述基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法包括以下步骤:
步骤一,制备黄曲霉毒素B1衍生溶液,称取5.0g的待检测样品,并放置于50mL离心管中;
步骤二,向所述离心管中加入20mL乙腈、5mL水,置于涡旋振荡器中震荡10min,再加入5g的氯化钠,摇匀后进行离心;
步骤三,取全部乙腈层于新的离心管中,加入1-2g净化吸附材料,置于涡旋振荡器中震荡5min,静置,得到净化液;
步骤四,将所述净化液取10mL转移至新的具塞离心管中,吹干;加入乙腈水溶液复溶;
步骤五,加入700μL制备的黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,反应一段时间;过滤反应液;进行标准溶液的衍生;
步骤六,将过滤好的反应液以及衍生的标准溶液利用高效液相色谱仪定量分析,得到检测结果。
进一步,步骤一中,所述制备黄曲霉毒素B1衍生溶液包括:
量取2mL三氟乙酸,加入7mL水中,混匀后加入1mL冰乙酸,再加入200μL1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐,混匀。
进一步,步骤二中,所述离心包括:在8000r/min下离心5min。
进一步,步骤四中,所述吹干包括:于50℃下水浴氮气吹干。
进一步,所述乙腈水溶液由90%的乙腈与10%的水混合组成。
进一步,步骤五中,所述反应包括:于40℃下恒温水浴衍生反应30min。
进一步,步骤五中,所述过滤反应液包括:利用0.22μm微孔滤膜过滤反应液。
进一步,步骤五中,所述进行标准溶液的衍生包括:
将标准储备液用乙腈稀释配制成浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的标准系列,准确量取不同浓度的标准溶液于不同的具塞离心管中,50℃水浴氮气吹干,加入乙腈水溶液复溶,并加入黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,40℃下恒温水浴衍生反应30min后,利用0.22μm微孔滤膜过滤。
进一步,所述高效液相色谱仪定量分析包括:
C18色谱柱:250mm*4.6mm,粒径5μm;
流动相:乙腈+甲醇+水=20+10+70;
流速1mL/min;
激发波长360nm,发射波长440nm;
柱温30℃;进样体积20μL。
结合上述的所有技术方案,本发明所具备的优点及积极效果为:
利用分散萃取技术吸附净化杂质,无需过固相萃取小柱净化,而且净化材料也较便宜,既省时又省钱。
黄曲霉毒素B1衍生液衍生稳定,加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐使得荧光响应增加。
加入300μL复溶液,700μL衍生液,共1mL,衍生后不需要再次氮吹定容,可以直接进样。
本发明提供了一种样品处理时间短、无需过固相萃取小柱净化、衍生稳定且高效的快速测定食品中黄曲霉毒素B1的检测方法。
本发明通过分散萃取技术吸附净化样品,有效去除杂质,无需过固相萃取小柱,实现了样品处理时间短、衍生稳定且高效的快速测定食品中黄曲霉毒素B1的检测方法。
附图说明
图1是本发明实施例提供的快速测定食品中黄曲霉毒素B1的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的检测色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的快速测定食品中黄曲霉毒素B1的方法包括:
利用由PSA、C18组成的净化吸附材料快速测定食品中黄曲霉毒素B1。
本发明实施例提供的净化吸附材料由PSA和C18按照质量比1:1至2:1组成。
如图1所示,本发明实施例提供的快速测定食品中黄曲霉毒素B1的方法包括以下步骤:
S101,制备黄曲霉毒素B1衍生溶液;称取5.0g的待检测样品,并放置于50mL离心管中;
S102,向所述离心管中加入20mL乙腈、5mL水,置于涡旋振荡器中震荡10min,再加入5g的氯化钠,摇匀后在8000r/min下离心5min;
S103,取全部乙腈层于新的离心管中,加入1-2g净化吸附材料,置于涡旋振荡器中震荡5min,静置,得到净化液;
S104,将所述净化液取10mL转移至新的具塞离心管中,于50℃下水浴氮气吹干;加入300μL由90%的乙腈与10%的水混合组成的乙腈水溶液复溶;
S105,加入700μL制备的黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,于40℃下恒温水浴衍生反应30min;利用0.22μm微孔滤膜过滤反应液;进行标准溶液的衍生;
S106,将过滤好的反应液以及衍生的标准溶液利用高效液相色谱仪定量分析,得到检测结果。
本发明实施例提供的制备黄曲霉毒素B1衍生溶液包括:
量取2mL三氟乙酸,加入7mL水中,混匀后加入1mL冰乙酸,再加入200μL1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐,混匀。
本发明实施例提供的进行标准溶液的衍生包括:
将标准储备液用乙腈稀释配制成浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的标准系列,准确量取不同浓度的标准溶液于不同的具塞离心管中,50℃水浴氮气吹干,加入乙腈水溶液复溶,并加入黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,40℃下恒温水浴衍生反应30min后,利用0.22μm微孔滤膜过滤。
本发明实施例提供的高效液相色谱仪定量分析包括:
C18色谱柱:250mm*4.6mm,粒径5μm;
流动相:乙腈+甲醇+水=20+10+70;
流速1mL/min;
激发波长360nm,发射波长440nm;
柱温30℃;进样体积20μL。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1:
一、所选用的试剂:
1.黄曲霉毒素B1标准品溶液
2.乙腈、甲醇
3.PSA、C18(均为40-60μm)
4.三氟乙酸
5.冰乙酸
6.氯化钠
7.1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐
二、所使用的仪器
1.离心管,2.涡旋震荡器,3.离心机,4.恒温水浴锅,5.移液枪,6.C18色谱柱,7.高相液相色谱仪,8.百分之一的天平,9.0.22μm有机滤膜。
三、试验
(1)配置标准溶液:取0.1mL黄曲霉毒素B1标准储备液(10μg/mL),用乙腈定容至10mL,浓度为100ng/mL,然后用乙腈分别稀释成0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的标准系列溶液备用。
(2)前处理:称取5.00g样品(固体、液体样品均可)置于50mL离心管中,加入20mL乙腈,5mL水,置于涡旋振荡器中震荡10min,再加入5g氯化钠,摇匀5min,在8000r/min下离心5min;取全部乙腈层于50mL离心管中,加入1-2g净化吸附材料,置于涡旋振荡器中震荡5min,静置;准确量取10mL净化液于15mL具塞离心管中,50℃水浴氮气吹干,加入300μL乙腈-水溶液(90+10)复溶,然后加入700μL黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,40℃下恒温水浴衍生反应30min后,经0.22μm微孔滤膜过滤后,待测。
(3)将配置好的标准系列溶液50℃水浴氮气吹干,加入300μL乙腈-水溶液(90+10)复溶,然后加入700μL黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,40℃下恒温水浴衍生反应30min后,经0.22μm微孔滤膜过滤后,待测。
(4)将前处理好的样品用高效液相色谱仪定量分析,其中HPLC的条件为:C18色谱柱(250mm*4.6mm,粒径5μm);流动相为乙腈+甲醇+水=30+10+60;流速1mL/min;激发波长360nm,发射波长440nm;柱温30℃;进样体积20μL,得到黄曲霉毒素B1的液相色谱图(见图2)。
(5)将衍生好的不同浓度的标准品溶液用高效液相色谱仪分析检测,检测条件与待测样品溶液相同,得到标准系列溶液的黄曲霉毒素B1的液相色谱图,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标作图,得到标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数。
组分名称 | 线性范围 | 回归方程 | 相关系数 |
黄曲霉毒素B1 | 0.1-20ng/mL | Y=152677x+11275.2 | 0.9999 |
(6)根据待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的色谱峰,结合标准曲线,得到待测液中黄曲霉毒素B1的浓度C,并按以下公式计算得到食品中黄曲霉毒素B1的含量X,含量计算公式为:
其中X为待测液中黄曲霉毒素B1的含量,单位为μg/kg;C是待测液中黄曲霉毒素B1的浓度,单位为ng/mL;V1是提取液的体积,单位为mL;V2是净化完用于衍生的体积,单位是mL;V3是净化液的最终定容体积,单位是mL;m是待测样品的质量,单位是g。
(7)阴性杂粮样品加标:分别以0.1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg进行加标测定,对样品的黄曲霉毒素B1的检测结果如下:
(8)阴性油脂样品加标:分别以0.1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg进行加标测定,对样品的黄曲霉毒素B1的检测结果如下:
(9)阴性婴幼儿配方食品样品加标:分别以0.1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg进行加标测定,对样品的黄曲霉毒素B1的检测结果如下:
下面通过本发明快速测定方法与GB5009.22-2016第二法的测定方法进行比较,突出本发明在黄曲霉毒素B1的检测中的优越性。
1)实验耗时耗材对比:
国标GB5009.22-2016规定的方法对黄曲霉毒素B1的样品前处理的净化过程需要过固相萃取小柱,而且标准中净化样品所用的专用型固相萃取小柱价格较高。但是用本发明快速净化对样品进行前处理,耗时短而且不需要过固相萃取小柱,净化材料也较便宜。
2)衍生稳定且高效
按国标GB5009.22-2016规定的方法,用正己烷和三氟乙酸衍生,因正己烷易挥发,衍生后的峰面积不稳定而且还要氮吹后定容,而本发明中的衍生液是由水、三氟乙酸、冰乙酸和1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐组成,精确加入复容液和衍生液,衍生稳定且衍生后直接过滤膜测定,且加入的1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐可以增加荧光响应。
3)回收率对比:
按国标GB5009.22-2016规定的方法,由于过固相萃取小柱,最后的回收率在75%-86%之间,可见,用现有方法测定食品中黄曲霉毒素B1时,黄曲霉毒素B1的回收率不够稳定,这也是固相萃取柱的弊端。而本发明的回收率在87.6%-100.6%之间,可见本发明快速测定方法的回收率高。所以本快速测定方法完全利用高效的萃取技术,更稳定,更快捷。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于,所述测定食品中黄曲霉毒素B1的方法利用由PSA、C18组成的净化吸附材料测定食品中黄曲霉毒素B1;
所述测定食品中黄曲霉毒素B1的方法包括以下步骤:
步骤一,制备黄曲霉毒素B1衍生溶液,称取5.0g的待检测样品,并放置于50mL离心管中;
步骤二,向所述离心管中加入20mL乙腈、5mL水,置于涡旋振荡器中震荡10min,再加入5g的氯化钠,摇匀后进行离心;
步骤三,取全部乙腈层于新的离心管中,加入净化吸附材料1-2g,置于涡旋振荡器中震荡5min,静置,得到净化液;
步骤四,将所述净化液取10mL转移至新的具塞离心管中,于50℃下水浴氮气吹干;加入300μL乙腈水溶液复溶;
步骤五,加入制备的700μL黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,反应一段时间后;过滤反应液;进行标准溶液的衍生;
步骤六,将过滤好的反应液以及衍生的标准溶液利用高效液相色谱仪定量分析,得到检测结果;
步骤一中,所述制备黄曲霉毒素B1衍生溶液包括:
量取2mL三氟乙酸,加入7mL水中,混匀后加入1mL冰乙酸,再加入200μL 1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐,混匀;
C18色谱柱:250mm*4.6mm,粒径5μm;流动相:乙腈+甲醇+水=20+10+70。
2.如权利要求1所述基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于,所述净化吸附材料由PSA和C18按照质量比1:1至2:1之间组成。
3.如权利要求1所述基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于,步骤二中,所述离心包括:在8000r/min下离心5min。
4.如权利要求1所述基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于,所述乙腈水溶液由90%的乙腈与10%的水混合组成。
5.如权利要求1所述基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于,步骤五中,所述反应包括:于40℃下恒温水浴衍生反应30min。
6.如权利要求1所述基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于,步骤五中,所述过滤反应液包括:利用0.22μm微孔滤膜过滤反应液。
7.如权利要求1所述基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于,步骤五中,所述进行标准溶液的衍生包括:
将标准储备液用乙腈稀释配制成浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL、20 ng/mL的标准系列,准确量取不同浓度的标准溶液于不同的具塞离心管中,50℃水浴氮气吹干,加入300μL乙腈水溶液复溶,并加入700μL黄曲霉毒素B1衍生溶液,加塞混匀,40℃下恒温水浴衍生反应30min后,用0.22μm微孔滤膜过滤。
8.如权利要求1所述基于分散萃取技术测定食品中黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于,所述高效液相色谱仪定量分析包括:
流速1mL/min;激发波长360nm,发射波长440nm;柱温30℃;进样体积20μL。
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